VPLYV VÝLUHU LISTOV ANNONA MURICATA V DMEM NA KINETIKU PROLIFERÁCIE BUNKOVEJ LÍNIE HT-29 Iveta Gašparová 1, Zuzana Varchulová Nováková 1, Lenka Oravcová 1, Ľuboš Danišovič 1, Daniel Böhmer 1 1 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LFUK a UNB, Sasinkova 4, 811 08 Bratislava, Slovenská republika ivetagasparova@gmail.com
ÚVOD Úspešnosť liečby onkologických ochorení ostáva napriek pokrokom v medicíne a množstvu novo vyvinutých chemoterapeutík neuspokojivá. Je preto dôležité hľadať nové spôsoby terapie a skúmať látky s možným využitím v terapii onkologických ochorení. Viacero rôznych látok s antiproliferatívnym účinkom na rakovinové bunky už bolo objavených v rastlinách používaných v alternatívnej medicíne a fytoterapii. Napr. antikancerogénne účinky viacerých čínskych liečivých rastlín in vitro 2,3 antiproliferačný a proapoptotický účinok extraktu z listov Olea europaea na líniu buniek rakoviny hrubého čreva 4 protinádorový efekt germakrónu, bioaktívnej látky extrahovanej z Rhizoma curcuma na bunky ľudského hepatómu 5 Obr. 1
Annona muricata (anona mäkkoostnatá, graviola, soursop) rastlina z čeľade anonovité rastie v Ázii, Oceánii, Strednej a Južnej Amerike, Afrike listy a semená sú tradičnom liečiteľstve používané ako prostriedky proti parazitom, vysokému krvnému tlaku a rakovine Obr. 2 Annonacenové acetogeníny látky extrahované zo semien a listov Annona muricata antiproliferačné účinky na vybrané rakovinové bunkové línie. 6,7
CIELE EXPERIMENTU študovať vplyv výluhu listov Annona muricata v DMEM (štandardné kultivačné médium) na bunkovú líniu adenokarcinómu hrubého čreva (HT-29) po aplikácii rôznych koncentrácií výluhu sledovať zmeny proliferácie buniek indukciu apoptózy Materiál a metódy Usušené listy Annona muricata sme rozdrvili a lúhovali v DMEM pri teplote 80 C počas 20 minút. Zriedením s DMEM sme z výluhu vytvorili 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% a 1,5625% roztoky. Roztoky sme nechali pôsobiť počas 72 hodín na bunkovú líniu HT-29. Obr. 3 Pomocou testov cytotoxicity MTT a WST-1 (kolorimetrické testy založené na princípe rozloženia pridaného farbiva mitochondriálnymi enzýmami živých buniek) a testu apoptózy Muse Annexin V and Dead Cell Assay (fluorescenčná detekcia fosfatidylserínu na povrchu apoptotických buniek v prietokovom cytometri) sme zmerali hodnoty proliferácie a apoptózy buniek.
% buniek Proliferácia (%) VÝSLEDKY MTT HT-29 72h WST-1 HT-29 72h 120 100 80 60 40 20 0 K 100 50 20 12 6 3 1 Koncentrácia (%) HT- 29 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 K 100 50 25 12 6 3 1 Koncentrácia (%) HT- 29 Zmeny proliferácie buniek HT-29 vystavených pôsobeniu rôznych koncentrácií výluhu listov Annona muricata v DMEM počas 72 hodín merané pomocou MTT Cell Proliferation Assay Zmeny proliferácie buniek HT-29 vystavených pôsobeniu rôznych koncentrácií výluhu listov Annona muricata v DMEM počas 72 hodín merané pomocou Cell Proliferation Reagent WST-1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Apoptóza HT-29 72h Živé Skorá apoptóza Neskorá apoptóza Celková apoptóza Zmeny apoptózy buniek HT-29 vystavených pôsobeniu rôznych koncentrácií výluhu listov Annona muricata v DMEM počas 72 hodín merané pomocou Muse Annexin V and Dead Cell Assay Koncentrácia (%)
ZÁVER Roztok vytvorený vyluhovaním listov rastliny Annona muricata v DMEM pri 80 C počas 20 minút mal značný vplyv na proliferáciu a indukciu apoptózy v bunkovej línii HT-29. Čím menšie riedenie výluhu bolo použité, tým väčší vplyv na proliferáciu buniek sme pozorovali. Z výsledkov usudzujeme, že látky prítomné v listoch tejto rastliny indukujú apoptózu a znižujú proliferáciu v použitej bunkovej línii. Do budúcnosti navrhujeme zopakovať experiment s použitím metanolového extraktu. Taktiež plánujeme uskutočniť chemickú analýzu použitého extraktu. Listy tejto rastliny majú podľa našich meraní antiproliferatívne účinky na bunky adenokarcinómu hrubého čreva a mohli by byť použité pri vývoji nových chemoterapeutík. Zoznam použitej literatúry: 1. Shoemaker, M., Hamilton, B., Dairkee, S. H., Cohen, I. and Campbell, M. J. (2005), In vitro anticancer activity of twelve Chinese medicinal herbs. Phytotherapy Research, 19: 649 651. doi: 10.1002/ptr.1702 2. Lee, S. M. Y., Li, M. L. Y., Tse, Y. C., Leung, S. C. L., Lee, M. M. S., Tsui, S. K. W.,... & Waye, M. M. Y. (2002). < i> Paeoniae Radix</i>, a Chinese herbal extract, inhibit hepatoma cells growth by inducing apoptosis in a p53 independent pathway. Life sciences, 71(19), 2267-2277. 3. Reyes F, Centelles J, Lupianez J, Cascante M (2006), (2a, 3b)-2, 3-Dihydroxyolean-12-en-28-oic acid, a new natural triterpene from Olea europea, induces caspase dependent apoptosis selectively in colon adenocarcinoma cells. FEBS Lett 580:6302 6310. 4. Liu Y., Wang W., Fang B., Ma F., Zheng Q., Deng P., Zhao S., Chen M., Yang G., He G. (2013). Anti-tumor effect of germacrone on human hepatoma cell lines through inducing G2/M cell cycle arrest and promoting apoptosis. European Journal of Pharmacology 698(1-3), 95-102. 5. George, V. C., Kumar, D. N., Rajkumar, V., Suresh, P. K., & Ashok, R. (2012). Quantitative assessment of the relative antineoplastic potential of the n-butanolic leaf extract of Annona muricata Linn. in normal and immortalized human cell lines. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 13(2), 699-704. 6. Wu, F. E., Gu, Z. M., Zeng, L., Zhao, G. X., Zhang, Y., McLaughlin, J. L., & Sastrodihardjo, S. (1995). Two New Cytotoxic Monotetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins, Annomuricins A and B, from the Leaves of Annona muricata. Journal of Natural Products, 58 (6), 830-836. Obrázky: Obr. 1 HT-29 In: [online]. [cit. 2015-04-22]. Dostupné z: http://chagalab.com/data/cheditor4/1207/qh2h9zzym.jpg Obr. 2 Annona muricata leaves In: [online]. [cit. 2015-04-22]. Dostupné z: http://1.bp.blogspot.com/-7bwzdhleov0/uqckzeqzbdi/aaaaaaaaams/uzjtwxbb0po/s1600/daun+sirsak.jpg Obr. 3 Blanco F M (1880). Flora de Filipinas. Gran edicion. [Atlas I]