Mendelova univerzita v Brne Záhradnícka fakulta v Lednici Vyuţitie baktérie Zymomonas mobilis vo vinárstve Diplomová práca Vedúci diplomovej práce Ing. Vojtěch Kobliţka Vypracoval Bc. Tomáš Tibenský Lednice 2013
Čestné prehlásenie Prehlasuje, ţe som diplomovú prácu na tému Vyuţitie baktérie Zymomonas mobilis vo vinárstve, vypracoval samostatne s pouţitím uvedenej literatúry. Súhlasím, aby práca bola uloţená v kniţnici Záhradníckej fakulty Mendelovej univerzity v Brne a sprístupnená k študijným účelom. V Lednici, dňa Vlastnoručný podpis
Poďakovanie: Ďakujem vedúcemu diplomovej práce Ing. Vojtěchovi Kobliţkovi, Ing. Petre Mateiciucovej, DiS., Ing. Michalovi Kumštovi, Bc. Rostislavovi Slavíkovi, a Bc. Tomášovi Nečasovi za odbornú pomoc a pripomienky súvisiace s riešením tejto práce.
Obsah 1. ÚVOD... 8 2. CIEĽ PRÁCE... 9 3. LITERÁRNY PREHĽAD... 10 3.1. Alkoholové kvasenie... 10 3.1.1. Aeróbne a anaeróbne kvasenie... 11 3.1.2. Obmedzenie fermentácie... 11 3.2. Baktérie alkoholového kvasenia... 11 3.2.1. Escherichia coli... 11 3.2.2. Klebsiella oxytoca... 13 3.2.3. Lactobacillus sp... 13 3.2.4. Leuconostoc sp.... 16 3.2.5. Zymomonas mobilis... 16 3.3. Ďalšie mikroorganizmy s kvasnými schopnosťami... 20 3.3.1 Kvasinky... 20 3.4. Fermentačné technológie a typy fermentačných procesov... 23 3.4.1. Fermentácie (kvasné procesy)... 23 3.4.2. Princípy fermentačných technológií... 24 3.4.3. Typy fermentačných procesov... 26 3.5. Kultivácia mikroorganizmov... 29 3.5.1. Statická kultivácia baktérií... 29 3.5.2. Submerzný spôsob kultivácie baktérií... 29 3.6. Rast mikroorganizmov... 31 3.6.1. Rastová krivka... 31 3.7. Syntéza enzýmov počas rastu baktérií... 33 4. MATERIÁL A METODIKA... 34 4.1. Popis stanovišťa, odroda... 34 4.1.1. Popis odrody Malverina... 34 4.2. Príprava vzoriek... 35 4.3. Metódy stanovenia... 36 4.3.1. Sledovanie priebehu kvasenia mikrovzoriek (gravimetricky)... 36
4.3.2. Stanovenie voľného oxidu siričitého titráciou odmerným roztokom jódu... 36 4.3.3. Spektofotometrické stanovenie kyselín a cukrov... 37 4.4. Senzorická analýza... 38 5. VÝSLEDKY... 40 5.1. Gravimetrické sledovanie priebehu kvasenia... 40 5.2. Sledované hodnoty u jednotlivých variantou... 44 5.3. Jednotlivé organické kyseliny... 46 5.4. Jednotlivé cukry... 48 5.5. Hodnota glycerolu... 49 5.6. Hodnota shikimátu, mucinátu a glukonátu... 49 5.7. Výsledky senzorického hodnotenia... 50 6. DISKUSIA... 52 7. ZÁVER... 53 8. SÚHRN... 55 9. RESUME... 56 10. ZOZNAM POUŢITEJ LITERATÚRY... 57 11. PRÍLOHY... 61
1. ÚVOD V minulosti bolo nepredstaviteľné vyuţívať na fermentáciu iný druh mikroorganizmov ako kvasinky, ktoré sa pokladajú za hlavných producentov etanolu. Aj v súčasnosti sa za všeobecných producentov etanolu povaţujú kvasinky, no príčinou jeho vzniku môţu byť aj iné mikroorganizmy. Sľubnou baktériou je Zymomonas mobilis, ktorá má v porovnaní s kvasinkami rýchlejší metabolizmus, niţšie nutrične nároky a fermentácia môţe prebiehať za vyšších teplôt. Glukóza je metabolizovaná pomocou Entner-Doudorfovej dráhy, pri ktorej je kľúčovým medziproduktom 2-keto-3-deoxy-6-fosfoglukonát (KDPG). Cez určité nesporné výhody baktérií, ako producentov etanolu sa stále v priemyselnej praxi, u nás a vo svete, pouţívajú kvasinky. Jediným obmedzením pre Z. Mobilis, v porovnaní s kvasinkami je, ţe jeho vyuţiteľný substrátoví rozsah, je obmedzený na glukózu, fruktózu a sacharózu. Z. Mobilis bol pôvodne izolovaný z alkoholických nápojov, ako je Africké palmové víno, mexické "pulque", a taktieţ ako kontaminant u jablčného vína a piva, v európskych krajinách. Z. Mobilis má potenciálne uplatnenie i vo výrobe polymérov. Levan je polymér fruktózy, spojený 2,6 b-fruktosilným zväzkom. Vzniká pôsobením Z. Mobilis počas svojho rastu na médiu sacharózy. Mikrobiálny levan je komerčne významný. V posledných rokoch stratégia, pre zlepšenie vyuţiteľnosti výroby levanu mikroorganizmami, priťahuje väčšiu pozornosť. Tak isto, sa v uplynulom období, pozornosť zameriava na efektívne vyuţitie baktérií Zymomonas mobilis, pre kvasný priemysel, hlavne pri kvasnom resp. fermentačnom procese. Vhodnosťou kmeňa baktérií, Zymomonas mobilis, k ich vyuţitiu vo vinárstve a ich porovnaním z hľadiska chemického zloţenia mikrovzorkou kvasených pomocou kvasiniek, Saccharomyces cerevisiae, sa zaoberá táto diplomová práca. Vzhľadom ku genetickej príslušnosti baktérie Z. Mobilis, ku kvasinkám Saccharomyces cerevisiae, je moţné jej vyuţitie v priemyselnej výrobe etanolu. Tento argument je dôvodom začatia spolupráce medzi výrobcami a vedeckými pracovníkmi. Výsledkom tejto vzájomnej činnosti by malo byť prevedenie laboratórnych výsledkov v prospech spoločnosti. 8
2. CIEĽ PRÁCE Cieľom práce bolo špecifikovať vyuţitie baktérie Zymomonas mobilis, ich funkcie, úlohy a význam vo vinárstve a preštudovať všetky dostupné literárne zdroje, ktoré pojednávajú o danej problematike. Súčasťou práce bol i praktický pokus, zaloţený na porovnaní chemického zloţenia mikrovzoriek, kvasených pomocou kvasiniek Saccharomyces cerevisiae a baktérií Zymomonas mobilis. Pokusom sa sledoval priebeh kvasenia (gravimetricky), boli vykonané základné analytické rozbory a jednotlivé vzorky boli senzoricky zhodnotené. Pomocou kvapalinovej chromatografie (HPLC), boli v jednotlivých mikrovzorkách vyhodnotené organické kyseliny a cukry. 9
3. LITERÁRNY PREHĽAD 3.1. Alkoholové kvasenie Alkoholové kvasenie je biochemický proces, pri ktorom sú rastlinné polysacharidy premenené na alkohol, za prítomnosti kvasiniek. Kvasinky enzýmami premieňajú rastlinné sacharidy na etanol a oxid uhličitý, za vzniku tepla a energie. Pri glykolýze sa spotrebováva NAD + na NADH. Toho je však v bunke obmedzené mnoţstvo a preto musí prísť k recyklácií NAD +. Pri prísune kyslíka sa NADH predáva mitochondriám na reoxidáciu, avšak ak nie je dostatok kyslíka (anaeróbne podmienky) je NAD + doplňovaná redukciou pyruvátu, ktoré sú pokračovaním glykolytickej dráhy. Toto anaeróbne odbúravanie môţe prebiehať ako mliečne kvasenie (svaly), alebo ako alkoholové kvasenie (kvasinky). Pri anaeróbnych podmienkach kvasinky premieňajú glukózu na, pre ľudstvo uţ po niekoľko tisícročný obľúbený produkt, etanol, pričom ako vedľajší produkt vzniká oxid uhličitý. (STRYER, 1975) Kvasný proces kvasiniek prebieha v dvoch krokoch: V prvom sa pyruvát dekarboxyluje na acetaldehyd a oxid uhličitý, táto reakcia je katalyzovaná enzýmom pyruvátdekarboxylázou. CH 3 C(O)COOH CH 3 CHO + CO 2 V druhom kroku je vzniknutý acetaldehyd redukovaný na etanol. V tejto reakcii vystupuje ako enzým alkoholdehydrogenáza (ADH). CH 3 CHO + NADH CH 3 CH 2 OH + NAD + V druhej reakcii je NADH premenený späť na NAD + a tým sa bunke opäť doplní oxidovaná forma tejto molekuly. Fermentácia sumárne: glukóza 2CO 2 + 2etanol ΔG ' = 235 kj.mol -1 Ako ďalší hlavný produkt alkoholového kvasenia vznikajú dve molekuly ATP, čo je teoreticky síce iba asi 26% vyuţitia celkovej moţnej energie reakcie (premena jedného molu ADP na ATP spotrebuje 30,5 kj voľnej energie). Zostávajúca energia je uvoľnená vo forme tepla, čím sa reakcia stáva irevizibilná. Pri fyziologických podmienkach je účinnosť premeny voľnej energie na energiu vo forme ATP asi 50%. To je spôsobené rozdielnymi koncentráciami zloţiek za fyziologického a štandardného stavu. 10
3.1.1. Aeróbne a anaeróbne kvasenie Pri anaeróbnej fermentácií je v porovnaní s aeróbnym odbúravaním plytvané s glukózou. Anaeróbnym odbúravaním glukózy sa získajú iba 2 molekuly ATP na 1 molekulu glukózy. V porovnaní s aeróbnym odbúravaním, kedy vzniká z jednej molekuly glukózy 38 molekúl ATP je anaeróbny spôsob vzniku energie 18 menej účinnejší. Týmto sa vysvetľuje Pasteurovo pozorovanie (tzv. Pastérov efekt), pri ktorom kvasinky za anaeróbnych podmienok spotrebovávajú ďaleko viac glukózy v porovnaní s úbytkom za aeróbnych podmienok. 3.1.2. Obmedzenie fermentácie Alkoholové kvasenie však nemôţe prebiehať do nekonečna. Maximálna koncentrácia alkoholu v roztoku sacharidu môţe byť 13 14 %, u niektorých špeciálne vyšľachtených kvasiniek aţ 16 %. Ak stúpne koncentrácia alkoholu nad prípustnú hladinu, môţu sa v roztoku namnoţiť baktérie, ktoré premieňajú medziprodukt fermentácie, acetaldehyd, na kyselinu octovú, a namiesto alkoholu dostaneme vysoko percentný ocot. Etanol je najviac pre kvasinky veľmi toxický, takţe ak by sa zabránilo rozmnoţeniu baktérií, kvasinky by sa nakoniec otrávili etanolom. (BOREL, E., 1962) Alkoholické nápoje, vznikajúce kvasením, ktoré majú obsah alkoholu napr. aj 30 %, vznikajú tieţ prirodzenou cestou, ale asi iba do 14 % obsahu alkoholu. Aţ následne sa koncentrácia etanolu zvýši nadstavením alkoholu na poţadovanú koncentráciu. 3.2. Baktérie alkoholového kvasenia 3.2.1. Escherichia coli Escherichia coli (pôvodným názvom Bacterium coli) je gramnegatívne, fakultatívna, anaeróbna, spóry netvoriaca, tyčinkovitá baktéria pohybujúca sa pomocou bičíkov. Spadá pod čeľaď Enterobacteriaceae, ktorá tieţ zahrňuje mnoţstvo patogénnych rodov mikroorganizmov. E. coli patrí k črevnej mikroflóre teplokrvných ţivočíchov, vrátane človeka. Z tohto dôvodu je jej prítomnosť v pitnej vode indikátorom fekálneho znečistenia. Človeku je ako súčasť prirodzenej mikroflóry prospešná, pretoţe produkuje radu látok, ktoré bránia rozšíreniu patogénnych baktérií (kolicíny) a podieľajú sa i na tvorbe niektorých 11
vitamínov (napr. vitamínu K). Táto baktéria bola objavená nemecko-rakúskym pediatrom a bakteriológom Theodorom Escherichom v roku 1885. (FENG, P., 1995) Morfologická charakteristika : E. coli patrí k najlepšie preštudovaným mikroorganizmom, pretoţe je modelovým organizmom pre génové a klinické štúdie. Joshua Lederberg ako prvý v roku 1947 pozoroval a popísal na baktérii E. coli výmenu genetického materiálu tzv. konjugáciu. Baktéria dosahuje dĺţky 2 3 μm a šírky 0,6 μm. Niektoré druhy môţu tvoriť slizovité obaly, ktoré sú zloţené z polysacharidov. Na svojom povrchu nesie dva typy fimbrií. Prvý typ fimbrií sa skladá z kyselého hydrofóbneho proteínu tzv. fimbrinu. Umoţňuje baktérii prichytiť sa na epitel hostiteľa a následne ho kolonizovať. Kolonizácia je uľahčená vysokým počtom fimbrií prvého typu na bunke (100-1000 ks/bunka). Tieto fimbrie sú vysoko antigénne, pretoţe obsahujú tzv. F antigény. Druhým typom fimbrií sú tzv. sex pili, ktoré hrajú dôleţitú úlohu pri konjugácií. Baktéria sa môţe pohybovať pomocou bičíkov. Tie sú zloţené z tzv. flagelinu (na lyzín bohatý proteín). Bičíky sú tieţ ako fimbrie vysoko antigénne, a to vďaka tzv. H antigénom. Na povrchu baktérie sa pri stresových podmienkach tieţ môţu tvoriť polysacharidové kapsule, ktoré obsahujú tzv. K a M antigény. Vonkajšia membrána je pokrytá lipopolysacharidom a skladá sa z lipidovej dvojvrstvy, kde je ukotvené mnoţstvo membránových proteínov. Medzi proteíny, ktoré tvoria póry, patria poriny Omp C, Omp F a Pho E. Poriny slúţia ako vstupné a výstupné kanály pre bunkové metabolity a pre príjem vitamínov z okolia. Priestor medzi vonkajšou membránou a bunkovou stenou sa nazýva periplazmatický. Vyskytujú sa tu napr. proteíny viaţuce aminokyseliny či cukry, enzýmy degradujúce antibiotiká (beta-laktamázy). Bunková stena E. coli (ako zástupca gramnegatívnych baktérií) sa skladá z tenkej vrstvy peptidoglykánu, ktorý je zodpovedný za rigidný tvar bunky. Pod vrstvou peptidoglykánu sa nachádza cytoplazmatická membrána. Tá sa skladá predovšetkým z proteínov (70%), lipopolysacharidov a fosfolipidov. Je v nej lokalizované mnoţstvo biochemických pochodov, napr. dýchací reťazec a syntéza ATP. Cytoplazma bakteriálnej bunky je viskózny vodný roztok, ktorý obsahuje rozpustené anorganické a organické látky. Nachádza sa tu mnoţstvo ribozómov (cca 40% hmotnosti celej bunky), vďaka nim je proteosyntéza a delenie bakteriálnych buniek veľmi rýchle. Pri optimálnych podmienkach (37 C, dostatok ţivín) je doba generácie zhruba 20 min. Bakteriálne ribozómy sú menšie ako 12
eukaryotné. Majú sedimentačnú konštantu 70S. Tieţ sa tu nachádza molekula bakteriálnej DNA, v ktorej je uloţená celá dedičná informácia baktérie. Veľkosť DNA u E. coli K-12 je zhruba 4700 kbp a kóduje cca 4400 proteínov. Cytoplazma baktérií na rozdiel od cytoplazmy eukaryót neobsahuje membránové organely. Fyziologická charakteristika: E. coli je fakultatívny anaerób, t.z. vyuţíva respiračný i kvasný metabolizmus (fermentáciu) pre prísun energie. E. coli ako chemoheterotrof je schopná vyuţívať mnoţstvo cukru i aminokyselín ako zdroj uhlíku, najrýchlejšie však rastie na glukóze. Za anaeróbnych podmienok E. coli utilizuje glukózu za vzniku laktátu, sukcinátu, acetátu i etanolu. Za aeróbnych podmienok je glukóza vyuţitá efektívnejšie a konečným produktom je predovšetkým oxid uhličitý. E. coli produkuje indol, avšak nerastie na citráte a neprodukuje sírovodík. Je katalázne pozitívna, oxidázne negatívna. Tieto vlastnosti sa vyuţívajú pri jej identifikácií pomocou tzv. Enterotestu. (ŠILHÁNKOVÁ, L., 2002) E. coli je schopná rásť pri teplote 8-48 C, avšak optimálna teplota je 37 C. Rozsah ph pre rast je 6-8. Antigénna charakteristika: E. coli môţeme taxonomicky deliť podľa antigénnych štruktúr na sérotypy. Medzi hlavné štruktúry patria somatické O antigény (lipopolysacharid), ktorých je 170 typov, a kapsulárne K antigény (80 typov), ďalšími štruktúrami sú napr. H antigény (flagelárne proteíny) a F antigény (bielkoviny fimbrií). 3.2.2. Klebsiella oxytoca Gramnegatívna nepohyblivá baktéria s polysacharidovým púzdrom. Utilizuje radu cukrov vrátane hexóz a pentóz, ale i cellobiózu a cellotriózu. Vyuţíva sa skvasovanie lignocelulózy. Glukóza je skvasovaná, ako u E.coli, pomocou pyruvát formiát lyázy, za tvorby radov organických kyselín a neutrálnych produktov. (ŠINDLER, J., 2010) 3.2.3. Lactobacillus sp. Lactobacillus je rod grampozitívnych, fakultatívne anaeróbnych, či mikroaerofilných bakterií z kmeňa Firmicutes. Sú známe tým, ţe rozkladajú laktózu a iné cukry na kyselinu mliečnu. Sú beţne prítomné v rôznych prostrediach a obvykle nie sú patogénne. Napríklad u ľudí sú súčasťou mikroflóry vo vagíne a v tráviacej sústave. Mnoho druhov sa taktieţ účastní rozkladu zbytkov rastlinných tiel v prírode. Niektoré laktobacily sa pouţívajú pri výrobe 13
jogurtov, syrov, kyslej kapusty, nakladaných uhoriek, piva, vína a ďalších typov fermentovaných (kvasených) potravín. Naopak je známe, ţe sa laktobacily zúčastňujú na tvorbe zubného kazu. (THOMAS, J. REES, 1997) Z vinárskeho hľadiska sú dôleţité L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, Lactobacillus brevis : Bunky L. brevis majú tvar tyčiek aţ kokotyčiek so zaoblenými koncami. Veľkosť buniek je väčšinou 1,5-10 μm na dĺţku a 0,5-1,2 μm na šírku. Bunky môţu byť rovné, alebo zakrivené, v závislosti na veku kultúry a podmienkach kultivácie. Niektoré kmene sa môţu v kultúre vyskytovať ako zmes krátkych a dlhých buniek. Tvorba retiazok je menej častá. Optimálneho rastu týchto baktérií je dosiahnuté pri teplote 30 C a ph v rozmedzí 4,0-6,0. Obsah G+C sa pohybuje v rozmedzí 44-47 %. Lactobacillus brevis je zaradený do tretej fyziologickej skupiny rodu Lactobacillus, neobsahuje teda fruktóza-1,6difosfát-aldolázu, kľúčový enzým glykolytickej dráhy. Fermentácia hexóz (glukózy, menej často galaktózy) prebieha po fosfoglukonátovej dráhe (obr. 1), kedy je aktivovaná hexóza dehydrogenovaná za vzniku 6-fosfoglukonátu, ktorý je následne dehydrogenáciou a dekarboxyláciou prevedený na pentóza-5-fosfát. Ten je fosfoketolázou štiepení na glyceraldehyd-3-fosfát (GAP) a acetylfosfát, pričom GAP je premenený aţ na kyselinu mliečnu. Acetylfosfát je z energetického hľadiska kľúčovým intermediátom fosfoketolázovej dráhy. Pokiaľ nie je dostupný iný akceptor elektrónov, je acetylfosfát redukovaný cez acetyl-coa a acetaldehyd na etanol, pričom dôjde v podstate k strate acetylfosfátu, pretoţe ten môţe byť vyuţitý pri fosforylácií na úrovni substrátu k syntéze ATP. To je moţné iba v prípade, ţe je prítomný externý akceptor elektrónov (napr. acetaldehyd, α-ketoglutarát, fruktóza, fumarát). (FLICKINGER, DREW, 1999) Lactobacillus brevis môţe vyuţívať taktieţ glycerol ako akceptor elektrónov pri anaeróbnej kofermentácií s glukózou. Glycerol je najskôr dehydratovaný na 3- hydroxypropionaldehyd, ktorý sa ďalej redukuje na 1,3-propandiol. Konečnými produktmi tejto metabolickej dráhy sú teda kyseliny mliečna, octová, CO 2 a 1,3-propandiol. Pentózy (fruktóza, ribóza, arabinóza, menej často xylóza) sú skvasované na kyselinu mliečnu a octovú. Netvorí sa CO 2 a vzhľadom k tomu, ţe nie sú nutné dehydrogenačné kroky k dosiahnutiu intermediátu xylulóza-5-fosfátu, nie je acetylfosfát redukovaný na etanol, ale za vzniku kyseliny octovej dáva vznik 1 ATP fosforylácií na úrovni substrátu. Pri kvasení pentóz teda vzniká ekvimolárne mnoţstvo kyseliny mliečnej a octovej. U L. brevis však boli 14
pozorované výnimky v metabolizme fruktózy, kedy dochádzalo k indukcii fruktózy-1,6- difosfataldólazy a fermentácia fruktózy prebiehala po glykolytickej dráhe. (SALMINEN, WRIGHT, 1998) Obrázok č. 1: Fosfoketolázová dráha fermentáce hexóz a pentóz. Pri fermentácií glukonátov je pred fosfoketolázovou reakciou nutný dehydrogenačný krok. Istá časť acetylfosfátu teda musí byť redukovaná na etanol, aby bola udrţaná redoxná rovnováha. Z disacharidov sú bunky L. brevis schopné vyuţívať maltózu a melibiózu. Celobiózu a trehalózu nefermentujú. Z trisacharidov môţu niektoré kmene vyuţívať rafinózu. Lactobacillus brevis je schopný prevádzať reduktívnu deamináciu argininu. Arginin pritom neslúţi ako jediný zdroj energie, ale je katabolyzovaný súbeţne s fermentovateľnými cukrami. Bezprostredne po vstupe argininu do bunky dochádza k jeho hydrolýze na citrulín a amoniak. Ornitin karbamoyltransferáza katalyzuje fosforolytické štiepenie citrulínu na karbamoylfosfát a ornitín. Z karbamoylfosfátu vzniká 1 ATP fosforylácia na úrovni substrátu za tvorby NH 3 a CO 2. Ako konečné produkty metabolizmu argininu teda vznikajú ornitin, NH 3 a CO 2 v pomere 1:2:1. (WOOD, HOLZAPFEL, 1995) 15
Lactobacillus buchneri : Kmene L. buchneri sú klasifikované ako heterofermentatívne baktérie mliečneho kvasenia, pretoţe premieňajú jednu molekulu glukózy (šesť uhlíkov) na jednu molekulu kyseliny mliečnej (tri uhlíky), jednu molekulu kyseliny octovej (dva uhlíky) a jednu molekulu CO 2. Strata sacharidov je činnosťou týchto kmeňov výrazne niţšia ako u klasických homofermentatívnych baktérií. Na viac, preukázateľne redukujú straty sacharidov činnosťou patogénnych mikroorganizmov v aeróbnom prostredí, pretoţe premieňajú kyselinu octovú na inhibičné produkty kyseliny octovej, 1,2-propandiol, propanol a kyselinu propiónovú. (DRIEHUIS, F., W. J. W. H. OUDE ELFERINK, S. F. SPOELSTRA, 1999) 3.2.4. Leuconostoc sp. Leuconostoc je rod grampozitívnych baktérií, ktorý patrí do rodiny Leuconostocaceae. Sú to všeobecne oválne koky, často tvoriace retiazky. Leuconostoc spp. sú skutočne rezistentné voči vankomycínu a sú katalázne negatívne (čo ich odlišuje od stafylokokov ). Všetky druhy v tomto rode sú heterofermentatívne a sú schopné vyrábať dextran zo sacharózy. Sú všeobecne slizotvorné. Vzhľadom k tomu, ţe sú menej častou príčinou ochorenia u ľudí, štandardné komerčné identifikačné súpravy, často nie sú schopné identifikácie v organizme. Leuconostoc je, spolu s ďalšími baktériami mliečneho kvasenia, ako je Pediococcus a Lactobacillus, zodpovedný za fermentáciu v kyslej kvasenej kapuste. V tomto procese sú cukry v čerstvej kapuste premenené na mliečne kyseliny, ktoré majú kyslú chuť. (BJÖRKROTH, J., 2006) 3.2.5. Zymomonas mobilis Baktérie rodu Zymomonas sú v mnohých smeroch výnimočné. V tropických oblastiach sa po storočia vyuţívajú ich kvasné schopnosti pre prípravu prirodzene kvasených alkoholických nápojov. Z. Mobilis bol pôvodne izolovaný z alkoholických nápojov, ako je Africké palmové víno, mexické "pulque", a taktieţ ako kontaminant u jablčného vína a piva v európskych krajinách. V rôznych knihách sa informácie o rode Zymomonas objavujú od roku 1912, avšak záujem o ich priemyslové vyuţitie vzrástol aţ v posledných desaťročiach. Základom pre tento rozvoj bolo zistenie, ţe produkujú etanol v mnoţstvách porovnateľných s kvasením kvasiniek, ktoré sa pre tento účel beţne pouţívajú. Sú významným činiteľom pri kolobehu uhlíka v prírode. Vyuţívané sú najrôznejšie cukry, alkoholy, kyseliny, aromatické uhľovodíky a ďalšie uhlíkaté látky. (BEDNÁŘ ai., 1996) 16
Rod Zymomonas je reprezentovaný gramnegatívnymi tyčinkami často opatrenými 1-4 lofotrichálne umiestnenými bičíkmi. Nevytvárajú spóry, neukladajú ţiadny rezervný materiál. Z fyziologického hľadiska je rod chemoheterotrofný. (ČEJKOVÁ, 2005) Chemoheterotrofia je spôsob výţivy drvivej väčšiny baktérií. Zdrojom uhlíka a energie sú prakticky všetky uhlíkaté látky, ktoré sa vyskytujú na Zemi. (MONTENECOURT, 1985) Tento rod baktérií je fakultatívne anaeróbny alebo mikroaerotolerantný. Rod Zymomonas bol vytvorený reklasifikáciou niektorých zástupcov iných druhov na základe unikátnej metabolickej schopnosti vyuţívať Entner Doudoroffovú dráhu i v anaeróbnom prostredí. Na základe techník, zavádzaných v molekulárnej biológií, bol v 70. rokoch zo všetkých testovaných izolátov, vytvorený jediný reprezentatívny zástupca. Jediný druh s dvoma subspeciemi, a to Zymomonas mobilis subsp. Mobilis (pouţívaný pre priemyslovú produkciu etanolu) a Zymomonas mobilis subsp. Pomaceae (pôvodca kazenia muštov a piva). (FLEET, G. H., 1993) Spektrum substrátov, ktoré je tento druh schopný vyuţívať je značne obmedzené. Ide o glukózu, fruktózu (konštitutívne enzýmy) a sacharózu (iba u niektorých kmeňov, enzýmy sú induktívnej povahy). Ostatné substráty vyuţívané nie sú. Dobrého nárastu je dosiahnuté na chemicky definovanom médiu obsahujúcom niektoré rastové faktory (pantothenát vápenatý, thiamin, pyridoxin, biotin, nikotinová kyselina). Rod Zymomonas je značne rezistentný voči beţne pouţívaným antibiotikám (penicilíny, streptomycin, bacitracin), výnimku tvoria chloramfenikol a tetracyklíny. Vykazuje taktieţ výrazný antagonický efekt voči rade baktérií, čo bolo spočiatku vysvetľované vlastnou produkciou antibiotík, ktorá ale nebola preukázaná. Toto pôsobenie zrejme súvisí s extracelulárnou produkciou proteínov kódovanými plasmidy. (SWINGS, 1977) Účinným rozlíšením oboch zmienených subspencií je maximálna rastová teplota. Zatiaľ čo Z. mobilis subsp. Pomaceae nerastie pri teplote vyššej ako 34 C, Z. mobilis subsp. Mobilis väčšinou pri tejto teplote vykazuje, tak ako dobrý nárast, tak aj dobrú produkciu etanolu. Rod Zymomonas je vysoko osmotolerantný. Táto vlastnosť je tieţ odlišná pre zmienené subsp. (DELFINI, C., FORMICA, J. V., 2001) Obecne platí, ţe subsp. Mobilis rastie pri vyšších koncentráciách cukru (aţ do 40 %) ako subsp. Pomaceae. Vysoká koncentrácia však výrazne zniţuje rastovú rýchlosť. Pre optimálnu produkciu etanolu je uvádzaná optimálna koncentrácia glukózy, alebo sacharózy do 20 %. Vzhľadom k tomu, ţe rod Zymomonas je izolovaný z kvasiacich muštov, je jeho 17
tolerancia voči etanolu vysoká (aţ do 16 % obj.). Vysoká koncentrácia cukru alebo etanolu spôsobuje zmenu v pomere mastných kyselín (väčší podiel C 18 : 1, niţší podiel 16 : 1). V cytoplazmatickej membráne týchto baktérií bola ďalej zistená vyššia hladina kyseliny vascenovej v porovnaní s ostatnými gramnegatívnymi baktériami. Vysoká koncentrácia etanolu pozmeňuje tieţ kvalitatívne zloţenie membránových fosfolipidov a pomer lipidov voči proteínom. Enzýmové vybavenie tejto baktérie je výnimočné. V prvom rade je to uţ vyššie spomenutá schopnosť vyuţívať iba tri substráty (glukóza, fruktóza, sacharóza). Pričom rast na sacharóze je podmienený prítomnosťou invertázy a levansacharázy. (FUGELSANG, K. C., EDWARDS, C. G., 2007) Bakteriálny rod Zymomonas sa svojimi vlastnosťami podobá kvasinkám. Zásadný rozdiel je však v tom, ţe k produkcii etanolu nepouţíva enzýmy glykolýzy, ale Entner Doudoroffovej dráhy. (ČEJKOVÁ, 2005). Pri tejto ceste je glukóza fosforylovaná v glukóza-6-fosfát, ktorý je potom oxidovaný za súčinnosti NADP + v 6-fosfoglukonát. Ten je dehydratovaný na 2-keto-3-deoxy-6- fosfoglukonát a ten je potom štiepený v pyruvát a glyceraldehyd-3-fosfát. Vzniknutý glyceraldehyd-3-fosfát je prevedený procesmi známymi pri glykolýze na pyruvát, za vzniku 2ATP a NADH. Oba vzniknuté pyruváty sú oxidačnou dekarboxyláciou prevedené v acetylkoenzym A, ktorý vstupuje do citrátového cyklu. Vzniknuté NADPH a NADH sú oxidované pomocou dýchacieho reťazca za vzniku príslušného mnoţstva ATP. Čistý energetický zisk tejto metabolické cesty je teda maximálne 37 ATP z jednej molekuly glukózy. U rodu Zymomonas sú pyruváty vzniknuté Entner - Doudoroffovou dráhou, metabolickou cestou premeny glykolýzy v etanol. Pyruvát je najskôr dekarboxylovaný na acetaldehyd, a ten je potom za súčinnosti redukovaného kofaktoru NADH a príslušného enzýmu redukovaný na etanol. Tým vznikajú z jednej molekuly hexózy dve molekuly etanolu a dve molekuly oxidu uhličitého, za súčasného zisku energie dvoch molekúl ATP. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995) C 6 H 12 O 6 2CH 3 CH 2 OH + 2CO 2 + energia V tomto prípade ide o anaeróbny katabolizmus. Vzhľadom k tomu, ţe v priebehu Entner-Doudoroffovej dráhy je vytvorená iba jedna molekula trioso-p, ktorý môţe byť po vstupe do glykolýzy vyuţitý k tvorbe ATP na úrovni substrátu, je tu mnoţstvo získanej energie v porovnaní s beţným etanolovým kvasením (Embden-Meyrhof-Parnasova dráha) polovičné a činí na 1 mol glukózy 1 mol ATP. Rod Zymomonas je jediným doposiaľ známym rodom 18
mikroorganizmov, ktorý dokáţe túto dráhu realizovať i za anaeróbnych podmienok.(hoďák, 1979). V prípade aerobiózy je produkované väčšie mnoţstvo vedľajších produktov. Vysoká koncentrácia etanolu nevyvoláva denaturáciu enzýmov, ale vyvoláva nekompetitívnu inhibíciu (ČEJKOVÁ, 2005). Pri rozlišovaní sa sleduje i alkoholické skvasovanie glukózy, a to v peptónovej vode s 1,0 % glukózou, do ktorej sa vkladá plynovka na zachytávanie CO 2. Prípadne sa pouţije beţná metóda na stanovenie skvasiteľných cukrov (ARPAI ai., 1977). Nedostatok u Z. Mobilis predstavuje jeho neschopnosť previesť zloţité sacharidy, polyméry, ako je celulóza, hemicelulózy, škrob na etanol a tak isto tvorba vedľajších produktov, ako sú sorbitol, acetoin, glycerol a kyselina octová. Pre obídenie týchto problémov, prišlo u Z. Mobilis k pokusu o rozšírenie rozsahu vyuţiteľných Z. Mobilis, ktoré majú gény kódujúce niekoľko hydrolytických enzýmov. Gén bol naklonovaný z príbuzných druhov baktérií a prevedený do Z. Mobilis. Je zaujímavé, ţe bol postavený na tom, ţe sa kombinujú PDC (pyruvát dekarboxyláza) a adhii (alkohol dehydrogenáza) gény Z. Mobilis a snaţia sa ich previesť do iných bakteriálnych kmeňov. Prostredníctvom klasických mutácií a selekčných prístupov, sa vytvorili mutanti Z. Mobilis so zlepšenými vlastnosťami a fermentačnou schopnosťou, ktoré netvoria vedľajšie produkty okrem etanolu. (CONWAY, T., OSMAN, Y.A., KONNAN, J.I., HOFFMANN, E.M., INGRAM, L.O., 1987). Z. Mobilis dokáţe vyuţívať iba glukózu, fruktózu alebo sacharózu pre výrobu etanolu. Pre rozšírenie schopností Z. Mobilis skvasovať aj iné cukry, boli hydrolyticky, izomerázov génov prevedené gény z rekombinantnej E. coli do Z. Mobilis, čo viedlo k vyuţitiu xylózy, manózy, laktózy a arabinózy ako zdroja uhlíku pre Z. Mobilis. (KANAGASUNDARAM,V., 1992) Z. Mobilis taktieţ metabolicky produkujú L-alanin a L-kyselinu mliečnu. Gény kódujúce syntézu b-karoténu boli tak isto naklonované a úspešne vyjadrené v Z. Mobilis, ktoré obohatili kvasené ţiviny u hospodárskych zvierat. V potravinárskom a farmaceutickom priemysle baktérie Z. Mobilis poskytujú príleţitosť vyuţitia pre ich veľkú produkciu polysacharidu levan. Z. Mobilis naznačujú potenciálne vyuţitie tohto organizmu v priemyslovej výrobe u rôznych produktov kvasenia. V posledných rokoch sa pozornosť zameriava na efektívne vyuţitie tohto rodu baktérií Zymomonas mobilis pre kvasný priemysel, 19
hlavne pri kvasnom resp. fermentačnom procese. Ako je vidieť z vyššie uvedeného, má dôkladné skúmanie molekulárnou biológiou a biochémiou, pre výrobu etanolu, prostredníctvom Z. Mobilis, veľký význam. V súčasnej dobe existuje značné mnoţstvo literatúry o transformácií Z. Mobilis na výrobu etanolu z lignocelulózy. Okrem toho majú vedci záujem o vyuţitie zmiešaných kultúr a prevedenie zloţitých cukrov na etanol. Vzhľadom ku genetickej príslušnosti Z. Mobilis, je moţné vyuţiť tento organizmus v priemyselnej výrobe etanolu. Tento argument je dôvodom začatia spolupráce medzi výrobcami a vedeckými pracovníkmi. Výsledkom tejto vzájomnej činnosti by malo byť prevedenie laboratórnych výsledkov v prospech spoločnosti. Mnoho kmeňov rastúcich na sacharóze produkuje extracelulárny polysacharid levan. Levan, je polymér fruktózy spojený 2,6 b-fruktosylným zväzkom. Vzniká pôsobením Z. Mobilis počas svojho rastu na médiu sacharózy. Mikrobiálny polymér levan je komerčne významný. Súčasná stratégia pre zlepšenie vyuţiteľnosti výroby polyméru levan mikroorganizmami priťahuje väčšiu pozornosť. Biosyntéza levanu je kódovaná plasmidami. Dnes záujem o technologické vyuţitie tejto baktérie stúpa a metódami génových manipulácií sú pripravované nové kmene, s výhodnejšími vlastnosťami pre konkrétne aplikácie (ČEJKOVÁ, 2005). 3.3. Ďalšie mikroorganizmy s kvasnými schopnosťami 3.3.1 Kvasinky Kvasinky sú heterotrofné, eukaryotné mikroorganizmy patriace medzi huby. Slovenský názov dostali pre svoju schopnosť, väčšiny druhov, skvasovať monosacharidy, niektoré disacharidy, prípadne trisacharidy, na etanol a CO 2. Najpouţívanejšie sú kvasinky rodu Saccharomyces. Je to najdôleţitejší a najrozsiahlejší rod. Má silné kvasné schopnosti a jeho druhy sú schopné skvasovať väčšinou niekoľko cukrov. Nikdy však nevyuţívajú laktózu, ako zdroj uhlíka, ani dusičnany, ako zdroj dusíka. Tvoria väčšinou krátke elipsoidné, vajíčkovité, alebo pretiahnuté bunky. Spájanie je izogamné a askospóry sú guľovité aţ elipsoidné. Kvasinky a kvasinkové organizmy sú v prírode veľmi rozšírené. Patria do skupiny Eukaryotov. Vyskytujú sa predovšetkým na materiáloch obsahujúcich cukry, t.z. ovocí, obzvlášť bobuľovom a kôstkovom ovocí, potom tieţ na cukornatých potravinách. 20
Rozmnoţovanie kvasiniek je podmienené ich fyziologickými vlastnosťami, t.z. potrebou cukru, odolnosti voči kyslému prostrediu, u niektorých druhov tieţ toleranciou k vysokému osmotickému tlaku. Je obmedzená ich neschopnosťou štiepiť bielkoviny. Tak isto ich nízka tepelná odolnosť ovplyvňuje výskyt kvasiniek. Väčšina kvasiniek je usmrtená uţ pri 2-4 minútovom zahrievaní na 56 C. Spóry kvasiniek majú tepelnú odolnosť iba o niečo vyššiu. Rozmnoţovanie kvasiniek je úplne potlačené pri teplote 38 C. Kvasinky sa rozmnoţujú oveľa pomalšie ako baktérie, a preto s nimi môţu súťaţiť iba za podmienok, ktoré sú pre baktérie nepriaznivé (nízke ph, nízky oxidačno-redukčný potenciál a pod.) Z týchto dôvodov pôsobia kvasinky často nepriaznivo pri kazení ovocných muštov, sladených limonád a sladených kyslých vôd. Tieţ pri výrobe droţdia, v pivovarníctve a vinárstve môţu pôsobiť značne nepriaznivo (ŠROUBKOVÁ, 1996). Dusíkaté ţiviny sú bezprostredne nutné k ţivotu bunky, pretoţe sa zúčastňujú priamo jej výstavby a biosyntézy bielkovín. Kvasinky môţu asimilovať dusíkaté látky anorganické i organické. Z anorganických zlúčenín sú výbornou ţivinou amoniak a amónne soli. Z organických látok predstavujú veľmi dobré ţiviny niektoré aminokyseliny. Najdôleţitejšími anorganickými zlúčeninami vo výţive kvasiniek sú zlúčeniny fosforu, fosforečnany. Fosfor tvorí základnú látku vo výstavbe bunky. Fosforečnany sa zúčastňujú premeny cukru pri alkoholovom kvasení a taktieţ tvorby nukleonových kyselín a nukleoproteínov. Nedostatok kyseliny fosforečnej spomaľuje kvasenie a mnoţenie kvasiniek, napr. u droţdia potom spôsobuje jeho zlú trvanlivosť (TVRDOŇ, 1992). Hlavný priemyslový význam kvasiniek spočíva v ich vyuţití pre výrobu alkoholických nápojov, pekárenského a kŕmneho droţdia. Špeciálne kmene Saccharomyces cervevisiae sa pouţívajú pre výrobu ergosterolu, ktorý po oţiarení ultrafialovým svetlom poskytuje vitamín D. Niektorí príslušníci rodov Saccharomyces a Kluveromyces slúţia ako zdroj enzýmov pouţívaných v priemysle. Najdôleţitejším druhom je Saccharomyces cerevisiae, ktorý sa uplatňuje ako pivovarské kvasinky. Skvasuje glukózu, sacharózu, maltózu a galaktózu. Trisacharid rafinózu skvasuje iba z jednej tretiny, pretoţe z nej odštiepuje pomocou invertázy iba fruktózu, ktorú vyuţíva. Zostávajúci disacharid (melibiózu) nie je totiţ schopný rozštiepiť. Vyskytujú sa u nej homothalické i heterothalické kmene. Kvasinky tohto rodu sa pouţívajú v mnohých ďalších odvetviach potravinárskeho priemyslu. Od toho sa potom odvíjajú poţiadavky na tieto mikroorganizmi (tvar, veľkosť, stálosť a pod.) Kvasinky Saccharomyces cerevisiae patria 21
medzi najlepšie preštudované mikroorganizmy (je u nich podrobne rozpoznaný i genóm) a sú vyuţívané ako modelové mikroorganizmy pre radu výskumných projektov (ŠROUBKOVÁ, 1996). Kvasinky druhu Saccharomyces cerevisiae sú fakultatívne anaeróbne mikroorganizmy, čo znamená, ţe ich primárnou činnosťou je fermentácia (kvasenie), ale sú schopné rásť a utilizovať sacharidy (prípadne i iné uhlíkaté substráty) i za aeróbnych podmienok. Ich hlavným metabolitom je etanol tvorený v bunke z monosacharidov, ktoré boli transportované z média do bunky a následne radou enzýmových reakcií sú premenené na konečný produkt etanol a oxid uhličitý. Pritom vznikajú i niektoré ďalšie produkty, ako je napr. glycerol, acetaldehyd, diacetyl, kyselina octová a iné. Kvasinky i pri tomto pochode pomaly rastú. Vzhľadom k tomu, ţe ku tvorbe etanolu je potrebný len nepatrný nárast kvasiniek, je nutné, aby kvasné médium obsahovalo určité malé mnoţstvo rozpusteného kyslíku. Stačí, ak je médium prevetrané na začiatku kvasenia. Rýchlosť štiepenia sacharidov je väčšia pri anaeróbnom pochode ako pri aeróbnom. Kvasinky vykazujú iba obmedzenú znášanlivosť k etanolu. To sa prejavuje tým, ţe sa rýchlosť produkcie etanolu výrazne zniţuje pri koncentrácií okolo 10-12 % obj. v médiu. Predĺţením doby kvasenia je však moţné dosiahnuť vyššie koncentrácie (pri výrobe japonského alkoholického nápoja Saké môţeme dosiahnuť koncentráciu okolo 20 % obj. etanolu). Pre metabolismus kvasiniek Saccharomyces cerevisiae sú dôleţité dve intracelulárne regulácie, ktoré sa nazývajú podľa autorov Pasterov a Crabtree efekt (RYCHTERA, 2005). Ďalším druhom je potom Saccharomyces uvarum. Od rodu S. cerevisiae sa líši tým, ţe skvasuje celkovú rafinózu, pretoţe obsahuje enzým melibiázu, ktorá štiepi melibiózu v príslušné monosacharidy. Pretoţe sa podarilo v poslednej dobe skríţiť kmene Saccharomyces cerevisiae a kmene Saccharomyces uvarum, domýšľajú sa taxonómovia, ţe ide o jeden druh a je potreba Saccharomyces uvarum zrušiť. Neschopnosť skvasovať melibiózu by potom bolo nutné posudzovať ako mutáciu. Ďalším významným rodom kvasiniek je rod Kluyveromyces. Je charakterizovaný predovšetkým tým, ţe na rozdiel od rodu Saccharomyces sa u neho nevyskytuje hexózová represia dýchania. Niektoré druhy skvasujú laktózu a sú súčasťou tzv. kefírových zŕn, t.z. konglomerátu kvasiniek a mliečnych baktérií, pouţívaného pri výrobe kefírov. U Kluveromyces lactis dochádza k spájaniu bezprostredne pred tvorbou askospór. vrecko má väčšinou piškótovitý tvar a spóry sú guľovité aţ elipsoidné (ŠROUBKOVÁ, 1996). 22
3.4. Fermentačné technológie a typy fermentačných procesov 3.4.1. Fermentácie (kvasné procesy) Termín kvasenie prvýkrát pouţil L. Pasteur pre anaeróbny metabolizmus kvasiniek (Saccharomyces cerevisiae) vedúci ku tvorbe etanolu ( kvasenie je ţivot bez kyslíka ). Aj napriek tomu, ţe tento prípad je špecifický, termín sa dodnes pouţíva pre anaeróbne procesy, pri ktorých dochádza ku exkrécii niektorých redukovaných bunkových metabolitov do média, často krát s významným technologickým dosahom. Treba si uvedomiť, ţe v bioinţinierskom ponímaní má termín fermentácie aj iný význam. Označujú sa ním procesy, pri ktorých sa kultivujú mikroorganizmy s definovaným biotechnologickým cieľom. Z biochemického hľadiska je moţné kvasenie dobre definovať a oddeliť od iných anaeróbnych procesov, zachovávajúc pritom ducha pôvodnej Pasteurovej predstavy, ktorá bola biochemicky objasnená o takmer storočie neskôr. Anaeróbne kultivované kvasinky S. cerevisiae strácajú mitochondriálne funkcie, a keďţe nemajú schopnosť anaeróbnej respirácie s niektorým akceptorom elektrónov, musia získavať energiu inak ako pomocou dýchacej reťaze spriahnutej s ATP-syntázou závislou od protónmotívnej sily. Jedinou alternatívou v tomto prípade je syntéza ATP prostredníctvom substrátovej fosforylácie, t.z. dvoch parciálnych reakcií anaeróbnej glykolýzy (fosfoglycerátkináza a pyruvátkináza). Ukázalo sa, ţe i mnohé ďalšie mikroorganizmy patriace medzi Eukaryota a Prokaryota majú schopnosť preţívať v anaeróbnych podmienkach podobným spôsobom. Problém, ktorý sa stáva akútny pri priebehu glykolýzy v anaeróbnych podmienkach, je regenerácia NAD +, ktorého dostatočná koncentrácia je nevyhnutná na priebeh glykolýzy s vysokým metabolickým tokom. Tento problém bunky sa dal odstrániť redukciou niektorých majoritných bunkových metabolitov NADH + H + závislými dehydrogenázami. Produkty tejto redukcie sa transportujú von z buniek, čím sa regeneruje NAD + a umoţní sa ďalší metabolický tok metabolitov glykolytickou dráhou. Podmienkou na takýto scenár je dostupnosť určitého metabolitu a príslušného enzýmového vybavenia. V prípade etanolovej fermentácie v S. cerevisiae ide o pyrohroznan (koncový metabolit glykolýzy) a dva enzýmy dekarboxyláza pyrohroznanu a alkoholdehydrogenáza. Podobný scenár platí aj pre niektoré ţivočíšne bunky, ktoré síce nemôţu ţiť v anaeróbnom reţime, ale čiastkový kyslíkový deficit kompenzujú redukciou pyrohroznanu na mliečnan, ktorý sa transportuje von z buniek (napr. svalové 23
bunky). Etanolová fermentácia S. cerevisiae je najjednoduchším prípadom takého scenára, ktorý je prakticky unikátny, s výnimkou etanolovej fermentácie baktérie Zymomonas mobilis. Tak ako v prírode existuje obrovská mikrobiologická diverzita, existuje aj tomu zodpovedajúca metabolická diverzita, ktorá sa prejavuje aj v anaeróbnych fermentáciách. To platí najmä pre metabolickú diverzitu prokaryotov, ktorá umoţňuje okrem iného aj značnú variabilitu fermentačných reakcií. Celkovo umoţňuje táto diverzita preţitie aj najextrémnejších habitatov Zeme. (HERKSOWITZ, 1988) 3.4.2. Princípy fermentačných technológií Všetky kvasné procesy sú vyvolané mikroorganizmami, presnejšie ich enzýmami. Kvasením si mikroorganizmus opatruje potrebnú energiu k ţivotným pochodom. Metabolizmus je moţné v podstate ovplyvniť uţ nepatrnou zmenou podmienok prostredia. Príkladom môţe byť kultivácia kvasiniek Saccharomyces cerevisiae. Za anaeróbnych podmienok vzniká etanol a oxid uhličitý. Za dokonalého prístupu vzduchu sú tvorené prevaţne aminokyseliny, dochádza k značnej tvorbe kvasiniek a nepatrnej tvorbe etanolu (TVRDOŇ, 1992). Fermentačné (kvasné) technológie sú zaraďované medzi mikrobiálne technológie a ako také sú súčasťou biotechnológií. Spoločným menovateľom týchto technológií je optimálne vyuţitie biologických, chemických a inţinierskych disciplín pri transformácií substrátu. Fermentačné technológie patria medzi klasické technológie, ktoré sa predovšetkým vyvíjali v oblasti potravinárskych výrob. Je treba podotknúť, ţe dnes sú tieto technológie zaloţené na najmodernejších technikách a zariadeniach. Iba hrubý princíp zostáva rovnaký. Okrem výroby fermentovaných nápojov (pivo, víno a nápoje získané destiláciou prekvasených cukorných roztokov) patrí do tejto kategórie výroby i etanol, ktorého pouţitie presahuje rámec potravinárskeho priemyslu. Do mikrobiálnych a pre potravinársky priemysel významných technológií patria i technológie zaloţené na submerzných aeróbnych procesoch, ako je výroba pekárenského droţdia, octu a niekoľko ďalších organických kyselín, ktoré našli uplatnenie v potravinárskom priemysle (kyselina citrónová, mliečna, glukónová a iné). Tak isto intracelulárne a extracelulárne produkty a vlastná biomasa mnohých mikroorganizmov poskytujú moţnosti vyuţitia v potravinárskom priemysle. Napr. výroba enzýmov, lipidov, provitamínov, vitamínov a pod. a rady ďalších látok, napr. biofaktorov, dôleţitých pre výţivu človeka a zvierat a tieţ liečivá, medziprodukty chemických syntéz, 24
počiatočných produktov pre mnoţstvo priemyslových odvetví. Kvasný proces sa týka predovšetkým tých mikrobiálnych pochodov, pri ktorých prebieha kvasenie, t.z. anaeróbne (za neprístupu vzduchu) odbúravanie cukrov za vzniku oxidu uhličitého a niektorého metabolitu. Hlavným predstaviteľom tohto kvasenia je liehové kvasenie, pričom sem môţe patriť aj mliečne kvasenie, alebo maslové kvasenie. Vznikajúce produkty sú väčšinou primárne, čo znamená, ţe sa vytvárajú súčasne s rastom mikroorganizmov a pri základnom energetickom metabolizme mikroorganizmu. Všeobecná schéma mikróbneho procesu zahrňuje: prípravu média prípravu inokula (zákvasu) vlastnú fermentáciu (mikrobiologický pochod, rast buniek a tvorba produktov) oddelenie buniek a ich prípadné spracovanie izoláciu produktu Fermentačný proces nemusí mať všetky uvedené operácie, pretoţe ich voľba závisí od pouţitej suroviny, z ktorej sa pripravuje fermentačné médium, a na vlastnom produkte. Ak sú produktom nápoje, ako je víno, pivo, alebo ocot, odpadá nám väčšina izolačných a purifikačných operácií (je nutné však oddeliť kvasinky, v prípade octu baktérie, od kvasu). Na druhej strane pribudnú operácie spojené zo zušľachtením produktu (dokvášanie, zrenie, a pod.). Zvláštne postavenie pri výrobe má surovina, ktorá určuje podstatnou mierou (spolu s energiou) výrobnú cenu produktu. U produktov, ktoré sa musia z média, alebo z buniek izolovať (enzýmy, vitamíny, antibiotiká, a.i.) sú popri surovine rozhodujúce práve konečné operácie (izolácia a purifikácia produktu). Veľmi závaţným faktorom, ktorý môţe značne ovplyvniť proces fermentácie je mikrobiálna kontaminácia surovín pouţívaných pre prípravu fermentačných médií. Niektoré procesy preto pouţívajú operácie vedúce k značnej redukcii počtu neţiaducich mikroorganizmov. Tepelná sterilizácia, alebo pasterizácia média je jedna z moţností vedúca k zníţeniu počtu neţiaducej mikroflóry (TVRDOŇ, 1992). 25
3.4.3. Typy fermentačných procesov Fermentačné procesy zásadne vyuţívajú produkty katabolických dráh glukózy, ako je glykolýza, pentózový cyklus, Entnerovo-Doudoroffovo odbúranie glukózy. So syntézou ATP sú spojené viaceré reakcie substrátovej fosforylácie, z ktorých reakcia katalyzovaná acetátkinázou je, zdá sa, špecifická pre prokaryoty. Tieto vyţadujú príslušné kinázy. Prvé dve reakcie sa vyskytujú v glykolytickej dráhe. Reakcia C) môţe vyuţiť aj acetylfosfát, ktorý sa tvorí v niektorých fermentačných procesoch vyuţívajúcich reakciu katalyzovanú fosfoketolázou v rodoch Bifidobacterium a Clostridium. (obr. č.2). Obrázok č.2: Reakcie substrátovej fosforylácie, ktoré vedú ku syntéze ATP Vďaka absencii dýchacej reťaze vo fermentačných procesoch sa tieto procesy povaţujú za fylogeneticky starý typ metabolizmu, ktorý sa vyvinul s objavením sa jednoduchých organických látok na Zemi. To, ţe nevyţaduje dýchaciu reťaz neznamená, ţe nevyţaduje ţiadne oxidačno-redukčné reakcie. Nevyţaduje však externý akceptor elektrónov, ani membránové štruktúry, ale uskutočňuje sa bez fázového (membránového) rozhrania. Vyţadujú však určitú prípravnú fázu, v ktorej sa syntetizujú metabolické intermediáty, ktoré 26
sú vhodné na uskutočnenie substrátovej fosforylácie. Substrátom na fermentačné reakcie je spravidla glukóza, prípadne iné sacharidy, len v obmedzenej miere iné substráty, napr. aminokyseliny. Ako prípravné fázy slúţia, veľké katabolické dráhy. Z hľadiska produktov fermentácií, ktoré opúšťajú fermentujúce bunky, rozdeľujeme fermentačné procesy na homofermentačné (vzniká jeden majoritný produkt) a heterofermentačné (vzniká viac fermentačných produktov). (VOET, D., VOET, J,1995) Homofermentačné dráhy: Patrí sem etanolová fermentácia a mliečnanová fermentácia. Obe fermentačné dráhy sú odvodené od glykolýzy a líšia sa len konverziou kyseliny pyrohroznovej na špecifické produkty. Kým etanolová fermentácia je charakteristická pre kvasinky S. cerevisiae, mliečnanová fermentácia je typická pre bakteriálny rod Lactobacillus. Dráha poskytuje dva mol ATP a NADH + H + a po dva mol koncového produktu na mol glukózy, ktorá je substrátom pre túto dráhu. (obr. č.3). Obrázok č.3: Glykolytická (Embden-Meyerhofova) dráha mliečnanovej (a) a etanolovej (b) fermentácie. Kľúčové enzýmy, ktoré určujú tvorbu produktu, sú dehydrogenáza mliečnanu v Lactobacillus spp. a dekarboxyláza pyrohroznanu a alkoholdehydrogenáza v Saccharomyces. 27
Mliečnanovú fermentáciu sú okrem rodov Lactobacillus schopné uskutočňovať rody Lactococcus a niektoré druhy rodu Streptococcus, ktoré sú nazývané aj baktériami mliečneho kysnutia. Tieto baktérie sa vyuţívajú na fermentovanie mlieka a mliečnych produktov, ako sú jogurt, kefír, kyslá smotana a sú príčinou kysnutia mlieka a tvarohu. Slúţia tieţ na prípravu ďalších mliečnych výrobkov. Etanolová fermentácia v S. cerevisiae je historicky veľmi dobre známa a je masovo vyuţívaná v malých i veľkých technologických rámcoch, kde mala historicky bezkonkurenčnú pozíciu. V poslednom čase sa vyuţíva aj etanolová fermentácia v gramnegatívnej fakultatívne anaeróbnej baktérií Zymomonas mobilis. Tento typ fermentácie prebieha iným mechanizmom. Namiesto glykolytickej dráhy je vyuţívaná Entnerova-Doudoroffova dráha (obr.č.4). Táto dráha poskytuje 1 mol ATP, ako aj po 1 mol NADH + H + a NADPH + H + a 2 mol etanolu na mol glukózy. Okrem etanolu tieto baktérie produkujú v malom mnoţstve vedľajšie produkty fermentácie, napr. sorbitol, acetoín, glycerol, mliečnan a kyselinu octovú, čo zniţuje účinnosť produkcie etanolu. Časť sacharidu tieţ premenia na homopolysacharid levan, ktorý pozostáva z fruktózy viazanej β-2,6-glykozidovou väzbou. (BOWIEN, B., SCHELEGEL, H.G, 1981) Obrázok č.4: Produkcia etanolu prostredníctvom Entnerovej-Doudoroffovej dráhy 28
Kľúčový enzým v Entnerovej-Doudoroffovej dráhe je oxidácia Glc-6-P na 2-keto-3- deoxy-6-fosfoglukónovú kyselinu (KDPG), ktorá je štiepená enzýmom KDPG aldolázou na pyrohroznan a glyceraldehyd-3-fosfát. Ten môţe vstúpiť do glykolýzy a je oxidovaný aţ na pyrohroznan spojený s produkciou 2 mol ATP. Pyrohroznan sa mení na etanol podobne ako v kvasinkách. (BLACK, J.G, 1993) 3.5. Kultivácia mikroorganizmov Pre rast mikroorganizmov a pre tvorbu nimi vytváraných produktov je treba zaistiť vhodné podmienky (zloţenie média, ph, teplota, oxidačno-redukčný potenciál, určitý parciálny tlak kyslíka v médiu a iné). Mikroorganizmy musia mať pre svoju činnosť k dispozícií okrem uhlíku taktieţ zdroje dusíku, fosforu a ďalších biogénnych prvkov, špecifické rastové faktory ako sú napr. vitamíny, aminokyseliny, minerálne látky a pod., ktoré si mikroorganizmus nemôţe sám syntetizovať. Mikroorganizmy prijímajú z prostredia ţiviny a vyuţívajú ich pre svoj rast. Pre biosyntetické pochody musia mať mikroorganizmy zaistený dostatočný prívod ţivín a energie, čo sa zabezpečí vhodným dávkovaním energetických substrátov, ktoré sú väčšinou i zdrojom uhlíka, pre výstavbu energeticky bohatých zlúčenín a ţivín. Energetika a látková výmena spolu úzko súvisia.(rychtera, 2005). 3.5.1. Statická kultivácia baktérií Pri statickej kultivácií baktérií rastú baktérie v prostredí, ktorého vlastnosti a zloţenie sa menia v závislosti na ţivotnej činnosti bakteriálnych buniek. Mnoţenie tu nemá trvalo vzostupnú tendenciu. Napokon prebieha v charakteristických fázach vzostupu a poklesu. Pretoţe bunky (vrátane metabolických produktov) zostávajú po celú dobu kultivácie v prostredí, je systém baktéria prostredie charakterizovaný ako systém uzatvorený. Faktory limitujúce rast sú podmienené zmenami prostredia vyvolanými samotnými baktériami. Medzi ne patria predovšetkým vyčerpanie ţivín a nahromadenie odpadných produktov metabolizmu, ktoré vedú postupne k zastaveniu rastu a k odumieraniu buniek (HOĎÁK, 1979). 3.5.2. Submerzný spôsob kultivácie baktérií Dokonalejšieho vyuţitia ţivín a preto tieţ intenzívnejšieho mnoţenia môţeme dosiahnuť pri statickej kultivácií v prípade, ţe sa pestovaná kultúra premiešava alebo prevzdušňuje. Je to tzv. submerzný spôsob pestovania baktérií. Uplatňuje sa hlavne v oblasti priemyslovej mikrobiológie zameranej na získanie niektorých hospodársky dôleţitých látok, 29
vrátane antibiotík, pomocou mikroorganizmov. Avšak i táto zdokonalená metóda predstavuje v podstate uzatvorený systém (HOĎÁK, 1979). Z priemyselného hľadiska sa mikróbne procesy delia na: 1. Procesy závislé od prostredia: Prebiehajú buď v homogénnom alebo v heterogénnom prostredí. V skutočnosti však nikdy o ideálnom homogénnom prostredí nemôţeme hovoriť, pretoţe uţ i prítomnosť mikroorganizmov to vylučuje. Kultivácia, ktorá sa vyznačuje dobrým premiešavaním kvapalného média sa vo fermentačnej technológií nazýva submerzná kultivácia. V priemysle sa veľmi často stretávame práve zo systémami submerznými, ktoré by sa mali riešiť ako systémy s neideálnym miešaním. I homogénna fermentácia neprebieha obvykle iba v jednej fáze, pretoţe plynná fáza je väčšinou prítomná (vzduch, oxid uhličitý, metán, niekedy vodík). Fermentácia v dvoj- aţ trojfázovom systéme, kde prevládajú tuhé väčšie častice je príkladom heterogénnej sústavy, ktorá je častá v ekologických jednotkách (komposty, biologické filtre a pod.) a pri aplikácií imobilizovaných biologických systémov (napr. klasická ocotnica). Tento typ kultivácie sa môţe vyskytnúť aj ako tzv. kultivácia povrchová, pri ktorej mikroorganizmus môţe rásť i na povrchu kvapalného média (povrchový spôsob výroby kyseliny citrónovej). 2. Procesy závislé od kyslíku: Procesy vyţadujúce prídavok kyslíka (nazývajú sa aeróbne), alebo procesy pri ktorých je prídavok kyslíka neţiaduci (tieto procesy sa nazývajú anaeróbne). Nie všetky pochody sú prísne aeróbne, alebo prísne anaeróbne. Rada anaeróbnych pochodov sa musí prevádzať i s občasným miernym prevetrávaním. Toto všetko je vlastne určované mikroorganizmom a jeho metabolizmom. Typickým príkladom je najznámejší mikroorganizmus, kvasinka Saccharomyces cerevisiae, od ktorej sa odvodzujú kmene vinárskych, pivovarníckych a liehovarníckych kvasiniek. Je známe, ţe tieto kvasinky prevádzajú liehové kvasenie i pri nízkom parciálnom tlaku kyslíka. S kultiváciou týchto kvasiniek za aeróbnych podmienok a v limite sacharidov sa stretávame pri výrobe pekárenského droţdia. 3. Procesy závislé od morfologickej charakteristiky mikroorganizmu: Rozlišujúcim znakom je morfologická charakteristika pouţívaného mikroorganizmu. Nejedná sa iba o záleţitosť mikrobiologickú a teda i technologickú, 30
ale morfológia mikroorganizmu ovplyvní celú radu jednotkových operácií zaloţených na veľkosti a tvare mikroorganizmu. Veľkosť mikrobiálnych buniek sa líši podľa typu mikroorganizmu. Rozmer bakteriálnych buniek sa pohybuje okolo 1 μm, u kvasiniek môţe byť najdlhší rozmer okolo 20 μm. Plesne tvoriace často dlhé a rozvetvené vlákna môţu dosiahnuť dĺţky i niekoľko milimetrov. Kultivačné zariadenie a i vlastná kultivácia u jednobunkových mikroorganizmov sa v zásade nelíši, a tak sa baktérie a kvasinky kultivujú podobným spôsobom. Rozdiel bude určený iba metabolizmom a teda druhom produktu. Vláknité mikroorganizmy (plesne a aktinomycéty) sa musia kultivovať veľmi šetrne, aby pri pouţití mechanického miešania neprišlo k porušeniu vlákien a tým i k zmenám metabolizmu. Podstatné rozdiely v tvare a veľkosti mikroorganizmov sú však určujúcimi faktormi pre procesy separačné. 4. Procesy závislé od časového postupu: Všetky fermentačné procesy môţeme ďalej členiť na kontinuálne a diskontinuálne. Správne pouţitie jedného, alebo druhého spôsobu môţe značne rozhodnúť o ekonomike procesu (produktivita kontinuálnych systémov býva vyššia, naopak kontinuálne procesy však vyţadujú značné náklady na sterilitu zariadení a všetkých médií). (RYCHTERA, 2005) 3.6. Rast mikroorganizmov 3.6.1. Rastová krivka Ak sa nachádzajú jednobunkové organizmy v prostredí s vhodným nutričným zloţením a s vyhovujúcimi fyzikálnymi podmienkami, potom rastú a mnoţia sa. Reprodukcia bunky je totoţná s reprodukciou jedinca. Pre popísanie mikrobiálneho procesu je potreba previesť kinetické štúdie. Tie sa zaoberajú rýchlosťou produkcie buniek, alebo ich metabolitov a tak tieţ zaznamenáva vplyvy rôznych faktorov, ktoré pôsobia na tieto rýchlosti. Rastom sa rozumie zvýšenie mnoţstva (hmoty) protoplazmy v kultúre. Mnoţením sa potom rozumie zvýšenie počtu buniek. Veľkosť buniek sa v priebehu kultivácie značne mení, a preto môţeme predpokladať, ţe rast a mnoţenie nebude prebiehať rovnakou rýchlosťou. Ak vynesieme do 31
grafu zistený počet buniek, alebo koncentráciu biomasy v závislosti na čase, získame rastovú krivku (KOMPRDA, 2004). Fázy rastovej krivky: 1. Lag-fáza: obdobie prispôsobovania naočkovaných buniek novému prostrediu. Počet ţivých buniek obvykle klesá. Dĺţka tejto fázy je daná troma procesmi. Prestavbou bunky kľudovej v bunku exponenciálne rastúcu, adaptáciu bunky na nové prostredie a úpravou nového prostredia činnosťou bunky. Všetky tieto faktory sa môţu samozrejme kombinovať. Dĺţka lag-fázy nie je v ţiadnom vzťahu k ostatným fázam rastu. Dĺţka lag-fázy závisí na druhu mikroorganizmu, fyziologickom stave buniek, veľkosti inokula (je k nemu nepriamo úmerná) a od zloţenia nového rastového prostredia. Ak rastové prostredie obsahuje ţiviny vyhovujúce iba malému podielu inokula (t.z. určitému typu mutantov), trvá lag-fáza mimoriadne dlho, resp. zahrňuje tieţ selekciu týchto mutantov a odumieranie ostatných buniek inokula (ŠILHÁNKOVÁ, 1995). 2. Fáza zrýchlenia(akceleračná fáza): Bunky sa začínajú mnoţiť a rýchlosť mnoţenia stúpa. 3. Exponenciálna fáza: Počet buniek rastie exponenciálne s časom. Exponenciálna fáza je charakteristická tým, ţe tu bunky majú najkratšiu generačnú dobu, ktorá je počas celej exponenciálnej fázy konštantná. Ak prenesieme bunky do nového kultivačného média rovnakého zloţenia, pokračujú v rozmnoţovaní s rovnakou generačnou dobou, t.z. bez zreteľnej lag-fázy. Spomalenie rozmnoţovania na konci exponenciálnej fáze rastu, prípadne jeho úplne zastavenie môţe byť spôsobené jednak vznikom splodín metabolizmu, ktoré inhibujú rozmnoţovanie, jednak vyčerpaním ţivín. Najčastejšie ide o vyčerpanie tej ţiviny, ktorá je prítomná v relatívne najniţšej koncentrácií. (ŠILHÁNKOVÁ, 1995). 4. Fáza spomaleného rastu: Nastáva po exponenciálnej fáze, ktorej trvanie je väčšinou veľmi krátke 5. Stacionárna fáza: Rýchlosť mnoţenia je v rovnováhe s rýchlosťou odumierania. Má to dve hlavné príčiny. Jednak je to vyčerpanie jednej zo ţivín, a potom je to nahromadenie toxických splodín metabolizmu. 6. Fáza odumierania: Príčinou je deštrukčné pôsobenie fyzikálnych a chemických faktorov na chemické skupiny, či väzby makromolekúl. Deštrukčné procesy prevládnu nad procesmi opravnými. 32
Obrázok č. 5: Rastová krivka: x počet ţivých buniek v 1 ml, 1 lag-fáza, 2 fáza zrýchleného rastu, 3 exponenciálna fáza, 4 fáza spomaleného rastu, 5 stacionárna fáza, 6 fáza odumierania (HUDECOVÁ, ŠIMKOVIČ 2009) 3.7. Syntéza enzýmov počas rastu baktérií Počas rastu baktérií dochádza k zmenám enzymatického aparátu buniek. S počiatkom rastu je spojená maximálna tvorba a aktivita enzýmov, ktoré katalyzujú predovšetkým procesy biosyntézy. Patria k nim napr. endoenzými typu proteináz a amyláz a niektoré enzýmy, ktoré sa zúčastňujú primárnych procesov premeny glycidov. Tieto enzýmy katalyzujú v prvom rade biosyntézu bunkových zloţiek v dobe intenzívneho rastu bakteriálnej kultúry. U iných enzýmov, sú naproti tomu, tvorba i maximum katalytického pôsobenia posunuté do obdobia končiaceho rastu. Týchto enzýmov je väčšina, patria k nim hlavne deaminázy, exogénne amylázy a proteinázy. Ich funkcia spočíva hlavne v katalyzovaní procesov, ktoré sa zúčastňujú rozkladu (HOĎÁK, 1979). 33
4. MATERIÁL A METODIKA Nasledujúca kapitola práce sa venuje praktickej časti, ktorej súčasťou bolo porovnanie chemického zloţenia mikrovzorkov kvasených pomocou kvasiniek Saccharomyces cerevisiae a baktérií Zymomonas mobilis. Tak isto sa sledoval priebeh kvasenia (gravimetricky). Vykonali sa základné analytické rozbory a stanovili sa jednotlivé organické kyseliny metódou kvapalinovej chromatografie HPLC. Tento pokus bol vykonaný v roku 2012. 4.1. Popis stanovišťa, odroda Popis stanovišťa: Po klimatickej stránke patrí územie do teplej oblasti, časti teplého a suchého počasia, s miernou zimou a mierne kratším slnečným svitom. Priebeh zráţok počas roku je normálny s maximom v júli a minimom vo februári. Za vegetačné obdobie spadne 323 mm, tj. 61% ročného úhrnu. Teplota vzduchu 10 C a viac nastupuje 19. apríla a končí 10. októbra, trvá teda 175 dní. Územie má celkovú priemernú nadmorskú výšku okolo 180 m a vyznačuje sa jednoduchými geologickými pomermi. Ide o územie geologicky mladé, v ktorom sa nachádzajú prevaţne štvrťohorné sedimenty pleistocenné a holocenné. Veľká časť územia je pokrytá sprašovými usadeninami o rôznej mocnosti. Na sprašových pokryvoch sa v miestnych podmienkach vyvíjajú prevaţne černozeme.(vyhláška MINISTERSTVA ZEMĚDĚLSTVÍ, 1998) 4.1.1. Popis odrody Malverina Synonymum: BV-19-143 Pôvod odrody: Jedná sa o českú odrodu vyšľachtenú M. Michlovským a kol., kríţením odrôd Rakiš ( Villard blanc x Veltlínske červené skoré ) x Merlan ( Merlot x Siebel 13 666 ). V registrácií je od roku 2001. Charakteristika: List je stredne veľký, hladký, zospodu lysý, mierne päťlaločnatý. Bazálny výkrojok je lýrovitý, ľahko prekrytý. Stopka je stredné dlhá, načervenalá. 34
Strapec: Stredne veľký, kuţelovitý, stredne hustý. Priemerná hmotnosť strapca je 136 g. Bobuľa je menšia aţ stredne veľká, guľatá, ruţovo šedej farby. Duţina je riedka, odrodovej chute. Odroda: Bujne rastúca s hustým olistením. Raší i kvitne stredne skoro, dozrieva na prelome septembra a októbra. Odolnosť voči hubovitým chorobám je dobrá, zvlášť k plesni šedej. Plodnosť je vysoká 10 15 t.ha -1, cukornatosť v mušte je 17 22 NM, obsah kyselín je 8-11 g.l -1. Vhodná pre väčšinu typov vedenia, znáša dobre dlhý i krátky rez. Vhodná pre podpníky typu SO 4, CR 2, KOBER 125 AA a LE-K1. Víno má príjemne, odrodovo, ľahkú aromatickú vôňu, je plné, extraktívne a harmonické s jemnými kyselinkami a príjemnou miernou horčinkou na konci chuti. (SOTOLÁŘ, 2006) 4.2. Príprava vzoriek Hrozno odrody Malverina som mal zabezpečené v školskom ampelografickom vinohrade v areáli Mendelea v Lednici. Hrozno odrody Malverina bolo zozbierané dňa 17.10. 2012. Hrozno sa prostredníctvom mlynko-odzrňovača odstopkovalo a takto mechanicky narušené bobule sa v ten istý deň ešte nechali naleţať počas noci v pneumatickom lise v školskej pivnici, kde uţ prebiehala ďalšia časť môjho pokusu. Z odobraného rmutu sa zmerala cukornatosť, ktorá predstavovala 21,5 NM, ph muštu bolo 3,14, kyseliny predstavovali hodnotu 8,24 g.l -1 a asimilovateľný dusík predstavoval hodnotu 246 mg.l -1 Na druhý deň t.z. 18.10.2012 sa hrozno vylisovalo na pneumatickom lise. Vylisovaný mušt sa nechal ešte jeden deň spontánne odkaliť. Dňa 19.10.2012 sa z čistého podielu odobral do troch, desať litrových demiţónov mušt. Do takto pripravených demiţónov sa pridal zákvas baktérií Zymomonas mobilis (demiţón č.1), Zymomonas pomaceae (demiţón č.2) a kvasinky Saccharomyces cerevisiae (demiţón č.3). Následne sa vzorky presunuli do mikrobiologického laboratória kvôli vyššej teplote a optimálnemu začiatku kvasenia. 35
4.3. Metódy stanovenia 4.3.1. Sledovanie priebehu kvasenia mikrovzoriek (gravimetricky) Najskôr sa pripravilo šesť mikrovzoriek, kaţdá o objeme 0,2 l muštu a 3 ml zákvasu, rozdelili sa po troch, do ktorých boli opäť pridané baktérie Zymomonas mobilis (mikrovzorka č.1), Zymomonas pomaceae (mikrovzorka č.2) a kvasinky Saccharomyces cerevisiae (mikrovzorka č.3). Týmto nám vznikli dve skupiny po troch mikrovzorkách, ktoré sa uskladnili počas celého priebehu kvasenia v dvoch chladničkách, ktoré mali rozdielnu teplotu. V jednej variante sa sledoval gravimetrický priebeh kvasenia pri teplote 25 C a v druhej variante sa sledoval gravimetrický priebeh kvasenia pri teplote 16 C. Kaţdé tri dni sa odváţila kaţdá z mikrovzoriek, na analytických váhach. (viď graf č.1 a graf č.2) Priebeh kvasenia: Kvasenie v demiţónoch prebiehalo aţ pokiaľ sa gravimetrické hodnoty v mikrovzorkoch nezniţovali, to znamená, ţe sa zastavilo zniţovanie hmotnosti kaţdej mikrovzorky. Po 35 dňoch od začiatku kvasenia sa zasírili vzorky demiţónov. Po 45 dňoch sa vzorky demiţónov stočili do troch, šesť litrových demiţónov, ktoré boli opäť zasírené a následne presunuté do školskej pivnice pre chladnejšie podmienky. 4.3.2. Stanovenie voľného oxidu siričitého titráciou odmerným roztokom jódu Princíp: Odmerný roztok jódu oxiduje priamo s voľným oxidom siričitým obsiahnutým vo víne, prípadne po uvoľnení oxidu siričitého z väzieb s karbonylovými zlúčeninami v alkoholickom prostredí súčasne i viazaný oxid siričitý vína (BALÍK, J. 2006). Prístroje a pomôcky: 250 alebo 500 ml kónická banka, 50 ml pipeta, 10 a 25 ml odmerná banka, 25 ml byreta. Chemikálie a roztoky: 0,02 mol.l -1 roztok jódu, 1 mol.l -1 roztok NaOH, 0,5 % škrobový maz, 16 % roztok H 2 SO 4. Postup: Do kónickej 250 ml banky bolo pipetou odmerané 50 ml testovaného vína (muštu) tak, ţe pipeta sa stále dotýkala dna banky. Ihneď bolo pridané 10 ml 16 % roztoku kyseliny sírovej 36
a asi 5 ml 0,5 % škrobového mazu a okamţite titrované 0,02 mol.l -1 modrého sfarbenia, ktoré vydrţalo 30 sekúnd. roztokom jódu do Vyhodnotenie: x = a. f. 12,8 x = mg.l -1 voľného oxidu siričitého vyjadrené v celých číslach a = spotreba 0,02 mol.l -1 roztoku jódu na voľný oxid siričitý f = faktor 0,02 mol.l -1 roztoku jódu Zymomonas mobilis subsp. Pomaceae 0,2 x 0,9698 x 12,8 = 2,48 mg.l -1 Zymomon mobilis subsp. Mobilis 0,3 x 0,9698 x 12,8 = 3,72 mg.l -1 Saccharomyces cerevisiae 0,3 x 0,9698 x 12,8 = 3,72 mg.l -1 4.3.3. Spektofotometrické stanovenie kyselín a cukrov Postup: Vzorky muštu boli odstredené (3000 x g; 6 min) a riedené 10x demineralizovanou vodou. Vzorky vína boli najskôr 20 minút pretrepané zo zmesou PVPP a aktívneho uhlia (pomer 1:1; dávka 40mg/ ml vína), po odstredení riedené 10x demineralizovanou vodou. Inštrumentácia: Binárny vysokotlakový systém Shimadzu LC-10A Systém controler: SCL-10Avp 2 pumpy: LC-10ADvp Kolónový termostat s manuálnym nástrekovým ventilom Rheodyne: CTO-10ACvp DAD detektor: SPD-M10Avp Software: LCsolution Podmienky separácie: Kolóna: Watrex Polymer IEX H form 10 μm; 250 x 8 mm + 10 x 8 mm Teplota separácie: 60 C Objem nástreku vzorku: 20 ul Prietok mobilnej fázy: 0.75 ml/min Isokratická eluácia 37
Mobilná fáza: 2 mm H 2 SO 4 Detekcia: Sacharidy: 190 mn Kyseliny: 210 mn. 4.4. Senzorická analýza Súčasťou práce bolo i senzorické hodnotenie troch vzoriek, pretoţe práve vzhľad, vôňa a chuť rozhodujú o kvalite vína. Chemické rozbory nám veľa napovedia, avšak to, ako konzumentovi chutí, je pre neho rozhodujúce. Senzorická analýza bola prevedená dňa 15. februára 2013 na Ústave vinohradníctva a vinárstva záhradníckej fakulty v Lednici. Vzorka pre degustáciu sa podávala po 25 ml. Odzátkovanie fliaš prebehlo pribliţne 30 minút pred vlastnou degustáciou. K dispozícií bol na zneutralizovanie chuti pripravený čerstvý chlieb a jemne perlivá pramenitá voda. Vzorky boli hodnotené z degustačných pohárov z priehľadného skla. Pre senzorickú analýzu bol pouţitý stobodový systém hodnotenia. Pri často pouţívanom dvadsaťbodovom systéme sa víno hodnotí na desatiny bodu, kedy dvadsať bodov je maximum. Pri stobodovom hodnotení sa hodnotí na celé body s maximom sto bodov. Degustačnú komisiu tvorilo sedem členov, ktorí prideľovali vzorkám body podľa tabuľky (viď. tabuľka č.1). 1. Bc. Dušan Durdovanský, 2. Bc. Leoš Jakubec, 3. Bc. Lukáš Krasňanský, 4. Bc. Ľubomír Miklovič, 5. Bc. Marek Rariga, 6. Bc. Matej Tlačík, 7. Bc. Tomáš Tureček Tabuľka č.1: Tabuľka, podľa ktorej sa prideľujú body vzorke pri stobodovom hodnotiacom Vzhľad Vôňa Chuť systéme vynikajúce veľmi dobré dobré uspokojujúce neuspokojujúce čírosť 5 4 3 2 1 farba 10 8 6 4 2 intenzita 8 7 6 4 2 čistota 6 5 4 3 2 harmónia 16 14 12 10 8 intenzita 8 7 6 4 2 čistota 6 5 4 3 2 harmónia 22 19 16 13 10 perzistencia 8 7 6 5 4 Celkový dojem 11 10 9 8 7 38
Ak sa spočítajú body v poslednom stĺpci (40 b.), zistí sa určitá slabina, pretoţe 100 bodová stupnica má iba 60 bodov. To platí skôr teoreticky. V praxi sa totiţ body pod 60 dávajú iba veľmi zriedka a pod 50 bodov uţ vôbec nie. To znamená, ţe vzorka je zlá, úplne sa vyradí a neboduje. Podľa počtu bodov sa potom určuje kvalita vína. Stupnica sa na rôznych súťaţiach môţe trochu odlišovať. Stupnicu ohodnotenia vína určuje tabuľka č. 2. Tabuľka č.2: Bodové ohodnotenie vína Body Kvalita vína podľa bodového hodnotenia 90-100 Mimoriadne víno 85-89 Vynikajúce víno 80-84 Veľmi dobré víno 75-79 Dobré víno 70-74 Priemerné víno 62-69 Slabý priemer Pod 61 Nevyhovujúce víno Ako u kaţdej senzorickej analýze vína sa najskôr hodnotí vzhľad. U vína sa u vzhľadu hodnotí čírosť a farba. Nasleduje vôňa, kde sa hodnotí intenzita, čistota a harmónia. Ako posledné sa hodnotí chuť, kde sa posudzuje jej intenzita, čistota, harmónia a perzistencia. V celkovom hodnotení sa spravil priemer bodového ohodnotenia jednotlivých degustátorov. U kaţdého vzorku sa zanedbávajú najvyššie a najniţšie ohodnotenia (v tabuľke zvýraznené). Priemer bodového hodnotenia sa následne zaokrúhli na celé číslo, takţe konečný počet bodov daného vína charakterizuje posledný stĺpec tabuľky č. 5. 39
5. VÝSLEDKY 5.1. Gravimetrické sledovanie priebehu kvasenia Gravimetrické sledovanie mikrovzoriek pri teplote 16 C Najväčší hmotnostný úbytok pri variante 16 C nastal pri Saccharomyces cerevisiae, 29.10.2012, to znamená po šiestich dňoch od začiatku kvasenia. Presný hmotnostný úbytok predstavoval hodnotu 9,10 mg. Pri Zymomonas mobilis, nastal najväčší rozdiel 29.10.2012, to znamená po šiestich dňoch od začiatku kvasenia a presný hmotnostný úbytok predstavoval hodnotu 3,90 mg. U Zymomonas pomaceae, podobne ako u predchádzajúcich variantov nastal najväčší rozdiel 29.10.2012, to znamená po šiestich dňoch od začiatku kvasenia. Presný hmotnostný úbytok predstavoval hodnotu 3,00 mg. (viď. graf č.1 a tabuľka č.3) Tabuľka č. 3: Gravimetrické sledovanie mikrovzoriek pri 16 C DÁTUM var.1 (16 ⁰C) Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis Zymomonas pomaceae 23.10.2012 424,1 mg 410,1 mg 408,3 mg 24.10.2012 423,8 mg 410,0 mg 408,3 mg 26.10.2012 419,6 mg 408,2 mg 407,0 mg 29.10.2012 410,5 mg 404,3 mg 404,0 mg 31.10.2012 407,0 mg 402,4 mg 402,2 mg 2.11.2012 405,4 mg 401,1 mg 400,8 mg 5.11.2012 404,4 mg 399,4 mg 398,7 mg 7.11.2012 404,2 mg 398,6 mg 397,5 mg 9.11.2012 404,1 mg 397,5 mg 396,7 mg 12.11.2012 404,0 mg 396,8 mg 395,1 mg 14.11.2012 403,9 mg 396,2 mg 394,3 mg 16.11.2012 403,8 mg 394,6 mg 392,3 mg 19.11.2012 403,7 mg 393,4 mg 391,0 mg 21.11.2012 403,7 mg 393,0 mg 390,6 mg 23.11.2012 403,6 mg 392,0 mg 389,6 mg 26.11.2012 403,6 mg 391,8 mg 389,4 mg 28.11.2012 403,5 mg 391,1 mg 388,8 mg 30.11.2012 403,5 mg 390,9 mg 388,5 mg Rozdiel 20,6 mg 19,2 mg 19,8 mg 40
Graf č. 1: Hmotnostný úbytok pri variante 16 C Gravimetrické sledovanie mikrovzoriek pri teplote 25 C Najväčší hmotnostný úbytok pri variante 25 C nastal pri Saccharomyces cerevisiae, 29.10.2012 to znamená po šiestich dňoch od začiatku kvasenia. Presný hmotnostný úbytok predstavoval hodnotu 15,30 mg. Naopak pri Zymomonas mobilis, nastal najväčší rozdiel 26.10.2012, to znamená uţ po troch dňoch od začiatku kvasenia. Presný hmotnostný úbytok predstavoval hodnotu 9,20 mg. U Zymomonas pomaceae, podobne ako u predchádzajúceho Zymomonas mobilis, nastala najväčšia zmena hmotnosti 26.10.2012, to znamená po troch dňoch od začiatku kvasenia. Presný hmotnostný úbytok predstavoval hodnotu 6,40 mg. (viď. graf č.2 a tabuľka č.4) 41
Tabuľka č. 4: Gravimetrické sledovanie mikrovzoriek pri 25 C DÁTUM var.2 (25 ⁰C) Saccharomyces cerevisiae Zymomonas mobilis Zymomonas pomaceae 23.10.2012 401,9 mg 419,3 mg 434,2 mg 24.10.2012 401,9 mg 417,5 mg 433,4 mg 26.10.2012 400,9 mg 408,3 mg 427,0 mg 29.10.2012 385,6 mg 402,3 mg 421,3 mg 31.10.2012 382,3 mg 400,5 mg 419,0 mg 2.11.2012 381,5 mg 399,7 mg 417,6 mg 5.11.2012 381,3 mg 399,1 mg 415,8 mg 7.11.2012 381,2 mg 398,9 mg 415,1 mg 9.11.2012 381,1 mg 398,8 mg 414,4 mg 12.11.2012 381,1 mg 398,7 mg 414,0 mg 14.11.2012 381,0 mg 398,6 mg 413,6 mg 16.11.2012 380,8 mg 398,4 mg 413,1 mg 19.11.2012 380,7 mg 398,2 mg 412,9 mg 21.11.2012 380,7 mg 398,2 mg 412,9 mg 23.11.2012 380,7 mg 398,2 mg 412,8 mg 26.11.2012 380,6 mg 398,1 mg 412,8 mg 28.11.2012 380,5 mg 398 mg 412,6 mg 30.11.2012 380,4 mg 397,9 mg 412,5 mg Rozdiel 21,5 mg 21,4 mg 21,7 mg Graf č. 2: Hmotnostný úbytok pri variante 25 C 42
Celkový gravimetrický úbytok hmotnosti pri variante 16 C Najväčší celkový úbytok hmotnosti počas celej doby kvasenia dosiahla varianta zakvasená kvasinkami Saccharomyces cerevisiae 20,6 mg. Nasledovala varianta zakvasená baktériou Zymomonas pomaceae, ktorej celkový dosiahnutý hmotnostný úbytok predstavoval 19,8 mg. Najmenší hmotnostný úbytok dosiahla varianta zakvasená baktériou Zymomonas mobilis, ktorej celková hodnota úbytku predstavovala 19,2 mg. (viď. graf č. 3) Graf č. 3: Celkový hmotnostný úbytok pri variante 16 C Celkový gravimetrický úbytok hmotnosti pri variante 25 C Najväčší celkový hmotnostný úbytok hmotnosti, počas celej doby kvasenia, dosiahla varianta zakvasená baktériou Zymomonas pomaceae 21,7 mg. Nasledovala varianta zakvasená kvasinkami Saccharomyces cerevisiae, ktorej celkový dosiahnutý hmotnostný úbytok predstavoval 21,5 mg. Najmenší hmotnostný úbytok dosiahla varianta zakvasená baktériou Zymomonas mobilis, ktorej celková hodnota úbytku predstavovala 21,4 mg. (viď. graf č. 4) 43
Graf č. 4: Celkový hmotnostný úbytok pri variante 25 C 5.2. Sledované hodnoty u jednotlivých variantou Graf č.5: Jednotlivé hodnoty u Zymomonas mobilis v g.l -1 44
Graf č. 6: Jednotlivé hodnoty u Zymomonas pomaceae v g.l -1 Graf č. 7: Jednotlivé hodnoty u Saccharomyces cerevisiae v g.l -1 45
5.3. Jednotlivé organické kyseliny V prípade Zymomonas mobilis boli vyhodnotené hodnoty jednotlivých organických kyselín nasledovne (viď. graf č. 8): hodnota kyseliny vínnej predstavovala 4,00 g.l -1 hodnota kyseliny mliečnej predstavovala 1,24 g.l -1 hodnota kyseliny citrónovej predstavovala 0,28 g.l -1 hodnota kyseliny octovej predstavovala 0,38 g.l -1 hodnota kyseliny jantárovej predstavovala 0,50 g.l -1 hodnota kyseliny D-jablčnej predstavovala 0,00 g.l -1 hodnota kyseliny L-jablčnej predstavovala 0,00 g.l -1 V prípade Zymomonas pomaceae boli vyhodnotené hodnoty jednotlivých organických kyselín nasledovne (viď. graf č. 8): hodnota kyseliny vínnej predstavovala 4,02 g.l -1 hodnota kyseliny mliečnej predstavovala 1,12 g.l -1 hodnota kyseliny citrónovej predstavovala 0,25 g.l -1 hodnota kyseliny octovej predstavovala 0,33 g.l -1 hodnota kyseliny jantárovej predstavovala 0,60 g.l -1 hodnota kyseliny D-jablčnej predstavovala 0,00 g.l -1 hodnota kyseliny L-jablčnej predstavovala 0,00 g.l -1 46
V prípade Saccharomyces cerevisiae boli vyhodnotené hodnoty jednotlivých organických kyselín nasledovne (viď. graf č. 8): hodnota kyseliny vínnej predstavovala 3,78 g.l -1 hodnota kyseliny mliečnej predstavovala 1,22 g.l -1 hodnota kyseliny citrónovej predstavovala 0,29 g.l -1 hodnota kyseliny octovej predstavovala 0,21 g.l -1 hodnota kyseliny jantárovej predstavovala 0,70 g.l -1 hodnota kyseliny D-jablčnej predstavovala 0,00 g.l -1 hodnota kyseliny L-jablčnej predstavovala 0,00 g.l -1 Graf č. 8: Porovnanie hodnôt organických kyselín u jednotlivých variantov v g.l -1 47
5.4. Jednotlivé cukry V prípade Zymomonas mobilis boli vyhodnotené hodnoty jednotlivých cukrov nasledovne (viď. graf č. 9): hodnota glukózy predstavovala 3,61 g.l -1 hodnota fruktózy predstavovala 26,91 g.l -1 hodnota skvasiteľných cukrov predstavovala 30,50 g.l -1 V prípade Zymomonas pomaceae boli vyhodnotené hodnoty jednotlivých cukrov nasledovne (viď. graf č. 9): hodnota glukózy predstavovala 5,52 g.l -1 hodnota fruktózy predstavovala 31,70 g.l -1 hodnota skvasiteľných cukrov predstavovala 37,20 g.l -1 V prípade Saccharomyces cerevisiae boli vyhodnotené hodnoty jednotlivých cukrov nasledovne (viď. graf č. 9): hodnota glukózy predstavovala 0,00 g.l -1 hodnota fruktózy predstavovala 0,35 g.l -1 hodnota skvasiteľných cukrov predstavovala 0,30 g.l -1 Graf č. 9: Hodnoty jednotlivých cukrov v g.l -1 48
5.5. Hodnota glycerolu V prípade Zymomonas mobilis bol vyhodnotený obsah glycerolu nasledovne: hodnota glycerolu predstavovala 5,60 g.l -1 (viď. graf č. 10) V prípade Zymomonas pomaceae bol vyhodnotený obsah glycerolu nasledovne: hodnota glycerolu predstavovala 4,60 g.l -1 (viď. graf č. 10) V prípade Saccharomyces cerevisiae bol vyhodnotený obsah glycerolu nasledovne: hodnota glycerolu predstavovala 5,70 g.l -1 (viď. graf č. 10) Graf č. 10: Hodnoty glycerolu v g.l -1 5.6. Hodnota shikimátu, mucinátu a glukonátu V prípade Zymomonas mobilis bol vyhodnotený obsah nasledovne (viď. graf č. 11): hodnota shikimátu predstavovala 21,63 mg.l -1 hodnota mucinátu predstavovala 130,00 mg.l -1 hodnota glukonátu predstavovala 0,00 mg.l -1 49