Laboratórna diagnostika S. pneumoniae v NRC pre pneumokokové nákazy Bottková E., Maďarová L., Klement C., Čamajová J., Avdičová M., Hudečková H.
NRC pre pneumokokové nákazy 1.1.2011 - zriadenie NRC Vedúci: doc. MUDr. Cyril Klement, CSc., mim prof. Odborné usmernenie MZ SR na zabezpečenie surveillance pneumokokových invazívnych ochorení v SR - platné od 1.9.2011 Vestník MZ SR 2011, čiastka 19-31, s. 227-233
Klinické oddelenia, lekári hlásenie prípadov IPO (výskyt, hospitalizácia) odber biol. materiálu + zaslanie na OKM vyznačenie údajov o očkovaní na žiadanke poskytnutie informácií v rámci epidemiologického šetrenia Mikrobiologické laboratóriá RÚVZ hlásenie pozitívnej izolácie Spn zo sterilného miesta na RÚVZ a odosielajúcemu lekárovi zasielanie kmeňov do NRC hlásenie výsledkov sérotypizácie odosielajúcemu lekárovi aj RÚVZ epidemiologické vyšetrovanie po doručení hlásenia hlásenie IPO do EPISu vyplnenie a zaslanie dotazníka národnému koordinátorovi pre IPO
NRC pre pneumokokové nákazy metodické vedenie mikrobiologických laboratórií nadstavbová diagnostika (sérotypizácia) konfirmácia zaslaných kmeňov hlásenie výsledkov sledovanie ATB citlivostí základná diagnostika zavádzanie nových metód konzultácie pre mikrobiologické laboratóriá aj lekárov aktívne zlepšovanie surveillance a diagnostiky publikovanie výsledkov sledovanie epidemiologických príbuzností
Problémy pri evidencii prípadov prípady hlásené do EPISu kmene/ biol. materiály zaslané do NRC 2013: v NRC 71 - v EPISe 84 diagnózy: A40.3, G00.1, J13 EPIS evidované v EPISe aj doručené do NRC NRC
Materiál izolát S. pneumoniae z klinického materiálu hemokultúra likvor punktáty/ aspiráty (pleurálna/ perikardiálna/ peritoneálna tekutina, kĺb) hnis stery tkanivo (bioptické, nekroptické) iné... najčastejšie biologický materiál
1. Živý kmeň: Posielanie materiálu Ideálne platňa + tampón v TM čerstvo narastený kmeň sérotypizácia sérologickými aj mol.-biol. metódami založenie do zbierky kmeňov NRC kontaminácia neviabilný kmeň...niekedy kmeň v NRC nevyrastie... ponechanie kmeňa - spätná väzba? (KA; laboratórna teplota)
Posielanie materiálu 2. Biologický materiál stanovovanie prítomnosti DNA pneumokoka 4 C / -20 C/ -80 C transport do NRC - čím skôr NRC potvrdenie IPO sérotypizácia molekulárno-biologickými metódami
Spracovanie v NRC - bakteriálny kmeň Doručenie kmeňa + evidencia ÚSPEŠNÁ Opätovná kultivácia NEÚSPEŠNÁ (neviabilný kmeň, kontaminácia) vyžiadanie kmeňa sérotypizácia uloženie do zbierky kmeňov NRC stanovenie sérotypu / séroskupiny/ kombinácie sérotypov izolácia DNA + sérotypizácia (mpcr) zaradenie medzi nevakcinačné sérotypy
Spracovanie v NRC - biol. materiál Doručenie biologického materiálu + evidencia Izolácia DNA uchovanie na -80 C Kvalitatívna PCR diagnostika POZITÍVNA NEGATÍVNA sérotypizácia Pozitívna = výsledok negatívna
Spracovanie kmeňa v NRC Základné spracovanie kultivácia konfirmácia - OPT - rozpustnosť v žlči - API test - PCR (konvenčná, real-time) sérotypizácia
Streptococcus pseudopneumoniae identifikácia ako viridujúce streptokoky alebo ako atypické pneumokoky S. oralis / S. mitis/ S. pneumoniae asociovaný s CHOCHP a infekciami respiračného traktu, ale aj fyziologicky sterilné miesta OPT citlivý - bežná atmosféra OPT rezistentný/ intermediárny - 5% CO 2 absencia puzdra nerozpustný v žlči http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=s0716-10182010000100007 Keith et al., 2006; J Clin Microbiol.44: 923-927
PCR diagnostika konvenčná PCR, real-time PCR vysoká citlivosť aj špecificita použiteľnosť pri kultivačne negatívnych klinických vzorkách nevhodný transport, ATB terapia stanovenie v akomkoľvek biologickom materiáli rýchly výsledok Konvenčná PCR kvalitatívna metóda stanovenie jedného špecifického cieľového úseku komerčný kit, vlastná PCR (lyta, cpsa) ELFO + vyhodnotenie
Real-time PCR kvalitatívna metóda PCR diagnostika sledovanie amplifikácie jedného špecifického cieľového génu (lyta) v reálnom čase
Sérotypizácia sérologické metódy zlatý štandard využívané celosvetovo možnosť určiť všetky sérotypy rýchlosť vyšetrenia finančne náročné subjektívne hodnotenie živý kmeň!
Sérotypizácia sérologické metódy 1. Latexová aglutinácia - Ab naviazaná na latexové partikuly - hodnotenie voľným okom - určenie sérotypu/ séroskupiny/ kombinácie sérotypov pozit. negat.
Sérotypizácia sérologické metódy 2. Quellung (Neufeldova reakcia) - reakcia Ab s Ag - kapsulárnym polysacharidom - napučiavanie puzdra - mikroskopia vo fázovom kontraste negatívna pozitívna
Sérotypizácia: mol.-biologické metódy objektívne hodnotenie, špecificita možnosť sérotypizácie priamo z biologického materiálu aj neviabilné kmene resp. kultivačne negatívne vzorky biol. materiálu možnosť identifikovať sérotyp/séroskupinu/kombináciu sérotypov možnosť kombinovania so sérologickými metódami zamerané na vakcinačné sérotypy v niektorých prípadoch nemožno stanoviť konkrétny sérotyp obmedzená škála detegovateľných sérotypov - nezachytáva všetky sérotypy nie pre každý biologický materiál obmedzená citlivosť
Sérotypizácia: molekulárno-biologické metódy Multiplex PCR stanovenie viacerých špecifických sekvencií v jednej PCR rôzna veľkosť PCR produktov sérotypovo špecifické gény cps lokusu interná kontrola (cpsa, lyta) v NRC - od 2012
Multiplex PCR - sérotypy 1, 2, 3, 4, 5, 8, 14, 10A, 17F, 18A, 19F, 19A, 20, 23F, 35B 6A/B, 6C/D, 7F/A, 9V/A, 9L/N, 12F/12A/44/46, 15F/A, 15B/C, 22F/A, 33F/33A/37, 37F/47F sg. 11, sg. 18 (18C), sg. 24
Genotypizačné metódy PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) porovnávanie izolátov poštiepenie genómu baktérie + elektroforéza v striedavom elektrickom poli porovnávanie kmeňov z rôznych zdrojov, epidemiologické súvislosti, sledovanie šírenia kmeňov stabilita štiepnych vzorov výpovedná hodnota časová náročnosť
Do budúcna... rozšírenie škály stanovovaných sérotypov stanovovanie citlivostí na vybrané ATB posielanie kmeňov Spn do NRC aj z iných materiálov ako likvor a hemokultúra posielanie podozrivých biologických materiálov PCR diagnostika /+ sérotypizácia mpcr
Ďakujeme za spoluprácu!
Ďakujem za pozornosť