v_17

VESTNÍK Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky Roèník XXXVIII 6. september 2006 Èiastka 17 O b s a h: 59. Dodatok è. 3 k usmerneniu ministra pôdohospodárstva Slovenskej republiky na úseku štátnej správy o podpore v po¾nohospodárstve formou priamych platieb 60. Redakèné oznámenie o oprave výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 9. augusta 2006 è. 2163/2006-100, ktorým sa mení a dopåòa výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 31. augusta 2004 è. 2108/2004-100 o poskytovaní pomoci z finanèných zdrojov Európskej únie na podporu spotreby mlieka a mlieènych výrobkov pre žiakov s povinnou školskou dochádzkou v znení výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 10. augusta 2005 è. 3090/2005-100 61. Redakèné oznámenie o oprave zoznamu úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív èasti Rôzne zverejneného v èiastke 13 Vestníka Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 20. júla 2006 ako doplnok è. 1/2006 59 D O D A T O K è. 3 k usmerneniu ministra pôdohospodárstva Slovenskej republiky na úseku štátnej správy o podpore v po¾nohospodárstve formou priamych platieb Ministerstvo pôdohospodárstva Slovenskej republiky (ïalej len ministerstvo ) pod¾a 5 a 6 ods. 1 písm. a) zákona è. 473/2003 Z. z. o Pôdohospodárskej platobnej agentúre, o podpore podnikania v pôdohospodárstve a o zmene a doplnení niektorých zákonov v znení zákona è. 546/ 2004 Z. z. vydáva k usmerneniu ministra pôdohospodárstva Slovenskej republiky na úseku štátnej správy o podpore v po¾nohospodárstve formou priamych platieb zverejnenému vo Vestníku ministerstva v èiastke 7 zo dòa 27. marca 2006 tento dodatok: 1

Èl. I V èlánku 9 odsek 3 znie: (3) Osobitná platba na cukor sa poskytne žiadate¾ovi, ktorý predloží zmluvu uzavretú v súlade s osobitnými predpismi 8) z hospodárskeho roka 2005/06.. Èl. II Tento dodatok nadobúda úèinnos dòom zverejnenia vo Vestníku ministerstva. Miroslav Jureòa, v. r. minister 60 R E D A K È N É O Z N Á M E N I E o oprave výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 9. augusta 2006 è. 2163/2006-100, ktorým sa mení a dopåòa výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 31. augusta 2004 è. 2108/2004-100 o poskytovaní pomoci z finanèných zdrojov Európskej únie na podporu spotreby mlieka a mlieènych výrobkov pre žiakov s povinnou školskou dochádzkou v znení výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 10. augusta 2005 è. 3090/2005-100 Výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 9. augusta 2006 è. 2163/ 2006-100, ktorým sa mení a dopåòa výnos Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 31. augusta 2004 è. 2108/2004-100 o poskytovaní pomoci z finanèných zdrojov Európskej únie na podporu spotreby mlieka a mlieènych výrobkov pre žiakov s povinnou školskou dochádzkou v znení výnosu Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 10. augusta 2005 è. 3090/ 2005-100 sa dopåòa èlánkom II, ktorý znie: Èl. II Tento výnos nadobúda úèinnos 1. septembra 2006.. 2

61 R E D A K È N É O Z N Á M E N I E o oprave zoznamu úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív èasti Rôzne zverejneného v èiastke 13 Vestníka Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 20. júla 2006 ako doplnok è. 1/2006 V zozname úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív èasti Rôzne zverejnenom v èiastke 13 Vestníka Ministerstva pôdohospodárstva Slovenskej republiky z 20. júla 2006 ako doplnok è. 1/2006 pod è. 42/2006 príloha è. 1 znie: Príloha è. 1 k zoznamu úradných metód laboratórnej diagnostiky potravín a krmív èas Rôzne R 5. Dôkaz druhu mäsa zvierat v tepelne opracovanom mäse a mäsových výrobkoch metódou ELISA Zmena 1 1. Úvod Pomocou ELISA testov sa v potravinách analyzujú proteíny z rôznych druhov zvierat. Identifikácia obsahu druhov mäsa pomocou ELISA testov je urèená predovšetkým na to, aby sa zabránilo náhrade mäsa urèeného na ¾udský konzum za mäso nevhodné alebo horšej kvality. 2. Predmet a oblas použitia Na urèenie rôznych druhov mäsa v tepelne opracovanom mäse a mäsových výrobkoch boli vyvinuté súpravy ELISA testov, založené na termostabilných druhovo špecifických proteínoch. Tieto súpravy sú citlivé a ich špecifické testy napomáhajú urèeniu jednotlivých druhov zvierat. Sú úspešné aj pri urèení materiálu pochádzajúceho z utratených zvierat a v krmivách. 3. Princíp skúšky Identifikaèné súpravy na urèenie bielkoviny niektorých druhov zvierat v tepelne opracovanom mäse a mäsových výrobkoch sú ELISA testy sendvièového typu. Využívajú proces zvyšovania hodnôt väzby 3

biotín avidín. Vzorky sa extrahujú varom v destilovanej vode alebo roztoku chloridu sodného, tento extrakt sa po filtrácii pridáva do plastických mikrojamiek, na ktorých je nanesená vrstva purifikovanej, druhovo špecifickej protilátky. S rastúcou koncentráciou špecifických bielkovín v extrakte sa bude viac bielkoviny viaza na protilátku na platnièke. Po prebehnutí reakcie sa nenaviazané zložky reakcie odstránia premytím. Množstvo špecifického proteínu naviazaného na protilátku na platnièke sa urèí reakciou s protilátkou špecifickou k biotínu a potom so streptavidín peroxidázovým konjugátom. Po každej inkubácii sa prebytoèný reagent odstráni premytím, nakoniec sa aktivita naviazanej peroxidázy urèí pridaním daného množstva substrátu ABTS, ktorý vytvára zelené zafarbenie v prípade prítomnosti peroxidázy. Intenzita zafarbenia je priamo úmerná pôvodnému množstvu špecifickej bielkoviny v extrakte. Kvalitatívny odhad obsahu druhov mäsa sa môže vykona vizuálnym zhodnotením alebo pomocou odèítaèa mikrotitraèných platnièiek (ríder). 4. Podstata skúšania 4.1 Pripraví sa urèité množstvo extraktu vzorky (9). Urèitý objem extraktu vzorky súèasne s pozitívnymi a negatívnymi kontrolami sa aplikuje do mikrojamiek. 4.2 Inkubuje sa pri izbovej teplote a premýva sa pracovným premývacím roztokom. 4.3 Po premytí sa do jednotlivých testovacích jamiek pridá ANTI-SPECIES BIOTINYLATE a inkubuje sa pri izbovej teplote. Potom sa opä premyje pracovným premývacím roztokom. 4.4 Pridá sa AVIDIN-PEROXIDASE konjugát. Premyje sa pracovným premývacím roztokom. 4.5 Do každej jamky sa pridá pracovný roztok. Inkubuje sa pri izbovej teplote. 4.6 Pridá sa STOP-ROZTOK. 4.7 Zmeria sa absorbancia s použitím platnièkového odèítaèa pri vlnovej dåžke 405 nm a kvalitatívne sa vyhodnotí pozitívna alebo negatívna vzorka. 5. Èinidlá 5.1 Chlorid sodný 5.2 Destilovaná/deionizovaná voda 6. Prístroje a pomôcky 6.1 Komponenty súpravy Poznámka: Tieto súpravy sa predávajú ako série testovacích kombinácií obsahujúce jednu alebo viac sád druhovo špecifických èinidiel. Preto sa bude presný obsah súpravy líši v závislosti od typu súpravy. Súpravy obsahujú nasledovné komponenty: A: Tri/štyri f¾aštièky pozitívnej kontroly obsahujúce 1,5 ml kontroly vo fosfátovom pufri s thiomersalom ako konzervaènou látkou. Každá slúži ako pozitívna kontrola v príslušnom teste, a môže by tiež použitá ako negatívna kontrola pre iný druh bielkoviny v akomko¾vek inom teste (tepelne opracované druhy mäsa zvierat). B: Jednu alebo viac f¾aštièiek ANTI-SPECIES BIOTINYLATE na každý jednotlivý druh, obsahujúcich 1,4/1,75 ml protilátky vo fosfátovom pufri s nosite¾ským sérom, zmáèacím prostriedkom a thiomersalom ako konzervaènou látkou. 4

C: Jednu f¾aštièku konjugát AVIDIN-PEROXIDASE obsahujúcu 6,0 ml konjugátu vo fosfátovom pufri s nosite¾ským sérom, zmáèacím prostriedkom a thiomersalom ako konzervaènou látkou. D: Jednu f¾aštièku obsahujúcu 0,65 ml ABTS koncentrátu (1,5%2,2 azinodi(3/etylbenythiazoline sulphonic acid) vo vode. E: Jednu f¾aštièku peroxidázového citrátového pufra. F: Jednu f¾ašu koncentrátu premývacieho roztoku. G: Jednu f¾aštièku obsahujúcu 6,0 ml STOP-roztoku. H: Jednu mikrotitraènú platnièku s (varenou) senzibilizovanou protilátkou. I: Jednu súhrnnú prílohu. J: Štyri prázdne formuláre na výsledky s príruèkou. 6.2 Mixér alebo mlynèek na mäso 6.3 Laboratórne sklo 6.4 Odmerné valce 6.5 Pipety 6.6 Filtraèný papier (Watman è.4 alebo podobný) 6.7 Viackanálové pipety 20 ml až 200 ml 6.8 Horúci vodný kúpe¾ (ak vzorky vyžadujú tepelnú úpravu) 6.9 Trepaèka mikrotitraèných platnièiek 6.10 Mikropipeta 50 ml, 100 ml 6.11 Špièky do mikropipiet 6.12 Mikroplatnièkový odèítaè (reader), filter: vlnová dåžka 405-420 nm 6.13 Chladnièka s teplotou +2 o C až +8 o C 6.14 Teplovzdušný sterilizátor (180 o C) 7. Skladovate¾nos 7.1 Extrakty vzoriek Extrakty vzoriek je možné uskladni pri teplote 2-8 o C maximálne po dobu 36 hodín. Ak je potrebné dlhšie uskladnenie, extrakty je potrebné zmrazi (-20 o C, pri tejto teplote sú stabilné poèas nieko¾kých mesiacov). 7.2 Èinidlá Identifikaèná súprava by mala by uskladnená pri teplote 2-8 o C. Trvanlivos neotvorených komponentov súpravy je oznaèená dòom použite¾nosti. Ak boli èinidlá otvorené, malo by by minimalizované ich uloženie pri zvýšenej teplote (napr. izbovej). 7.3 Mikrotitraèná platnièka senzibilizovaná protilátkou sa skladuje v suchu a musí by dokonale uzatvorená. Ak sa dodrží návod na uskladnenie, otvorené èinidlá sú stabilné nieko¾ko týždòov alebo mesiacov pri teplote 2-8 o C. Ak sušidlo zružovie, v prípade potreby je možné kapsule sušidla opätovne vysuši umiestnením do horkovzdušného sterilizátora na 100 o C. Farba sušidla sa zmení na tmavomodrú. 5

8. Príprava materiálov súpravy A. Pozitívne kontroly B. ANTI-SPECIES BIOTINYLATES C. AVIDIN PEROXIDASE konjugát D/E. ABTS koncentrát a peroxidový citrátový pufer F. Koncentrát premývacieho roztoku G. STOP roztok H. Mikrotitraèná platnièka senzibilizovaná protilátkou 9. Príprava a odber vzoriek 9.1 Pripraví sa fyziologický roztok (9,0 g NaCl / l v destilovanej/deionizovanej vode) na použitie pri vyluhovaní vzoriek mäsa. Požadované množstvo je približne 100 ml na vzorku. Na vyluhovanie môže by, v prípade potreby, použitá aj destilovaná voda. 9.2 Vzorka sa pripraví na vyšetrovanie mixovaním, zomletím alebo nasekaním (pozor sa musí dáva na dokonalé vyèistenie náradia medzi úpravou jednotlivých vzoriek, aby nedošlo ku vzájomnej kontaminácii). Odvážime 25 g vzorky do èistej nádoby. 9.3 Pridá sa 100 ml fyziologického roztoku alebo destilovanej vody, dokonale sa premieša trepaním na trepaèke alebo v ruke. 9.4 V prípade potreby zmes tepelne ošetríme vo vodnom kúpeli s teplotou 95 o C až 100 o C poèas 15 minút. Necháme odstá 10 15 minút, znova dobre premiešame a necháme odstá 10 15 minút. Supernatant následne prefiltrujeme cez filtraèný papier Whatman è. 4 (alebo podobný). Èíry filtrát môžeme použi v analýze. 10. Pracovný postup Pracovný postup sa riadi pod¾a návodu výrobcu setu. 1. Test sa nechá vytemperova na laboratórnu teplotu. 2. Pripravíme si extrakty testovaných vzoriek (9) a pracovné roztoky (8). 3. Do prvej jamky aplikujeme mikropipetou pozitívnu kontrolu BEEF. Do druhej jamky pozitívnu kontrolu PORK a do tretej jamky pozitívnu kontrolu SHEEP. Do ostatných jamiek dávkujeme vyšetrované vzorky. Je dôležité používa vždy nové špièky pre každú vzorku. 4. Platnièka sa inkubuje pri podmienkach daných výrobcom setu. 5. Po ukonèení doby inkubácie sa obsah jamiek vyklepe do umývadla s dezinfekèným roztokom a potom sa pozorne naplnia všetky jamky pracovným premývacím rotokom (8.F). Toto sa opakuje nieko¾ko (5) krát pod¾a návodu výrobcu 6. Do každej jamky sa pridá mikropipetou ANTI-SPECIES BIOTINYLATE (8.B) 7. Platnièku umiestnime na trepaèku a trepeme 60 minút, ak nie je trepaèka, môže sa premiešava rukou. 8. Po ukonèení doby inkubácie sa zopakuje proces premývania opísaný v bode 5. 9. Do každej jamky sa pridá konjugát AVIDIN-PEROXIDASE (8.C). Pridáva sa postupne zhora nadol každého stripu. 10. Platnièka sa inkubuje pri podmienkach daných výrobcom setu. 11. Po ukonèení doby inkubácie sa platnièka premyje pod¾a bodu 5. V tomto prípade sa premývanie opakuje 5x. 6

12. Do každej jamky sa aplikuje pipetou pracovný ABTS roztok (8.D/E) Pridávame postupne zhora nadol každého stripu. 13. Platnièka sa inkubuje pri podmienkach daných výrobcom setu. 14. Po uplynutí doby inkubácie sa pridá do každej jamky STOP roztok (8.G). 15. Na trepaèke sa trepe 10 sekúnd, aby došlo k rozptýleniu STOP roztoku a zabránilo sa ïalšej zmene farby. 16. Odèítame farebnú reakciu. Odèítanie sa môže urobi buï vizuálne alebo na odèítaèi mikrotitraèných platnièiek (ríder) pri použití filtra 405-420 nm. 11. Interpretácia výsledkov Mikrotitraèná platnièka sa umiestni na biele pozadie a zhodnotia sa jamky, èi je v nich prítomné alebo neprítomné výrazné zelené sfarbenie. Pozitívne kontroly (napr. kontrola hovädzieho mäsa na stripe COW-krava, bravèového mäsa na stripe PIG-ošípaná) by mali by zelenkavej farby. Negatívne kontroly (napr. bravèové mäso a jahòacie mäso na stripe COW-krava, ovèie a hydinové mäso na stripe PIG-ošípaná) by mali by bezfarebné. Testované vzorky sú klasifikované ako: Pozitívne, ak sú vidite¾ne farebne podobné, alebo majú tmavšiu zelenú farbu, ako je príslušná pozitívna kontrola. Negatívne, ak sú vidite¾ne svetlejšie ako pozitívna kontrola, alebo sú bezfarebné ako negatívna kontrola. 12. Meranie a vyhodnotenie výsledkov 12.1 Farebná reakcia sa zmeria na odèítaèi mikrotitraèných platnièiek pri vlnovej dåžke 405 420 nm. 12.2 Vypoèítame priemernú hodnotu negatívnej kontroly. 12.3 Priemernú hodnotu negatívnej kontroly (xnc) vynásobíme faktorom (F), ktorý je daný výrobcom setu pre jednotlivé druhy mäsa. Dostaneme Cut-off hodnotu. Vyšetrovaná vzorka je pozitívna, ak nameraná hodnota absorbancie príslušnej vzorky je vyššia ako Cut off hodnota. Vyšetrovaná vzorka je negatívna, ak nameraná hodnota absorbancie príslušnej vzorky je nižšia ako Cut off hodnota. 13. Protokol o skúške Protokol musí obsahova : druh a pôvod vzorky, dátum odobratia vzorky, dátum príjmu a skúšania vzorky použitú metódu, výsledok skúšania. Protokol o skúške musí obsahova všetky informácie potrebné na úplnú identifikáciu vzorky. 7

14. Zabezpeèenie kvality pracovného postupu skúšky a overenia metódy Pre správnos vyšetrovacieho postupu a presnos výsledku sa pri vyšetrovaní proteínov hovädzieho mäsa pri každej skúšanej vzorke porovnáva s kontrolnou pozitívnou kontrolou BEEF pozitívna kontrola a ako negatívne kontroly sa používajú PORK pozitívna kontrola a SHEEP pozitívna kontrola. Pri správnom vykonaní ELISA testu musí by pozitívna kontrola BEEF výrazne zelená a pozitívne kontroly PORK a SHEEP bezfarebné.. Prof. MVDr. Jozef Bíreš, DrSc., v. r. hlavný veterinárny lekár 8