Vnútrobunková distribúcia γ-aminomaslovej kyseliny (GABA) a iných aminokyselín v mycéliu Trichoderma atroviride

Prepis

1 Vnútrobunková distribúcia γ aminomaslovej kyseliny (GABA) a iných aminokyselín v mycéliu Trichoderma atroviride Molnár Tomáš, Varečka Ľudovít, Šimkovič Martin Oddelenie biochémie a mikrobiológie, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, Slovenská Technická Univerzita v Bratislave

2 Úvod GABA bola prvýkrát identifikovaná v pletivách rastlín Vzniká vo všetkých organizmoch dekarboxyláciou kyseliny glutámovej Degradácia (GABA skrat) súbor niekoľkých reakcií, výsledným produktom je jantáran: NADH + H + SSA dehydrogenáza NAD + jantáran Krebsov cyklus CO 2 NH 3 NADH + H + glutamát dehydrogenáza NAD + 2-oxoglutarát sukcinát glutamát semialdehyd H + aminokyselina aminotransferáza 2-oxo AMK alanín GABA transamináza pyrohroznan GABA CO 2 glutamát dekarboxyláza V živočíchoch je súčasťou centrálneho nervového systému Význam v rastlinách pri stresových podmienkach a pri komunikácii s mikroorganizmami V kvasinkách metabolizmus GABA pravdepodobne súvisí s prežitím stresu

3 GABA a jej úloha vo fyziologických procesoch T. atroviride Vo vláknitej hube T. atroviride bola dokázaná prítomnosť glutamát dekarboxylázy (GAD) Aktivita GAD závisí od veku mycélia Vo vláknitých hubách sa pozoroval nárast koncentrácie GABA počas klíčenia Koncentrácia GABA v mycéliu môže dosiahnuť hodnoty mmol/l, ktorá je pre signálne molekuly veľmi neobvyklá

4 Ciele práce Zistiť distribúciu GABA a ostatných aminokyselín v organelách konídií a mycélia počas rastu Stanoviť koncentráciu GABA a ostatných aminokyselín v týchto organelách

5 Pracovný postup Homogenizácia konídií a rôzne starého mycélia s balotinou (s priemerom 0,3 mm) Subcelulárna frakcionácia pomocou diferenciálnej centrifugácie Verifikácia čistoty získaných membránových frakcií meraním aktivity markerových enzýmov (spektrofotometrické merania založené na chromogénnych substrátoch) Identifikácia aminokyselín v jednotlivých membránových frakciách tenkovrstvovou chromatografiou (TLC) Kvantifikácia identifikovaných aminokyselín

6 Výsledky Homogenizácia konídií a mycélia, charakterizácia membránových frakcií

7 Homogenizovaný bunkový materiál sa diferenciálnou centrifugáciou rozdelil na nasledovné membránové frakcie: MV mitochondriálno vakuolárna frakcia (sedimentovaná pri x g), MI mikrozomálna frakcia (sedimentovaná pri x g) a SUP cytosolická frakcia (reprezentuje supernatant získaný pri x g) Meraním aktivity markerových enzýmov (laktát dehydrogenáza (LDH): cytoplazma, α manozidáza: vakuoly, NADPH:cytochróm C oxidoreduktáza: endoplazmatické retikulum, H + ATPáza: cytoplazmatická membrána) sa overila čistota subcelulárnych membránových frakcií Majoritné membránové frakcie obsahovali charakteristické markerové enzýmy, súčasne sa v nich však zaznamenala aj nízka aktivita markerových enzýmov iných frakcií

8 Aktivita markerových enzýmov nameraná v membránových frakciách izolovaných z trojdňového submerzného mycélia T. atroviride CH celkový homogenát MV mitochondriálno vakuolárna frakcia MI mikrozomálna frakcia SUP cytosolická frakcia

9 α manozidáza sa detegovala predovšetkým v mitochondriálnovakuolárnej frakcii (MV), stopová aktivita sa však namerala aj v mikrozomálnej a v cytosolickej frakcii pravdepodobne ako dôsledok rozbitia určitého množstva vakuol počas homogenizácii, rozbité vakuoly nesedimentujú pri x g Prítomnosť mikrozomálnych markerových enzýmov sa okrem mikrozómov našla aj v cytosolickej frakcii, získanej centrifugáciou pri x g; pravdepodobne ako dôsledok porušenia celistvosti mikrozomálnych membránových váčkov alebo nedostatočnej sedimentácii membrán ER izolovaných z mladšieho mycélia T. atroviride na dne skúmavky (malá časť zostáva v supernatante) H + ATPázová a cytochróm C reduktázová aktivita sa namerala aj v iných frakciách, ako v cytoplazme a mitochondriách pravdepodobne ako dôsledok neúplnej inhibícii interferujúcich enzýmov, ktoré využívajú rovnaké substráty ako markerové enzýmy

10 Zmeny aktivity markerových enzýmov v priebehu vývoja T. atroviride Závislosť enzýmovej aktivity LDH od veku mycélia Závislosť enzýmovej aktivity α D manozidázy od veku mycélia Analyzovali sa nasledovné membránové frakcie: CH celkový homogenát, MVmitochondriálno vakuolárna frakcia, MI mikrozomálna frakcia, SUP cytosolická frakcia

11 Závislosť enzýmovej aktivity plazmatickej H + ATPázy od veku mycélia Závislosť enzýmovej aktivity NADPH cytochróm C oxidázy od veku mycélia Analyzovali sa nasledovné membránové frakcie: CH celkový homogenát, MV mitochondriálnovakuolárna frakcia, MI mikrozomálna frakcia, SUP cytosolická frakcia

12 Identifikácia a kvantifikácia aminokyselín v membránových frakciách pomocou TLC TLC analýza extraktov z trojdňového mycélia a štandardmi 1 mitochondriálno vakuolárna frakcia, 2 mikrozomálna frakcia, x g supernatant (cytosolická frakcia), 4 GABA, 5 Glu, 6 Gly, 7 Lys, 8 Gln, 9 Ala,

13 Zhrnutie výsledkov z TLC analýzy MV mitochondriálno vakuolárna frakcia, MI mikrozomálna frakcia, SUP cytosolická frakcia + AK prítomná vo frakcii, AK neprítomná vo frakcii

14 Vývojové zmeny ovplyvňujú hladinu GABA a kyseliny glutámovej v T. atroviride Závislosť koncentrácie GABA v subcelulárnych frakciách od veku mycélia Závislosť koncentrácie kyseliny glutámovej v subcelulárnych frakciách od veku mycélia

15 GABA je prítomná predovšetkým v mycéliu, avšak počas vývoja sa jej koncentrácia v mycéliu mení Prítomnosť GABA sa detegovala aj v konídiách, ale jej koncentrácia je oveľa nižšia ako v 1 dňovom mycéliu. Tieto výsledky naznačujú, že počas klíčenia konídií sa spustí syntéza GABA, čomu nasvedčuje aj zmena koncentrácie kyseliny glutámovej Je pravdepodobné, že kyselina glutámová sa počas klíčenia metabolizuje za vzniku GABA, podobne ako u Neurospora crassa (Hao R, Schmit JC, Biochem. J., 1993) So starnutím mycélia koncentrácia GABA klesá, ale v desaťdňovom mycéliu sa opäť pozoroval nárast, čo môže súvisieť so zmenami kultivačných podmienok. Po dlhodobej kultivácie sa u T. atroviride mení ph kultivačného média. U kvasiniek GABA súvisí s reguláciou ph (Coleman ST a spol, J. Biol. Chem., 2001 ), je možné, že podobnú funkciu má GABA aj u T. atroviride

16 Prítomnosť GABA v mikrozomálnej frakcii, môže súvisieť tým, že jej metabolizmus prebieha na niektorej organele Aktivita dekarboxylázy glutamátu, meraná Strigáčovou a spol. (2001), sa nachádza v porovnateľných hodnotách vo vakuolárno mitochondriálnej aj v mikrozomálnej frakcii homogenátu T. atroviride V mitochondriálno vakuolárnej frakcii však GABA nebola prítomná. Vysvetlením môže byť: počas homogenizácie sú mitochondrie rozbité a GABA je uvoľnená do supernatantu GABA je hneď metabolizovaná za vzniku kyseliny jantárovej, ktorá vstúpi do Krebsovho cyklu

17 Závislosť koncentrácie ostatných detegovaných aminokyselín v mikrozomálnej frakcii od veku mycélia Závislosť koncentrácie ostatných detegovaných aminokyselín v cytosolovej frakcii od veku mycélia

18

19 V mikrozomálnej frakcii sú prítomné rovnaké AK ako v supernatante po centrifugácii pri x g, okrem kyseliny asparágovej, ktorá v mikrozomálnej frakcii nebola identifikovaná V mitochondriálno vakuolárnej frakcii neboli identifikované žiadne AK. Dala by sa očakávať prítomnosť viacerých AK kvôli proteosyntetickej aktivite, ktorá prebieha v mitochondriách. Dôvod: AK sú transportované do mitochondrií, kde sú ihneď zabudované do polypeptidového reťazca alebo počas homogenizácii dôjde k uvoľneniu AK z mitochondrií do supernatantu

20 Pozorovali sa výrazné rozdiely v kvantitatívnom zastúpení AK, Dôvod: 1. Podobné R f faktory pre viaceré AK jedna škvrna obsahuje viac AK nepresné stanovenie koncentrácie 2. Niektoré AK majú aj iné zatiaľ neznáme funkcie ako len stavebné jednotky bielkovín Koncentrácia jednotlivých AK je závislá na veku mycélia Koncentrácia Asp, Leu, Val, Ala klesala so stúpajúcim vekom mycélia, ale v desaťdňovom mycéliu sa pozoroval nárast dôvod: po dlhodobej kultivácii nastáva lýza odumretých buniek a z nich uvoľnené AK sú prijaté živými bunkami S tým nie sú v súlade zmeny koncentrácie Gln a Gly ich koncentrácia klesala (keby AK boli prijaté z odumretých buniek, ich koncentrácia v desaťdňovom mycéliu by tiež narástla) možné vysvetlenie: tieto AK sú po vstupe do bunky hneď metabolizované alebo majú zatiaľ neznámu funkciu

21 Zhrnutie najdôležitejších pozorovaní GABA je prítomná predovšetkým v mycéliu T. atroviride, kým jej zastúpenie v konídiách je minimálne koncentrácia GABA sa počas vývoja mycélia mení, najvyššia hladina je nameraná v počiatočných vývojových fázach rastu, zatiaľ čo počas stárnutia koncentrácia GABA klesá analýza vnútrobunkovej distribúcie GABA ukazuje, že koncentrácia GABA vo vnútrobunkových membránových frakciách je najvyššia v mikrozomálnej frakcie a cytosole okrem GABA bolo v mycéliu T.atroviride identifikovaných ďalších sedem AMK (Ala, Asp, Glu, Gln, Gly, Leu a Val) všetky aminokyseliny, s výnimkou Asp, boli prítomné v konídiách a aj v mycéliu, zatiaľ čo Glu je prevažne zastúpená v konídiách pozorovania indikujú, že majoritnou úlohou Glu je byť substrátom na syntézu GABA.

22 Poďakovanie Táto práca bola podporená grantovou agentúrou APVV (APVV ).

23 Ďakujem za pozornosť