Imunológia praktické cvičenie č. 1. bunky imunitného systému
Použité zdroje Buc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z imunológie, vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993, ISBN 80-88718-01-5 http://www.vpl.sk/zc/img/3_kossarova_imunodeficie ntne_stavy.pdf Bunky imunitného systému dostupné na https.ics.upjs.sk~paulikovaimufilestahajimu2.pdf
hematopoéza Bunky imunitného systému -rôzne dlhý čas života - úbytok je dopĺňaný hematopoézou Hematopoéza - formovanie a vývoj červených a bielych krviniek z kmeňovej pluripotentnej bunky -u dospelého jedinca prebieha najmä v kostnej dreni (medulárne) -základom hematopoézy je pluripotentná kmeňová bunka, ktorá sa diferencuje na lymfoidné a myeloidné kmeňové bunky
Hematopoéza -z kmeňových buniek vznikajú progenitorové bunky, ktoré sú nasmerované k diferenciácii na základné typy krvných buniek: Erytrocyty lymfocyty trombocyty monocyty Granulocyty -Hematopoéza je regulovaná najmä cytokínmi: IL-3 (multilineage-csf) GM-CSF M-CSF G-CSF erytropoetín IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8,IL-9
klasifikácia prítomnosť membránových znakov(rozpoznávacie glykoproteíny) na povrchu bunky CD (na všetkých leukocytoch) expresia receptorov na rozpoznávanie antigénov (len na T a B Ly) MHC antigény
Systém bunkových znakov CD znak (marker) CD = cluster of differentiation CD znak jedinečná molekula alebo komplex molekúl,ktoré bunka exprimuje Tieto molekuly pomáhajú diferencovať typ (subtyp) bunky, jej maturačné štádium, stupeň aktivácie... Názov pozostáva z písmen CD a číslic (napr.:cd3,cd8,...)
CD znaky CD3 len nat Ly (na všetkých subtypoch) CD4 TH CD8 TC CD19 len nab Ly CD64 monocyty CD66 PMNLs CD68 makrofágy CD16 NK bunky CD40 dendritické bunky CD33 všetkymyeloidné bb.
Polymorfonukleárne lekocytypmnl Viaclaločnaté jadro a granuly v cytoplazme Na základe rozdielneho farbenia granúl rozlišujeme 3 typy granulocytov: Neutrofily nefarbia sa ani bázickymi ani kyslými farbivami Eozinofily farbia sa kyslými farbivami na červeno Bazofily farbia sa bázickými farbivami na tmavomodro
neutrofily 60% z leukocytov (4,3 11x109/1lkrvi) Veľkosť: 15μm Nezrelé tyčka (tvar jadra) Zrelé segmentované jadro Vcytoplazme: -granuly s baktericídnymi látkami primárne (azúrofilné) obsahujú hydrolázy, myeloperoxidázu Sekundárne obsahujú laktoferín, lyzozým, alkalickú fosfatázu, kolagenázu... Glykogén zdroj glukózy pri anaeróbnej glykolýze PMNL môžu zostať v poškodenom tkanive s nízkym obsahom O2, napr. vmiestebakteriálnejinfekcie Bunková membrána: Receptory (Fc R pre IgG, CR), adhezívne molekuly (integríny, selektíny
neutrofily FUNKCIA: Základné bunky 1. obrannej línie proti patogénom, cudzorodým bb. Profesionálne fagocyty enzýmy sekundárnych granúl rozkladajú antigén (Ag) Dôležitá úloha v zápalovom procese (rýchla mobilizácia, uvoľnenie mediátorov zápalu)
eozinofily 4% zo všetkých PMNL 18 μm V cytoplazme: okolo 200 granúl hlavný bázický proteín (MBP), kyslá fosfatáza, arylsulfatáza, eozinofilná peroxidáza, kationický proteín eozinofilu -MBP pôsobí toxicky na parazity a nádorové bb., väzbou na bazofilné bb. z nich uvoľňuje histamín Na membráne: - receptory pre IgE a zložky komplementu - dôležitá úloha pri alergických reakciách FUNKCIA: proti parazitárnym infekciám (hlavne proti helmintom v črevnom trakte) proti nádorovým bunkám Účasť pri zápalových reakciách ( sú aktivované lymfocytmi) alergické reakcie schopnosť fagocytózy
bazofily <0.2% z Leu Morfologicky sa podobajú tkanivovým mastocytom, ochrana mukóznych povrchov tela Cytoplazma: Granuly veľké množstvo zápalových mediátorov (heparín,histamín...); Neobsahujú peroxidázu Membrána: Receptory FcRε (pre IgE) FUNKCIA: -alergické reakcie -nefagocytujú
mastocyty Tkanivové bunky 30μm Mononukleárne bunky s metachromaticky zafarbenýmig ranulami Relatívne maléj adro - v spojivovom tkanive, hlavne pri krvných, lymfatických cievach a pri periférnych nervoch - blízko epitelových povrchov(dýchací, tráviaci systém a koža) Cytoplazma: granuly : zápalové mediátory (heparín,histamín...), neobsahujú peroxidázu Membrána: -receptory FcRε (preige) Funkcia : hlavné bunky pri alergických reakciách
Mastocyty
monocyty 6-8% mononukleárne bb. Okrúhly tvar, veľa cytoplazmy, veľké, excentricky uložené jadro Cytoplazma : vakuolizovaná, farbí sa slabo bazofilne (sivo-fialovo). (Monocytóza so zvýšením množstva leukocytov je aj priaznivým symptómom pri septických procesoch a infekčných ochoreniach) FUNKCIA: Profesionálne fagocyty APC *Zrelé monocyty putujú z kostnej drene do krvi, kde zostávajú cca15-30 hodín Potom adherujú na cievny endotel a opúšťajú krvné riečište diapedézou, premiestňujú sa do tkanív, kde sa premieňajú na makrofágy.
Monocyty
Antigén prezentujúce bunky = APC(Antigen Presenting Cells) DENDRITICKÉ BUNKY (DC) MAKROFÁGY B -LYMFOCYTY FUNKCIA: vychytanie Ag spracovanie Ag prezentácia Ag peptidov špecifickým T -Ly
makrofágy Determinačné povrchové znaky: CD54, CD68, MHC, Fc receptory, C receptory Monocyt z krvi prechod do tkaniva premena na makrofág mononukleárne fagocyty dĺžka života 75 dní antigén prezentujúce bb. = APC Tkanivové makrofágy 1. obranná línia hostiteľa VÝSKYT:- Alveolárne v pľúcach Kupfferove bb. v pečeni histiocyty v spojivovom tkanive mikroglia v CNS osteoklasty v kostiach peritoneálne a pleurálne v seróznych dutinách Intravaskulárne v endoteli kapilár
makrofágy FUNKCIE: Schopnosť rozpoznať, vychytať, spracovať a prezentovať antigén fagocytóza Expresia MHC molekúl II. triedy Produkcia imunoregulačných látok Schopnosť odovzdávať nešpecifické stimulačné signály Produkcia reaktívnych molekúl
Dendritické bunky DC v nelymfatických periférnych tkanivách Langerhansove bb.(koža, dlaždicový epitel ústnej dutiny, pažeráku a pošvy) intersticiálne DC (srdce, obličky) v cirkulácii : DC v periférnej krvi (0,4 %) závojnaté bb.(aferentné lymfatické cievy) v sekundárnych lymfatických tkanivách : vmedzerené DC v medule týmusu týmusové DC
Dendritické bunky (DC) FUNKCIA: najvýkonnejšie APC schopnosť aktivovať naivné T Ly fagocytóza (častice a mikróby) makropinocytóza (solubilné Ag) Závojnatá DC + Ly
lymfocyty Ly : malý, stredný, veľký Malý 8-12μm. Jadro: - okrúhle alebo oválne tvorené masami chromatínu Cytoplazma: - úzky lem, svetlomodrá T lymfocyty (65 75%) B lymfocyty(20 30%)
lymfocyty
lymfocyty Lymfocyty - vyvíjajú sa z hematopoetickej kmeňovej bunky v kostnej dreni T lymfocyty migrujú do thymusu, B lymfocyty zostávajú v kostnej dreni B lymfocyty - zodpovedné za humorálnu časť (Ab) T lymfocyty - celulárna časť imunitnej reakcie
B-lymfocyty: produkujú a secernujú Ab do telesných tekutín, zastupujú preto humorálnu imunitu T-lymfocyty: reagujú priamo s cieľovými bunkami (napr. ktoré boli napadnuté vírusmi alebo tumorózne zvrhnuté), preto reprezentujú bunkovú imunitu Obidve populácie majú na svojom povrchu odlišné glykoproteíny, ktoré môžu byť dokázané pomocou monoklonálnych protilátok
T lymfocyty TH(helpery) CD4: - Regulujú humorálne aj bunkami sprostredkované imunitné odpovede pomáhajú TS(supresory) CD8 : - Môžu potláčať imunitnú odpoveď TC(cytotoxické) CD8: - Efektorové bb. S cytolytickým účinkom - TDH(delayed-type hypersensitivity reaction)- - sprostredkujúoneskorenýtyphypersenzitivity TH a TS majú odlišné vlastnéa ntigény, podľa ktorých sa identifikujú
T lymfocyty Dozrievanie v týmuse je sprevádzané identifikáciou provrchových označení CD (cluster of differentiation diferenciačných antigénov) CD3- prenášač signálu z antigénneho receptoru do vnútra bb, vedie k aktivácii b CD4, CD8 prítomné pôvodne u spolu všetkých ly, umožňujú rozdeliť T-lymf. CD4 - prítomný u T helper bb, komunikuje s molekulami HLA II CD8 - prítomný u cytotoxických buniek, komunikuje s molekulami HLA I
Špecifická imunita sprostredkovaná bunkami T bunky - po stimulácii sa stávajú efektorovými bunkami (priamo napádajú a eliminujú bb napadnuté vírusmi alebo tumorózne zmenené) - riadia spoluprácu rôznych imunitných bb (syntetizujú molekuly, ktoré pomáhajú iným bunkám zničiť patogéna)
B lymfocyty B-bb dozrievajú v prostredí kostnej drene Zrelé B-lymf nesú na svojom povrchu molekuly imunoglobulínov, ktoré slúžia ako špecifický receptor pre antigén. V prítomnosti Ag (týmusindependentné Ag) alebo aj v spolupráci s T-lymf (týmusdependentné Ag) sa menia B-lymf na plazmatické bunky, ktoré produkujú veľké množstvo špecifických Ab
Plazmatické bunky
NK bunky CD16, CD56,CD57 5 15%, slezina Nulové bb.=non B,non T Majú Fc receptory Bunková zložka vrodenej imunity Funkcie: -lýza nádorových a vírusom infikovaných bb. (nešpecifická cytotoxicita bez predchádzajúcej senzibilizácie) - produkcia cytokínov zapájajúcich sa do regulácie iných procesov - rozpoznávajú cieľové bb. bez MHC restrikcie - IL-2; IFN zvyšujú proliferáciu a cytotoxickú aktivitu NK cytopl. Granuly obsahujú perforín, serínovú esterázu
Izolácia mononukleových bb Z periférnej krvi Za fyziol podm. : z 1 ml krvi...1-2x 10 6 mononukl. bb.(lymfocyty a monocyty v pomere 80% : 10%) CIEĽ : oddelenie ery a granulocytov METÓDA: diskontinuálna gradientová centrifugácia POSTUP: krv +heparín (konc. 10j./1 ml krvi) -premiešať + fyziol.roztok (1:1) - do skúmavky s 5 ml zriedenej krvi navrstviť 2,5 ml separačného roztoku (verografín) - 20 min. centrifugácia
Izolácia mononukleových bb VÝSLEDOK : po centrifugácii sa nad separačným roztokom utvorí belavý prstenec mononukleových bb., ktoré odsajeme pipetou Získané bb. centrifugujeme Sediment 2x premyjeme vo fyziolog. roztoku bb. spočítame v Bürkerovej komôrke (1x10 6 )
Separácia T ab lymf. Na základe tvorby roziet T a B lymf. : rôzne membránové receptory pre väzbu s ery iných živočíšnych druhov T lymf. : receptor pre baranie ery tvorba E-roziet B lymf. : receptor pre myšie ery tvorba M-roziet Ery sa opracúvajú chemicky (neuraminidázou) pevnejšia väzba s lymf.
Separácia T ab lymf. Na základe tvorby roziet POSTUP: Suspenzia mononukleových bb. + premyté a resuspendované baranie ery (1:1), centrifugácia Inkubácia 30 min. pri 4 C, navrstvenie separačného roztoku (verografín), centrifugácia CIEĽ : nad separač. roztokom ostanú nerozetujúce bb.(odsatie) Rozetujúce bb. Sedimentujú na dno skúmavky VÝSLEDOK: Získanie suspenzie lymfocytov (T lymf.- E-rozety) (95% čistota)
Rozetové testy Aktívne rozety vyššia avidita receptorov pre baranie ery (aj pri ich malom počte) Celkové rozety po 18 24 hod inkubácii pri nadbytku ery. Aktívne rozety lepšie odrážajú imunitný stav pacienta
Rozetové testy POSTUP : - 5ml krvi do heparínu izolácia lymfocytov - Pridať suspenziu ovčích ery ( pre aktívne rozety v c 0,2%, pre celkové rozety 0,1%) - Pri stanovení celkových roziet na 24 hod do ľadu CIEĽ : - počítanie lymfocytov a roziet v Bürkerovej komôrke VÝSLEDOK : - Rozeta : lymf. + najmenej 3 ery - Aktívne r. : 25 +/- 10% - Celkové r. : 65 +/- 10%
Pod mikroskopom počítame počiet roziet a čistých lymfocytov do 100, počet roziet udáva % počet B alebo T lymfocytov Lymfocyt rozety Morč.ery