Microsoft PowerPoint - DOK-prezentacia-Valachova

Prepis

1 Výskum vybraných mikrobiálnych metabolitov s protinádorovým účinkom (Dizertačná práca) Doktorand: Školiteľ: Konzultant: RNDr. Martina Valachová Doc. Ing. Mária Šturdíková, PhD. Ing. Marta Múčková, CSc. Výskumný ústav liečiv a.s. Modra Fakulta chemickej a potravinárskej technológie STU, Bratislava Klinikum Rechts der Isar, Mníchov, Nemecko Max Planck Institute für Biochemie, Mníchov, Nemecko

2 Onkologické ochorenia sú v súčasnosti na druhom mieste v chorobnosti a úmrtnosti, hneď za skupinou kardiovaskulárnych chorôb Počet nádorových ochorení sa celosvetovo zvyšuje, za jeden rok je diagnostikovaných približne milión nových prípadov Spôsoby získavania nových protinádorových liečiv Chemická syntéza Prírodné zdroje: Rastliny Mikroorganizmy Morské organizmy Prečo prírodné látky??? Nové chemické štruktúry Nižšia toxicita Väčšia selektivita

3 Perspektívny zdroj nových protinádorových látok predstavujú endofytické mikroorganizmy asociované s vyššími rastlinami vyskytujú sa vo všetkých, resp. takmer všetkých rastlinách stromoch, bylinách, kvitnúcich rastlinách väčšina z endofytických húb patrí medzi rody Ascomycetes a Fungi imperfecti ich biochemické procesy sú podobné s hostiteľským organizmom a tieto mikroorganizmy môžu produkovať rovnaké, resp. podobné látky ako hostiteľská rastlina to poukazuje na reálnu možnosť riešiť produkciu niektorých biologicky aktívnych sekundárnych metabolitov rastlín biotechnologickými metódami

4 Protinádorové metabolity endofytických mikroorganizmov Metabolit Mechanizmus účinku Produkčný kmeň Hostiteľská rastlina Taxol Antimitotický účinok Taxomyces andreanae Periconia sp. Pestalotiopsis microspora Erwinia (baktéria) Taxus brevifolia Torreya grandifolia Taxus wallichiana Taxus canadensis saintopin UCE1022 Inhibítory topoizomerázy II Paecilomyces sp. Taxus mairei a Torreya grandis Brefeldín A Indukcia apoptózy Paecilomyces sp. Torreya grandis Cytoskyrín A Inhibícia syntézy DNA Cytospora sp. Conocarpus erecta Hormonemát Indukcia apoptózy Hormonema dematioides Pinus sp. Cytochalazíny Antimitotický účinok Rhinocladiella sp. Triptergium wilfordii

5 prekurzory prekurzory 6merkaptopurín purínové bázy pyrimidínové bázy ribonukleozidy metotrexát daktinomycín doxorubicín mitramycín Lasparagináza steroidné hormóny ribonukleozidy deoxyribonukleozidy DNA RNA bielkoviny Cytarabín hydroxyurea bleomycín alkylačné činidlá prokarbazín vinca alkaloidy kolchicín taxol mikrotubuly

6 Zaujímavé terče v terapii nádorov predstavujú proteinázy inhibítory Proces metastázovania nádorových buniek, kľúčová úloha proteolytických enzýmov pri lýze proteínových bariér primárny nádor Lýtický a deštrukčný potenciál transformovaných buniek cez aktiváciu metaloproteinázy transformované bunky majú schopnosť prenikať cez ECM a membrány neaktívne metaloproteinázy cieva katepsín B, H, L, O, S (cysteínové proteinázy) upa, tpa (serínové proteinázy) katepsín D, E (aspart. proteinázy) metastázy Kalikreíny nové ciele v terapii nádorových ochorení hk4 aktivácia proupa hk7 degradácia ECM aktívne metaloproteinázy

7 Zámer dizertačnej práce: Vyhľadávanie nových prírodných cytotoxických látok produkovaných endofytickými mikroorganizmami ako aj inhibítorov proteináz zodpovedných za proces metastázovania Ciele: Izolácia endofytických mikroorganizmov z rastlín, ktoré sú známe produkciou biologicky aktívnych látok Hodnotenie cytotoxickej aktivity extraktov z izolovaných endofytov na nádorových bunkových líniách in vitro Hodnotenie cytotoxickej aktivity extraktov in vivo Hodnotenie antiproteinázovej aktivity extraktov na urokinázu rekombinantné kalikreíny Izolácia cytotoxických metabolitov Sledovanie prítomnosti známych bioaktívnych látok v extraktoch

8 Hodnotenie cytotoxickej aktivity extraktov in vitro MTT test patrí medzi základné skríningové in vitro testy cytotoxicity Princíp: redukcia rozpustnej žltej MTTtetrazóliovej soli na modrofialový nerozpustný MTTformazánový produkt pomocou mitochondriálnej dehydrogenázy vitálnych buniek Bunkové línie: Nádorové bunkové línie B16 (myší kožný melanóm) HT29 (ľudský adenokarcinóm kolorekta) HL60 (ľudské leukemické bunky) BT20 (ľudské nádorové bunky prsníka) In vivo model: B16 myší kožný melanóm Nenádorové bunkové línie V79/4 (škrečie pľúcne bunky) BHK21 (škrečie obličkové bunky) Hodnotenie cytotoxickej aktivity extraktov in vivo Sledované parametre: 1. Objem nádoru u myší v 16. a 24. deň po aplikácií buniek B16 2. Hmotnosť nádoru po excízii na 24.deň po aplikácii nádorových buniek B16

9 Izolácia cytotoxických metabolitov/metabolitu Extrakt z endofytu, ktorý in vitro preukázal najvyššiu cytotoxickú aktivitu na bunkovej línii B16 bol frakcionovaný s cieľom izolácie (charakterizácie) cytotoxických metabolitov/metabolitu Použité metódy: 1. Chromatografia na stĺpci silikagélu 2. Tenkovrstvová chromatografia (TLC) Sledovanie prítomnosti známych bioaktívnych látok v extraktoch endofytických mikroorganizmov Sledovaná prítomnosť: 1. Bilobalidu 2. Flavonoidov Použité metódy: 1. Tenkovrstvová chromatografia (TLC) 2. LCMS

10 odnotenie antiproteinázovej aktivity extraktov endofytických MO Celkový počet izolovaných endofytov: 227 endofytických MO z 28 rastlín Testovací systém Enzým Trypsín Trombín Urokináza Výsledná c enzýmu mg/ml (3 BAEE units) 150 NIH units/mg 0.05 mg/ml (500 Plough units) Substrát (výsledná c = 0.6 mm) NαbenzoylD,Largininparanitroanilide hydrochloride (BapNA) Nαbenzoylphenylalanylvalylarginineparanitroanilide (BPVApNA) Nglycinearginineparanitroanilide dihydrochloride (GapNA.2HCl) Množstvo hydrolyzovaného substrátu bolo monitorované pri 410 nm Podmienky reakcie: 0,05M mm TrisHCl bez Ca2+ a iných aktivátorov, ph 7.6, 36,5 C, scan 1. a 61. minúta Kalikreíny: hk4 a hk7 1. Izolácia cdna kódujúca hk4 a hk7 2. PCR amplifikácia génov kódujúcich hk4 a hk7 3. Príprava rekombinantných molekúl (vektor+fragment kódujúci hk4/hk7) 4. Expresia hk4 a hk7 v baktériách E.coli 5. Produkcia, purifikácia a aktivácia hk4 a hk7 6. Kontrola proteolytickej aktivity Sledovanie schopnosti aktívnych kalikreínov aktivovať proformy iných proteináz Screening inhibítorov extrakty endofytov

11 Prehľad najúčinnejších extraktov endofytických MO inhibičná aktivita na trypsín, trombín, urokináz Kmeň V32 V212 V107 V191 V201 V69 V58 V203 V148 V206 V205 V194 V126 V84 V124 V149 Zdroj endofytického mikroorganizmu Betula pendula (Breza) Betula pendula (Breza) Betula pendula (Breza) Dryopteris filixmas (Papraď) Juglans regia (Orech) Morus nigra (Moruša) Morus nigra (Moruša) Pinus mugo (Borovica) Populus nigra (Topoľ) Rhus cotinus (Sumach) Rhus cotinus (Sumach) Rhus cotinus (Sumach) Tilia platyphyllos (Lipa) Vitis vinifera (Vinič) Vitis vinifera (Vinič) Vitis vinifera (Vinič) Výsledná koncentrácia extraktov v reakčnej zmesi: 5 µg/ml % inhibície trombínu % inhibície trypsínu % inhibície urokinázy Valachová M., Jedinák A., Maliar T.: Antiprotease activity of endophytic microorganisms isolated from medical plants. Nova Biotechnologica VI, 2005, 6572

12 Publikačná činnosť: Valachová M., Jedinák A., Maliar T., Šturdík E. Antiprotease activity of endophytic microorganisms isolated from medicinal plants. Nova Biotechnologica 5, 2005, 6572 Debela M, Magdolen V, Schechter N, Valachova M, Lottspeich F, Craik CS, Choe Y, Bode W, Goettig P.: Specificity profiling of seven human tissue kallikreins reveals individual subsite preferences. J. Biol. Chem Sep 1;281(35): Valachová M., Mučková M., Šturdíková M.: Metabolity endofytických mikroorganizmov ako biologicky účinné látky. Chemické listy, 2006, v tlači Konferencie: 22 winter school on proteinases and their inhibitors, Tiers, Italy, 2005: Human tissue kallikreins and their role in cancer: Prostatespecific antigen (PSA): cloning, expresion and purification 1 st Int l Symposium on kallikreins, Lausanne, Switzerland, 2005 (september, 2005): Biochemical characterization of the prostatespecific antigen (PSA)