Histologická súprava príslušenstva FISH Kód č. K vydanie Na fluorescenčnú hybridizáciu in situ (FISH) na tkanivových rezoch fixovaných vo forma

Prepis

1 Histologická súprava príslušenstva FISH Kód č. K vydanie Na fluorescenčnú hybridizáciu in situ (FISH) na tkanivových rezoch fixovaných vo formalíne a zaliatych v parafíne. Súprava obsahuje množstvo činidiel, ktoré postačuje na vykonanie 20 testov. P04094SK_03/K str. 1/28

2 Obsah Určenie... 3 Úvod... 3 Činidlá... 3 Dodávaný materiál... 3 Potrebný materiál, ktorý netvorí súčasť dodávky... 4 Bezpečnostné opatrenia... 5 Skladovanie... 8 Príprava vzoriek... 8 Rezy zaliate v parafíne... 8 NÁVOD NA POUŽITIE... 9 A. Príprava činidla... 9 A.1 Roztok na predbežné spracovanie... 9 A.2 Pufer na dôkladné premytie... 9 A.3 Premývací pufer... 9 A.4 Etanolová séria... 9 A.5 Pepsínový roztok... 9 B. Postup farbenia B.1 Poznámky k postupu B.2 Spracovanie tkanív pred farbením B.3 Protokol farbenia B.3.a. Protokol farbenia pre sondy FISH zriedené v hybridizačnom pufri s obsahom etylénuhličitanu B.3.b. Protokol farbenia pre sondy FISH zriedené v hybridizačnom pufri s obsahom formamidu Kontrola kvality Interpretácia výsledkov Riešenie problémov Dodatok Dodatok Referenčná literatúra Vysvetlenie symbolov P04094SK_03/K str. 2/28

3 SLOVENČINA Určenie Na diagnostické použitie in vitro. Histologická súprava príslušenstva FISH je určená na použitie v rámci metódy fluorescenčnej hybridizácie in situ (FISH) na vzorkách tkanivových rezov fixovaných vo formalíne a zaliatych v parafíne. Dodané činidlo v súprave Histology FISH Accessory Kit je takisto možné používať so vzorkami HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix (kód K5731, Vial 3). Ak sa činidlá zo súpravy Dako Histology FISH Accessory Kit (kód K5799) používajú s činidlami z kódu K5731, je potrebné postupovať podľa postupu uvedeného v príbalovej informácii pre kód K5731. Úvod Histologická súprava príslušenstva FISH obsahuje všetky kľúčové činidlá, okrem sondy, potrebné na vykonanie FISH metódy pre vzorky tkanivových rezov fixovaných vo formalíne a zaliatych v parafíne. Po odstránení parafínu a rehydratácii sú vzorky zahriate v roztoku na predbežné spracovanie, potom nasleduje proteolytické trávenie s použitím pepsínu. Po vykonaní krokov predbežného spracovania zahriatím a proteolýzou sa aplikujú používateľom poskytnuté sondy FISH a vzorky sa pred denaturáciou a ďalšou hybridizáciou utesnia tmelom na krycie sklíčko. Na druhý deň sa vykoná dôkladné premytie, ktoré zaistí odstránenie neviazaných alebo nešpecificky viazaných sond FISH pred dehydratáciou s etanolom. Nakoniec sa vzorky naviažu pomocou fluorescenčného väzobného média obsahujúceho modré fluorescenčné kontrastné farbivo. Výsledky sa interpretujú pomocou fluorescenčného mikroskopu vybaveného príslušnými filtrami (pozri dodatok 1). Činidlá Dodávaný materiál Materiály vymenované nižšie postačujú na 20 testov (test je definovaný ako jedna cieľová oblasť 22 mm x 22 mm). Súprava poskytuje dostatočný materiál pre až 10 jednotlivých cyklov FISH (štyri samostatné cykly pri použití metódy ponorenia do pepsínu). Histologická súprava príslušenstva FISH sa dodáva na suchom ľade. Aby sa zaistilo, že súčasti súpravy nebudú počas transportu vystavené vysokým teplotám, suchý ľad by mal byť pri doručení stále prítomný. Upozorňujeme, že niektoré súčasti súpravy môžu byť nezmrazené, to však funkciu histologickej súpravy príslušenstva FISH neovplyvní. Fľaštička 1 Fľaštička 2A Fľaštička 2B Roztok na predbežné spracovanie (20x) 150 ml, koncentrovaný 20x Pufer MES (2-[N-morfolino]etánsulfónová kyselina). Pepsín 4 x 6,0 ml, pripravené na použitie Pepsínový roztok, ph 2,0; obsahuje stabilizátor a antimikrobiálny prostriedok. Diluent pepsínu (10x) 24 ml, koncentrovaný 10x Pufer na riedenie, ph 2,0; obsahuje antimikrobiálny prostriedok. P04094SK_03/K str. 3/28

4 Fľaštička 4 Fľaštička 5 Fľaštička 6 Položka 7 Pufer na dôkladné premytie (20x) 150 ml, 20 koncentrovaný Pufer SSC (fyziologický citran sodný) s detergentom Tween-20. Fluorescenčné väzobné médium 0,4 ml Fluorescenčné montážne médium pripravené na použitie s 500 μg/l DAPI (4,6-diamidin-2-fenylindol). Premývací pufer (20 ) 500 ml, 20 koncentrovaný Pufer tris-hcl. Tmel na krycie sklíčko 1 tuba Roztok na odstrániteľné utesnenie krycieho sklíčka pripravený na použitie. POZNÁMKA: Všetky činidlá je možné zameniť s korešpondujúcimi činidlami v rámci produktu Dako HER2 IQFISH pharmdx (kód K5731). Ak sa činidlá zo súpravy Dako Histology FISH Accessory Kit (kód K5799) používajú s činidlami z kódu K5731, je potrebné postupovať podľa postupu uvedeného v príbalovej informácii pre kód K5731. Potrebný materiál, ktorý netvorí súčasť dodávky Laboratórne činidlá Destilovaná/deionizovaná voda Etanol, 96% Xylén alebo náhrady xylénu Laboratórne vybavenie Absorpčné utierky Nastaviteľné pipety Kalibrovaný, čiastočne ponorný teplomer (rozsah C) Krycie sklíčka (18 mm x 18 mm alebo 22 mm x 22 mm a 24 mm x 50 mm alebo 24 mm x 60 mm) Pean Odsávač dymu Dako Hybridizer (kód S2450/S2451)* Ohrievací blok alebo hybridizačná rúra* Vlhkostná hybridizačná komora* Mikrocentrifúga Sklíčka, silanizované sklíčka Dako, kód S3003, sklíčka potiahnuté poly-l-lyzínom alebo sklíčka Superfrost Plus Nádoby alebo kúpele pre farbenie Kovové alebo plastové kolísky Časovač (umožňujúci intervaly 0 60 minút) Vodný kúpeľ s viečkom (schopný udržať 37 (±2) C, 63 (±2) C, 65 (±2) C a od 95 C do 99 C Mikrovlnná rúra so snímacou schopnosťou, ak sa predbežné spracovanie vykonáva pomocou mikrovlnnej rúry** (pozrite krok 1 v časti B3a alebo B.3.b. Protokol farbenia, metóda B). Nádoba odolná proti mikrovlnám, vrchnák musí mať otvory s priemerom napríklad jeden centimeter P04094SK_03/K str. 4/28

5 * Ohrievací blok na trávenie (37 (±2) C), ohrievací blok alebo hybridizačná rúra na denaturáciu (66 (±2) C (B.3.a.) alebo 82 (±2) C) (B.3.b.) a vlhká hybridizačná komora na hybridizáciu (45 (±2) C) tieto produkty je možné použiť, odporúčame však použiť hybridizačné zariadenie Dako Hybridizer, kód S2450/S2451. ** Namiesto mikrovlnnej rúry je možné použiť vodný kúpeľ s viečkom (schopný udržať C) alebo tlakovú komoru ovládanú mikroprocesorom, ako napríklad Dako Pascal, kód S2800. Vybavenie a príslušenstvo mikroskopu Filtre do fluorescenčného mikroskopu: Filter DAPI a vhodné filtre vzhľadom na použitý fluorochróm, napríklad dvojitý filter FITC/Texas Red, monofilter FITC a Texas Red pre sondy Dako FISH podrobnosti nájdete v prílohe 1. Pre sondy Dako FISH je potrebné použiť fluorescenčný mikroskop so 100-wattovou ortuťovou výbojkou ako svetelným zdrojom. Pri týchto filtroch sa neodporúčajú iné svetelné zdroje Držiak sklíčok mikroskopu (papierový zásobník na 20 sklíčok s vyklápacím krytom alebo podobne) Bezpečnostné opatrenia 1. Na diagnostické použitie in vitro. 2. Pre profesionálnych používateľov. 3. Fľaštička 1 nevyžaduje varovné označenie. Karta bezpečnostných údajov pre profesionálnych používateľov je k dispozícii na vyžiadanie. 4. Fľaštička 2A, Pepsín, obsahuje 5-<10% propan-2-ol, 0.1-<0.3% pepsin A, a <0.1% 5- chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one a 2-methyl-2H-isothiazol-3-one. Fľaštička 2A je označená: Nebezpečenstvo H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Spôsobuje vážne poleptanie kože a poškodenie očí. Môže vyvolať alergickú kožnú reakciu. Noste ochranné rukavice. Noste ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Noste ochranný odev. PO VDÝCHNUTÍ: Presuňte osobu na čerstvý vzduch a umožnite jej pohodlne dýchať. Okamžite volajte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÉ CENTRUM/lekára. PO POŽITÍ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. Nevyvolávajte zvracanie. PRI KONTAKTE S POKOŽKOU (alebo vlasmi): Všetky kontaminované časti odevu okamžite vyzlečte. Pokožku opláchnite vodou/sprchou. Okamžite volajte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÉ CENTRUM/lekára. PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Okamžite volajte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÉ CENTRUM/lekára. Uchovávajte uzamknuté. Zneškodnite obsah a nádobu v súlade s miestnymi, regionálnymi, celoštátnymi a medzinárodnými predpismi. 5. Fľaštička 2B, Pepsin Diluent (10x), obsahuje 50-<75% propan-2-ol a 5-<10% 2-amino-2- (hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Fľaštička 2B je označená: Nebezpečenstvo H225 H319 H336 Veľmi horľavá kvapalina a pary. Spôsobuje vážne podráždenie očí. Môže spôsobiť ospalosť alebo závraty. P04094SK_03/K str. 5/28

6 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P353 P235 P501 Používajte ochranné rukavice. Používajte ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Uchovávajte mimo dosahu tepla, horúcich povrchov, iskier, otvoreného ohňa a iných zdrojov zapálenia. Nefajčite. Používajte elektrické, ventilačné, osvetľovacie a všetky ostatné zariadenia na manipuláciu s materiálom do výbušného prostredia. PO VDÝCHNUTÍ: Presuňte osobu na čerstvý vzduch a umožnite jej pohodlne dýchať. PRI KONTAKTE S POKOŽKOU (alebo vlasmi): Všetky kontaminované časti odevu okamžite vyzlečte. Pokožku opláchnite vodou alebo sprchou. Uchovávajte v chlade. Zneškodnite obsah a nádobu v súlade s miestnymi, regionálnymi, celoštátnymi a medzinárodnými predpismi. 6. Fľaštička 4, Stringetn Wash Buffer (20x), obsahuje 10-<25% sodium chloride a 10-<20% 2- amino-2-(hydroxymethyl) propane-1,3-diol hydrochloride. Fľaštička 4 je označená: H319 H315 P280 Pozor P264 P305 + P351 + P338 Spôsobuje vážne podráždenie očí. Dráždi kožu. Používajte ochranné rukavice. Používajte ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Po manipulácii si starostlivo umyte ruky. PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Opatrne niekoľko minút oplachujte vodou. Ak používate kontaktné šošovky a ak je to možné, odstráňte ich. Pokračujte vo vyplachovaní. 7. Fľaštička 6, Wash Buffer (20x), obsahuje 10-<25% sodium chloride a 10-<20% trometamol. Fľaštička 6 je označená: H319 H315 P280 Pozor P264 P305 + P351 + P338 Spôsobuje vážne podráždenie očí. Dráždi kožu. Používajte ochranné rukavice. Používajte ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Po manipulácii si starostlivo umyte ruky. PO ZASIAHNUTÍ OČÍ: Opatrne niekoľko minút oplachujte vodou. Ak používate kontaktné šošovky a ak je to možné, odstráňte ich. Pokračujte vo vyplachovaní. 8. Položka 7, Coverslip Sealant, obsahuje 100 % nafty (petroleum), ľahký, z hydrogenačnej rafinácie, a je označený: Nebezpečenstvo H225 H304 H411 P280 P210 Veľmi horľavá kvapalina a pary. Môže byť smrteľný po požití a vniknutí do dýchacích ciest. Toxický pre vodné organizmy, s dlhodobými účinkami. Noste ochranné rukavice. Noste ochranné okuliare alebo ochranu tváre. Noste ochranný odev. Uchovávajte mimo dosahu tepla, horúcich povrchov, iskier, P04094SK_03/K str. 6/28

7 otvoreného ohňa a iných zdrojov zapálenia. Nefajčite. P241 Používajte elektrické, ventilačné, osvetľovacie a všetky ostatné zariadenia na manipuláciu s materiálom do výbušného prostredia. P273 Zabráňte uvoľneniu do životného prostredia. P301 + P310 + P331 PO POŽITÍ: Незабавно се обадете в ЦЕНТЪР ПО ТОКСИКОЛОГИЯ/на лекар. Nevyvolávajte zvracanie. P303 + P361 + P353 ПРИ КОНТАКТ С КОЖАТА (или косата): Všetky kontaminované časti odevu okamžite vyzlečte. Pokožku opláchnite vodou/sprchou. P235 Uchovávajte v chlade. P501 Zneškodnite obsah a nádobu v súlade s miestnymi, regionálnymi, celoštátnymi a medzinárodnými predpismi. 9. Ďalšie informácie nájdete v Bezpečnostnej karte k materiálom (Safety Data Sheet, SDS). 10. Metódy fixácie tkanív a hrúbka vzoriek iné ako špecifikované môžu ovplyvniť morfológiu tkaniva a/alebo intenzitu signálu. 11. Nedodržanie inkubačnej doby a teploty, alebo metódy iné než sú špecifikované, môžu poskytnúť nekvalitné výsledky. 12. Činidlá sú optimálne rozriedené. Ďalšie rozriedenie môže viesť k zníženiu výkonu. 13. Pri metóde ponorenia do pepsínu sa môžu používať len čisté farbiace nádoby (krok 2, metóda C). P04094SK_03/K str. 7/28

8 Skladovanie Skladujte na tmavom mieste pri teplote 2 8 C. Všetky činidlá je taktiež možné skladovať v zmrazenom stave. Pepsín (fľaštička 2A) môže byť pri vystavení vyššej než predpísanej teplote negatívne ovplyvnený. Neskladujte túto zložku pri izbovej teplote. Fluorescenčné väzobné médium (fľaštička 5) môže byť v prípade vystavenia pôsobeniu intenzívneho svetla negatívne ovplyvnené. Neskladujte túto zložku na svetle. Túto súpravu nepoužívajte po uplynutí dátumu exspirácie vytlačeného na obale súpravy. Ak sa činidlá skladujú za akýchkoľvek iných než tu uvedených podmienok, používateľ musí dané podmienky preveriť (1). Neexistujú žiadne známky toho, že by tento výrobok nebol stabilný. Je preto dôležité hodnotiť normálne tkanivo predtým preukázané pre jamku FISH ako kontrola spusteného testu. Ak spozorujete neočakávaný fluorescenčný vzor, ktorý nie je možné vysvetliť zmenami laboratórnych postupov, a máte podozrenie, že ide o problém s histologickou súpravou príslušenstva FISH, obráťte sa na oddelenie technickej podpory spoločnosti Dako. Príprava vzoriek So vzorkami z biopsií, excízií alebo resekcií treba zaobchádzať tak, aby sa uchovalo tkanivo pre analýzu FISH. Postupujte podľa nižšie uvedenej odporúčanej metódy spracovania tkaniva na imunocytochemické farbenie. Ďalšie informácie nájdete v referencii (2). Použitie tkaniva vystaveného dekalcifikácii kyselinou pre FISH sa neodporúča (3 6). Ako dekalcifikátor sa používa EDTA na lepšie zachovanie DNA (6) pre metódy (F)ISH (3, 4, 7). POZNÁMKA: Účinnosť súpravy s histologickým príslušenstvom FISH Dako nebola overená na dekalcifikovanom tkanive. Rezy zaliate v parafíne Iba tkanivá uchovávané v neutrálnom pufrovanom formalíne a zaliate v parafíne sú vhodné na použitie. Vzorky by napríklad mali byť narezané na časti s hrúbkou 3 alebo 4 mm a na dobu hodín fixované neutrálnym pufrovaným formalínom. Tkanivá sa následne dehydratujú v odstupňovaných sériách etanolu a xylénu. Potom nasleduje fáza infiltrácie pomocou roztopeného parafínu pri teplote max. 60 C. Správne fixované a zaliate tkanivá, ktoré sú správne uskladnené (15 25 C), vydržia pred oddelením a upevnením na sklíčka neobmedzene dlhú dobu (2, 8). Iné fixatíva nie sú vhodné. Predĺženie doby fixácie môže zvýšiť inkubačný čas požadovaný v kroku trávenia pepsínom. Tkanivové vzorky by mali byť narezané na časti s hrúbkou 2 6 µm, zhromaždené na sklíčkach z vodného kúpeľa a potom prirodzene vysušené na vzduchu. Optimálna hrúbka tkanivových rezov je 2 3 µm pre sondy Dako FISH s rozdeleným signálom. Pre iné aplikácie FISH sa môžu použiť rezy s hrúbkou 4 6 µm. Parafín by sa mal rozpúšťať pri teplote 60 C po dobu minút. Rezy je potom potrebné schladiť na izbovú teplotu (20 25 C) a skladovať pri teplote 2 8 C. Odporúča sa, aby boli tkanivové rezy umiestnené na silanizované podložné sklíčka Dako, kód S3003, alebo podložné sklíčka potiahnuté poly-l-lyzínom alebo sklíčka Superfrost Plus. Vo všeobecnosti platí, že vzorky je potrebné analyzovať do 6 mesiacov od narezania, ak sa dodržiava podmienka skladovania pri teplote 2 8 C. Ak skladujete tkanivové rezy pri iných než stanovených podmienkach, je potrebné overiť ich stav. P04094SK_03/K str. 8/28

9 NÁVOD NA POUŽITIE A. Príprava činidla Je vhodné pripraviť pred farbením nasledujúce činidlá: A.1 Roztok na predbežné spracovanie Vo fľaštičke 1 sa môžu vytvoriť kryštály, ale rozpustia sa pri izbovej teplote. Pred prípravou činidla overte, či nie sú prítomné kryštály. Rozrieďte dostatočné množstvo fľaštičky 1 (roztok na predbežné spracovanie 20x) riedením koncentrátu v pomere 1:20 v destilovanej alebo deionizovanej vode. Nepoužitý nariedený roztok môžete skladovať počas jedného mesiaca pri teplote 2 8 C. Rozriedený roztok zlikvidujte, ak je zakalený. A.2 Pufer na dôkladné premytie Rozrieďte dostatočné množstvo fľaštičky 4 (pufer na dôkladné premývanie 20x) riedením koncentrátu v pomere 1:20 v destilovanej alebo deionizovanej vode. Nepoužitý nariedený pufer môžete skladovať jeden mesiac pri teplote 2 8 C. Zlikvidujte rozpustený pufer, ak je zakalený. A.3 Premývací pufer Rozrieďte dostatočné množstvo fľaštičky 6 (premývací pufer 20x) riedením koncentrátu v pomere 1:20 v destilovanej alebo deionizovanej vode. Nepoužitý nariedený pufer môžete skladovať jeden mesiac pri teplote 2 8 C. Zlikvidujte rozpustený pufer, ak je zakalený. A.4 Etanolová séria Z 96% roztoku etanolu pripravte 3 nádoby so 70 %, 85 % a 96 % etanolom. Zakryté nádoby uchovávajte pri izbovej teplote alebo pri teplote 2 8 C, a použite na maximálne 200 podložných sklíčok. Ak sú roztoky zakalené, zlikvidujte ich. A.5 Pepsínový roztok Pepsínový roztok sa vyžaduje iba vtedy, ak sa používa metóda ponorenia do pepsínu (B.3.a. a B.3.b, krok 2, metóda C). Pepsínový roztok pripravte nasledujúcim spôsobom; Pre nádobku s kapacitou šiestich sklíčok pripravte 60 ml pepsínového roztoku: Do nádobky pridajte 48 ml destilovanej alebo deionizovanej vody izbovej teploty (20 25 C). Pridajte do nádobky 6 ml studeného (2 8 C) diluentu pepsínu (10x) (fľaštička 2B). Pridajte do nádobky 6 ml studeného (2 8 C) pepsínu (fľaštička 2A). Nasaďte veko na nádobu a vykonajte ekvilibráciu pepsínového roztoku na 37 (±2) C vo vodnom kúpeli. Pre nádobku s kapacitou 24 sklíčok pripravte 240 ml pepsínového roztoku: Do nádobky pridajte 192 ml destilovanej alebo deionizovanej vody izbovej teploty (20 25 C). Pridajte do nádobky 24 ml studeného (2 8 C) diluentu pepsínu (10x) (fľaštička 2B). Pridajte do nádobky 24 ml studeného (2 8 C) pepsínu (fľaštička 2A). Nasaďte veko na nádobu a vykonajte ekvilibráciu pepsínového roztoku na 37 (±2) C vo vodnom kúpeli. Pepsínový roztok s ustálenou teplotou je potrebné použiť do 5 hodín. P04094SK_03/K str. 9/28

10 B. Postup farbenia B.1 Poznámky k postupu Používateľ by si mal tieto pokyny pozorne prečítať a pred použitím sa zoznámiť so všetkými súčasťami (pozrite si Bezpečnostné opatrenia). Ak sa súčasti súpravy uchovávajú v zmrazenom stave, odporúča sa deň pred vykonaním analýzy zahriať činidlá na teplotu 2 8 C, aby sa tak umožnila náležitá teplotná rovnováha. Všetky činidlá by mali byť pred použitím zahriate na patričnú teplotu. Fľaštička 1: Zriedený roztok na predbežné spracovanie je potrebné zahriať na teplotu C v prípade, ak sa používa vodný kúpeľ (časť B.3.a alebo B.3.b protokolu farbenia, krok 1: Predbežné spracovanie, metóda A). Ak sa na predbežné spracovanie použije mikrovlnná rúra so schopnosťou snímania (časť B.3.a. alebo B.3.b., protokol farbenia, krok 1: Predbežné spracovanie, metóda B), zriedený roztok na predbežné spracovanie je potrebné zahriať na teplotu C. Fľaštička 2A: Pepsín je potrebné použiť pri teplote 2 8 C (časť B.3.a. alebo B.3.b., protokol farbenia, krok 2: metóda A a B) a trvalo zachovať v studenom stave. Fľaštička 2B: Riedidlo na pepsín (10 ) je potrebné použiť pri teplote 2 8 C (časť B.3.a. alebo B.3.b., protokol farbenia, krok 2: metóda C). Fľaštička 4: Jednu nádobu s pufrom na dôkladné premytie zahrejte pred použitím na izbovú teplotu a druhú na teplotu 63 (±2) C (časť B.3.a.) alebo 65 (±2) C (časť B.3.b). Fľaštička 5: Fluorescenčné upevňovacie médium je možné použiť pri ľubovoľnej teplote v rozsahu 2 25 C. Fľaštička 6: Rozriedený premývací pufer je potrebné zahriať na izbovú teplotu (20 25 C). Položka 7: Tmel na krycie sklíčko je možné aplikovať pri izbovej teplote (20 25 C). Všetky kroky sa musia vykonať pri uvedených teplotách. Postup predbežného farbenia zahŕňa dehydratácie, po ktorých nasleduje sušenie vzoriek. Dbajte na to, aby boli vzorky úplne suché, kým pristúpite k nasledujúcemu kroku. Nenechajte vzorky počas ďalších krokov postupu vyschnúť. Ak sa musí postup farbenia prerušiť, sklíčka je možné po kroku odstránenia parafínu uchovávať v premývacom pufri až 1 hodinu pri izbovej teplote (20 25 C). B.2 Spracovanie tkanív pred farbením Deparafinizácia a rehydratácia: Pred vykonaním postupu musia byť podložné sklíčka s tkanivami deparafinizované, aby sa odstránil parafín a aby tkanivo bolo možné rehydratovať. Zaistite úplné odstránenie parafínu. Zvyšky parafínu spôsobia zvýšené nešpecifické zafarbenie. Tento krok by sa mal vykonávať pri izbovej teplote (20 25 C). 1. Vložte sklíčka do xylénového kúpeľa a inkubujte 5 (±1) minút. Vymeňte kúpeľ a ešte raz zopakujte postup. 2. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do 96 % etanolu na 2 (±1) minúty. Vymeňte kúpeľ a ešte raz zopakujte postup. 3. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do 70 % etanolu na 2 (±1) minúty. Vymeňte kúpeľ a ešte raz zopakujte postup. 4. Odstráňte prebytočnú kvapalinu a vložte sklíčka do rozriedeného premývacieho pufra (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2) na minimálne 2 minúty. Začnite s postupom farbenia v súlade s pokynmi v časti B.3.a. alebo B.3.b., krok 1: Predbežné spracovanie. Vždy po spracovaní 200 sklíčok je potrebné pripraviť čerstvé roztoky xylénu a alkoholu. Možno používať náhrady xylénu. P04094SK_03/K str. 10/28

11 POZNÁMKA: Činidlá a pokyny dodané v tejto súprave sú vytvorené tak, aby ponúkali optimálnu účinnosť. Ďalšie riedenie činidiel alebo zmena inkubačných teplôt môže viesť k nesprávnym alebo nesúhlasným výsledkom. Rozdiely v spracovaní tkanív a v technických postupoch v laboratóriu používateľa môžu znehodnotiť výsledky testu. Voliteľné zrenie vzoriek: Pred deparafinizáciou a rehydratáciou inkubujte sklíčka pri teplote 60 C po dobu napríklad 1 hodiny na ohrievacom bloku, bloku v hybridizačnej rúre alebo v zariadení Dako Hybridizer. Taktiež môžete inkubovať sklíčka pri teplote 37 C po dobu 1 2 dní a následnou inkubáciou po dobu 1 hodiny pri teplote 60 C. Pokračujte deparafinizáciou a rehydratáciou. POZNÁMKA: Tento krok je voliteľný. Zrelé vzorky môžu znížiť potenciálny šum pozadia. B.3 Protokol farbenia Postupujte podľa jedného z dvoch variantov protokolu farbenia B.3.a alebo B3.b. Medzi uvedenými dvomi procedúrami vzájomne nezamieňajte príslušné kroky: Protokol farbenia B.3.a obsahuje informácie o poldennom postupe, ktorý je potrebné použiť v prípade sond FISH zriedených v hybridizačnom pufri s obsahom etylénuhličitanu. Protokol farbenia B.3.b obsahuje informácie o dvojdňovom postupe, ktorý je potrebné použiť v prípade sond FISH zriedených v hybridizačnom pufri s obsahom formamidu. B.3.a. Protokol farbenia pre sondy FISH zriedené v hybridizačnom pufri s obsahom etylénuhličitanu Krok 1: Predbežné spracovanie (mikrovlnná rúra, vodný kúpeľ, Pascalova (tlaková) komora) Predbežné spracovanie môže byť vykonané buď pomocou vodného kúpeľa, ako je popísané v metóde A), alebo pomocou mikrovlnnej rúry so schopnosťou snímania, ako je popísané v metóde B), alebo pomocou tlakovej nádoby Pascal, ako je popísané v metóde C). Metóda A: Predbežné spracovanie pomocou vodného kúpeľa Naplňte nádoby na farbenie (napr. Coplinove nádoby) zriedeným roztokom Pre-Treatment Solution (pozrite NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.1). Vložte farbiace nádoby obsahujúce nariedený roztok na predbežné spracovanie do vodného kúpeľa. Zahrejte vodný kúpeľ a roztok na predbežné spracovanie na teplotu C. Na zabezpečenie správnej použitej teploty odmerajte teplotu vnútri nádoby pomocou kalibrovaného teplomera. Prikryte nádoby vekami, aby sa ustálila teplota a nedošlo k vyparovaniu. Ponorte deparafinizované rezy s izbovou teplotou do vopred zahriateho roztoku Pre-Treatment Solution v nádobách na farbenie. Znova skontrolujte teplotu a inkubujte po dobu 10 (±1) minút pri teplote C. Vyberte celú nádobu so sklíčkami z vodného kúpeľa. Odpojte veko a počkajte 15 minút, kým sa sklíčka v roztoku Pre-Treatment Solution neochladia pri izbovej teplote. Preneste sklíčka do nádoby so zriedeným pufrom Wash Buffer (pozrite NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.3) na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. POZNÁMKA: Roztok na predbežné spracovanie je určený iba na jedno použitie. Nepoužívajte ho opakovane. Metóda B: Predbežné spracovanie pomocou mikrovlnnej rúry s možnosťou snímania (odporúča sa) Naplňte plastovú nádobu so zriedeným roztokom Pre-Treatment Solution s izbovou teplotou (20 25 C). Ponorte deparafinované rezy do roztoku Pre-Treatment Solution, prikryte nádobu perforovaným vrchnákom a vložte ju do mikrovlnnej rúry. Vyberte funkciu senzora varu a program, ktorý bude aktívny 10 minút po dosiahnutí teploty varu*. P04094SK_03/K str. 11/28

12 Po 10 minútach inkubácie vyberte nádobu so sklíčkami z rúry, odpojte veko a nechajte 15 minút chladnúť pri izbovej teplote. Preneste sklíčka do nádoby so zriedeným premývacím roztokom a namočte ich na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. * Použitie mikrovlnnej rúry s možnosťou snímania znamená, že rúra musí mať senzor a programy, ktoré najprv zahrejú roztok na predbežné spracovanie do bodu varu a následne udržujú požadovanú teplotu predbežného spracovania (nad 95 C) so súčasným odpočítavaním predvoleného času (10 (±1) minút). Niektoré modely mikrovlnných rúr so schopnosťou snímania nemusia mať možnosť voľne nastaviť čas odpočítavania. Ak model zahŕňa iba predvolené programy, vyberte program, ktorý udrží požadovanú teplotu predbežného spracovania (viac ako 95 C) najmenej 10 (±1) minút a manuálne zastavte program po 10 (±1) minútach. POZNÁMKA: Roztok na predbežné spracovanie je určený iba na jedno použitie. Nepoužívajte ho opakovane. Metóda C: Predbežné spracovanie pomocou Pascalovej tlakovej komory Do Pascalovej nádoby nalejte 500 ml deionizovanej vody. Naplňte plastovú nádobu 250 ml roztoku na predbežné spracovanie. Ponorte deparafinizované rezy do roztoku na predbežné spracovanie a vložte nádobu do Pascalovej nádoby. Inkubujte pri teplote 121 C po dobu 1 minúty. Po ochladení na 90 C vypustite tlak. Dôkladne si prečítajte príručku k Pascalovej komore, v ktorej nájdete informácie o správnej manipulácii s Pascalovou tlakovou nádobou. Po uvoľnení tlaku vyberte nádobu. Odpojte veká a počkajte ďalších 15 minút, kým sa sklíčka v roztoku Pre- Treatment Solution neochladia pri izbovej teplote. Premiestnite sklíčka do nádoby s nariedeným premývacím pufrom (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2). Máčajte rezy 3 minúty pri izbovej teplote. Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte krokom 2. POZNÁMKA: Roztok na predbežné spracovanie je určený iba na jedno použitie. Nepoužívajte ho opakovane. Nepoužívajte utesnenú vzduchotesnú nádobu počas predbežného spracovania v mikrovlnnej rúre, pretože tlak v nádobe sa zvýši a nádoba môže prasknúť alebo môže počas jej otvárania dôjsť k zraneniu. Kovový posuvný držiak môžete v mikrovlnnej rúre použiť vtedy, ak je kovový držiak ponorený do roztoku na predbežné spracovanie počas celého spracovania v mikrovlnnej rúre. V opačnom prípade nepoužívajte kovové predmety v mikrovlnnej rúre. Postupujte podľa pokynov výrobcu mikrovlnnej rúry. Počas 10 minút inkubácie zamedzte súvislému varu roztoku Pre-Treatment Solution. Na účely overenia správnej teploty pravidelne kontrolujte teplotu pomocou kalibrovaného teplomera. Krok 2: Pepsín, pripravený na použitie (RTU) alebo pepsínový roztok Inkubáciu pepsínu je možné vykonať priamou aplikáciou pepsínových kvapiek RTU na sklíčka pri izbovej teplote (20 25 C) (metóda A) alebo pri teplote 37 C (metóda B). Sklíčka môžete taktiež ponoriť do pepsínového roztoku a inkubovať pri teplote 37 (±2) C (metóda C). Metóda A a metóda B: Poklepaním odstráňte prebytočný pufer. Pomocou tkaniny nepúšťajúcej vlákna (napríklad absorpčná utierka alebo gáza) opatrne utrite okolie vzorky a odstráňte tak zvyšok kvapaliny, aby boli činidlá len v predpísanej oblasti. Na pokrytie vzorky použite 5 8 kvapiek (250 µl) studeného prípravku (2 8 C) Pepsin (fľaštička 2A). Prípravok Pepsin vždy uchovávajte pri teplote 2 8 C. Metóda A: Pepsín, RTU inkubácia pri teplote C Inkubujte po dobu 5 15 minút pri izbovej teplote (20 25 C). Doba inkubácie 5 15 minút bude postačovať pre väčšinu vzoriek, ale optimálna doba inkubácie môže závisieť od fixácie tkaniva alebo od hrúbky vzorky a mal by ju určiť používateľ. Odstráňte prebytočný pepsín a namočte rezy do zriedeného premývacieho pufra (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.3) na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte zriedený premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte s dehydratáciou. P04094SK_03/K str. 12/28

13 Metóda B: Pepsín, RTU inkubácia pri teplote 37 C Uložte vzorku s pepsínom na ohrievací blok s teplotou 37 C (napríklad zariadenie Dako Hybridizer) a inkubujte po dobu 3 5 minút. Doba inkubácie tri až päť minút bude postačovať pre väčšinu vzoriek, ale optimálna doba inkubácie môže závisieť od fixácie tkaniva alebo od hrúbky vzorky a mal by ju určiť používateľ. Vyklepte zvyškový pepsín a namočte rezy do zriedeného premývacieho roztoku na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte s dehydratáciou. Dehydratujte tkanivové rezy v odstupňovaných sériách etanolu: 2 minúty v 70 % etanole, 2 minúty v 85 % etanole a 2 minúty v 96 % etanole. Nechajte tkanivové rezy úplne vyschnúť na vzduchu. Metóda C: Pepsínový roztok ponorenie sklíčok do pepsínového roztoku s teplotou 37 C Súprava obsahuje činidlá postačujúce na štyri samostatné cykly (60 ml pepsínového roztoku, malá nádoba na šesť sklíčok) alebo na jeden cyklus (240 ml pepsínového roztoku, veľká nádoba na 24 sklíčok). Pripravte pepsínový roztok podľa popisu v časti A.5. Nasaďte veko na nádobu a vykonajte ekvilibráciu pepsínového roztoku na 37 (±2) C vo vodnom kúpeli. Dbajte na to, aby sa teplota ustálila. S cieľom zaistiť správnu teplotu merajte teplotu v nádobe pomocou kalibrovaného teplomera. Poklepaním odstráňte prebytočný premývací pufer. Ponorte sklíčka do pepsínového roztoku s teplotou 37 (±2) C a inkubujte ich po dobu minút. Inkubačný čas minút bude adekvátny pre väčšinu vzoriek, ale optimálny inkubačný čas môže závisieť od fixácie tkaniva a/alebo od hrúbky vzorky a mal by byť určený používateľom. Vyklepte zvyškový pepsínový roztok a namočte rezy do zriedeného premývacieho roztoku na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte s dehydratáciou. Dehydratujte tkanivové rezy v odstupňovaných sériách etanolu: 2 minúty v 70 % etanole, 2 minúty v 85 % etanole a 2 minúty v 96 % etanole. Nechajte tkanivové rezy úplne vyschnúť na vzduchu. Krok: 3 Sonda FISH zriedená v hybridizačnom pufri s obsahom etylénuhličitanu (zabezpečí používateľ) POZNÁMKA: Zmesi sondy FISH zriedené v hybridizačnom pufri s obsahom etylénuhličitanu sa musia medzi jednotlivými použitiami skladovať pri teplote 18 C. Skladovanie pri teplote 18 C vedie k separácii pufra na dve fázy. Najskôr však overte, či je prítomná iba jedna fáza formou ekvilibrácie zmesi sondy na izbovú teplotu (20 25 C) a následným premiešaním. Rozmrazte zmes sondy FISH pri izbovej teplote (20 25 C) po dobu maximálne 30 minút (chráňte pred silným svetlom) a potom pomocou vírivého mixéra riadne miešajte obsah fľaštičky po dobu 15 sekúnd pri otáčkach ot./min. Do stredu tkanivového rezu aplikujte príslušné množstvo zmesi sondy, napríklad 10 µl. Okamžite umiestnite sklenené krycie sklíčko 22 mm 22 mm na zmes sond a nechajte ju rovnomerne sa rozísť pod krycím sklíčkom. Snažte sa vyhnúť vzniku bublín. Ak sa vyskytnú vzduchové bubliny, jemne ich odstráňte z tkaniva pomocou peánu. Utesnite krycie sklíčko tmelom Coverslip Sealant tak, že vytlačíte tmel okolo okraja krycieho sklíčka. Nechajte, aby tmel na krycie sklíčko prekryl krycie aj podložné sklíčko a vytvoril tak tesnenie okolo krycieho sklíčka. Ubezpečte sa, že tmel Coverslip Sealant pokrýva celý okraj krycieho sklíčka. Pripravte si hybridizačné zariadenie Dako* (kód S2450 alebo S2451) na hybridizačný cyklus. Overte, či sú prúžky na kontrolu vlhkosti (kód S2452) saturované a v optimálnom stave na použitie. Spustite hybridizačné zariadenie a vyberte program s nasledujúcimi parametrami: Denaturácia pri teplote 66 C po dobu 10 minút s následnou hybridizáciou pri teplote 45 C po dobu minút. P04094SK_03/K str. 13/28

14 Vložte sklíčka do hybridizačného zariadenia, overte, či je veko riadne uzavreté a spustite program. Podrobné informácie nájdete v návode na používanie hybridizačného zariadenia Dako. * Na denaturáciu a hybridizáciu možno použiť prístroje, ktoré umožňujú vytvoriť podmienky identické s podmienkami uvádzanými vyššie. Uložte sklíčka na plochý kovový alebo kamenný povrch (ohrievací blok alebo blok v hybridizačnej rúre) zahriaty na 66 (±1) C. Vykonajte denaturáciu trvajúcu presne 10 minút. Umiestnite sklíčka do zahriatej zvlhčenej hybridizačnej komory. Zakryte komoru vekom a vykonajte inkubáciu pri teplote 45 (±2) C po dobu minút. Krok 4: Dôkladné premývanie Naplňte dve nádoby na farbenie (napr. Coplinove nádoby) zriedeným pufrom Stringent Wash Buffer (pozrite NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2). Odporúča sa minimálny objem 100 ml alebo 15 ml na sklíčko v každej nádobe. Vložte jednu z nádob na farbenie obsahujúcich zriedený pufer Stringent Wash Buffer pri izbovej teplote do odsávača výparov a druhú do vodného kúpeľa. Zahrejte vodný kúpeľ a zriedený roztok na dôkladné premývanie na 63 (±2) C. Overte, či sa teplota stabilizovala. Prikryte nádobu vrchnákom, aby sa ustálila teplota a nedošlo k vyparovaniu. Na zabezpečenie správnej teploty merajte teplotu vo vnútri nádoby vo vodnom kúpeli pomocou kalibrovaného teplomera. Pufer Stringent Wash Buffer obsahuje detergent a môže sa pri teplote 63 C zakaliť to však nemá vplyv na jeho účinnosť. Pomocou klieští alebo rukavíc vytiahnite sklíčka z hybridizačnej komory a opatrne odstráňte tmel Coverslip Sealant, ako aj krycie sklíčko, a po jednom začnite vkladať sklíčka do nádoby na predbežné premytie pri izbovej teplote. Ihneď po odpojení krycích sklíčok preneste sklíčka z prostredia s izbovou teplotou a prepláchnite nádobu v 63 (±2) C vodnom kúpeli. Ihneď po prenose sklíčok pri teplote 63 (±2) 63 (±2) C do zriedeného pufra Stringent Wash Buffer vo vodnom kúpeli je potrebné spustiť časovač. Dôkladné premytie vykonávajte presne 10 minút. Vytiahnite sklíčka zo zriedeného roztoku na dôkladné premývanie a namočte rezy do zriedeného roztoku na premývanie na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte zriedený premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Dehydratujte tkanivové rezy v odstupňovaných sériách etanolu: 2 minúty v 70 % etanole, 2 minúty v 85 % etanole a 2 minúty v 96 % etanole. Nechajte tkanivové rezy úplne vyschnúť. Krok 5: Naviazanie Aplikujte 15 µl média Fluorescence Mounting Medium s obsahom DAPI (fľaštička 5) do cieľovej oblasti sklíčka a použite krycie sklíčko. POZNÁMKA: Sklíčka je možné načítať po 15 minútach alebo do 7 dní od upevnenia sklíčok. Ak však sklíčka vystavíte pôsobeniu svetla alebo vysokých teplôt, dôjde k ich vyblednutiu. Na minimalizáciu vyblednutia uchovávajte sklíčka v tmavom prostredí pri teplote 18 8 C. B.3.b. Protokol farbenia pre sondy FISH zriedené v hybridizačnom pufri s obsahom formamidu DEŇ 1 Krok 1: Predbežné spracovanie (mikrovlnná rúra, vodný kúpeľ, Pascalova (tlaková) komora) Predbežné spracovanie je možné vykonať pomocou vodného kúpeľa podľa pokynov v metóde A alebo pomocou mikrovlnnej rúry so schopnosťou snímania, ako je uvedené v metóde B, alebo pomocou Pascalovej tlakovej komory, ako je uvedené v metóde C. P04094SK_03/K str. 14/28

15 Metóda A: Predbežné spracovanie pomocou vodného kúpeľa Naplňte farbiace nádoby zriedeným roztokom na predbežné spracovanie (pozrite NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.1). Vložte farbiace nádoby obsahujúce nariedený roztok na predbežné spracovanie do vodného kúpeľa. Zahrejte vodný kúpeľ a roztok na predbežné spracovanie na teplotu C. Na zabezpečenie správnej použitej teploty odmerajte teplotu vnútri nádoby pomocou kalibrovaného teplomera. Prikryte nádoby vrchnákmi (bez otvorov), aby sa ustálila teplota a nedošlo k vyparovaniu. Ponorte deparafinizované rezy do predhriateho roztoku na predbežné spracovanie. Znova overte teplotu, uzavrite viečko vodného kúpeľa a inkubujte po dobu 10 (±1) minút pri teplote C. Vyberte celú nádobu so sklíčkami z vodného kúpeľa. Zložte vrchnák (nevyberajte sklíčka). Nechajte podložné sklíčka vychladnúť v roztoku na predbežné spracovanie 15 minút pri izbovej teplote. Premiestnite sklíčka do nádoby s nariedeným premývacím pufrom (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2) na 3 minúty pri izbovej teplote. Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte krokom 2. Metóda B: Predbežné spracovanie pomocou mikrovlnnej rúry s možnosťou snímania (odporúča sa) Naplňte nádobu rozriedeným roztokom na predbežné spracovanie s izbovou teplotou (20 25 C). Ponorte deparafinizované rezy do roztoku a zatvorte vrchnák. Vrchnák musí mať otvory, aby mohol unikať tlak. Nádobu so sklíčkami vložte do mikrovlnnej rúry a zohrejte. Pred zahrievaním sa uistite, či sú vonkajšia strana nádoby a vnútro mikrovlnnej rúry suché. Inkubujte presne pod bodom varu (nie menej ako 95 C) po dobu 10 minút. Po inkubácii zložte vrchnák (nevyberajte sklíčka). Nechajte sklíčka vychladnúť v roztoku na predbežné spracovanie po dobu 15 minút pri izbovej teplote (20 25 C). Počas celého procesu predbežného spracovania musia byť podložné sklíčka prekryté pufrom. Premiestnite sklíčka do nádoby s nariedeným premývacím pufrom (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2) na 3 minúty pri izbovej teplote. Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte krokom 2. Metóda C: Predbežné spracovanie pomocou Pascalovej tlakovej komory Do Pascalovej nádoby nalejte 500 ml deionizovanej vody. Naplňte plastovú nádobu 250 ml roztoku na predbežné spracovanie. Ponorte deparafinizované rezy do roztoku na predbežné spracovanie a vložte nádobu do Pascalovej nádoby. Inkubujte pri teplote 121 C po dobu 1 minúty. Po ochladení na 90 C vypustite tlak. Dôkladne si prečítajte príručku k Pascalovej komore, v ktorej nájdete informácie o správnej manipulácii s Pascalovou tlakovou nádobou. Po uvoľnení tlaku vyberte nádobu. Odpojte veká a počkajte ďalších 15 minút, kým sa sklíčka v roztoku Pre-Treatment Solution neochladia pri izbovej teplote. Premiestnite sklíčka do nádoby s nariedeným premývacím pufrom (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2). Máčajte rezy 3 minúty pri izbovej teplote. Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte krokom 2. POZNÁMKA: Roztok na predbežné spracovanie je určený iba na jedno použitie. Nepoužívajte ho opakovane. Nepoužívajte utesnenú vzduchotesnú nádobu počas predbežného spracovania v mikrovlnnej rúre, pretože tlak v nádobe sa zvýši a nádoba môže prasknúť alebo môže počas jej otvárania dôjsť k zraneniu. Kovový posuvný držiak môžete v mikrovlnnej rúre použiť vtedy, ak je kovový držia ponorený do roztoku na predbežné spracovanie počas celého spracovania v mikrovlnnej rúre. V opačnom prípade nepoužívajte kovové predmety v mikrovlnnej rúre. Postupujte podľa pokynov výrobcu mikrovlnnej rúry. Počas 10 minút inkubácie zamedzte súvislému varu roztoku Pre-Treatment Solution. Na účely overenia správnej teploty pravidelne kontrolujte teplotu pomocou kalibrovaného teplomera. P04094SK_03/K str. 15/28

16 Krok 2: Pepsín, pripravený na použitie (RTU) alebo pepsínový roztok Inkubáciu pepsínu je možné vykonať priamou aplikáciou pepsínových kvapiek RTU na sklíčka pri izbovej teplote (20 25 C) (metóda A) alebo pri teplote 37 C (metóda B). Sklíčka môžete taktiež ponoriť do pepsínového roztoku a inkubovať pri teplote 37 (±2) C (metóda C). Metóda A a metóda B: Poklepaním odstráňte prebytočný pufer. Pomocou tkaniny nepúšťajúcej vlákna (ako je absopčná utierka alebo gáza) opatrne utrite okolie vzorky a odstráňte zvyšok kvapaliny tak, aby boli činidlá len v požadovanej oblasti. Aplikujte 5 8 kvapiek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsínu (fľaštička 2A) a dbajte na pokrytie celej vzorky. Pepsín vždy uchovávajte pri teplote 2 8 C. Metóda A: Pepsín, RTU inkubácia pri teplote C Inkubujte 5 50 minút pri izbovej teplote (20 25 C). Inkubačný čas minút pri izbovej teplote bude adekvátny pre väčšinu vzoriek, ale optimálny inkubačný čas by mal byť určený používateľom. Odstráňte prebytočný pepsín a namočte rezy do zriedeného premývacieho pufra (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.3) na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte zriedený premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte krokom 3, sonda FISH alebo si pozrite dodatok 2, kde je uvedená optimálna doba trávenia (voliteľné). Metóda B: Pepsín, RTU inkubácia pri teplote 37 C Umiestnite vzorky s pepsínom pri teplote 37 C na zariadenie Dako Hybridizer alebo na zahriaty ohrievací blok. Inkubujte po dobu 2 6 minút pri teplote 37 C. To bude postačovať pre väčšinu vzoriek pripravených podľa pokynov v časti Príprava vzorky. Optimálna doba inkubácie závisí od typu tkaniva, fixácie tkaniva, hrúbky vzoriek, zrenia vzoriek a mal by ju určiť používateľ. Tieto faktory môžu predĺžiť požadovanú dobu trávenia na 7 15 minút alebo ešte dlhšie. Pri prvom použití by mali používatelia identifikovať optimálnu dobu trávenia otestovaním reprezentatívnej vzorky tkaniva na 1, 3, 6, 12 a 18 minút. Odstráňte pepsín a namočte rezy do zriedeného premývacieho roztoku (pozrite NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.3) na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte zriedený premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte krokom 3, sonda FISH alebo si pozrite dodatok 2, kde je uvedená optimálna doba trávenia (voliteľné). Metóda C: Pepsínový roztok ponorenie sklíčok do pepsínového roztoku s teplotou 37 C Súprava obsahuje dostatok činidla na štyri samostatné cykly (60 ml pepsínového roztoku, malá nádobka na šesť sklíčok) alebo jeden cyklus (240 ml pepsínového roztoku, veľká nádobka na 24 sklíčok). Pripravte pepsínový roztok podľa popisu v časti A.5. Nasaďte veko na nádobu a vykonajte ekvilibráciu pepsínového roztoku na 37 (±2) C vo vodnom kúpeli. Dbajte na to, aby sa teplota ustálila. S cieľom zaistiť správnu teplotu merajte teplotu v nádobe pomocou kalibrovaného teplomera. Poklepaním odstráňte prebytočný premývací pufer. Ponorte sklíčka do pepsínového roztoku s teplotou 37 (±2) C a inkubujte ich po dobu minút. Inkubačný čas minút bude adekvátny pre väčšinu vzoriek, ale optimálny inkubačný čas môže závisieť od fixácie tkaniva a/alebo od hrúbky vzorky a mal by byť určený používateľom. Vyklepte zvyškový pepsínový roztok a namočte rezy do zriedeného premývacieho roztoku na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Pokračujte krokom 3, sonda FISH alebo si pozrite dodatok 2, kde je uvedená optimálna doba trávenia (voliteľné). POZNÁMKA: Odporúčame dodržiavať postup v časti Príprava vzorky. Nedostatočne natrávené tkanivo môže mať za následok žiadne signály alebo len slabé signály často s vysokou úrovňou zeleného cytozolického pozadia. P04094SK_03/K str. 16/28

17 Krok 3: Sonda FISH (poskytnutá používateľom) POZNÁMKA: Ak sa činidlá zo súpravy Dako Histology FISH Accessory Kit (kód K5799) používajú s činidlami z kódu K5731, je potrebné postupovať podľa postupu uvedeného v príbalovej informácii pre kód K5731. Nasledujúci krok treba vykonať v digestóriu. Flurochrómom značené sondy môžu byť v prípade vystavenia pôsobeniu intenzívneho svetla negatívne ovplyvnené. Nevykonávajte zvyšok tohto postupu pri intenzívnom svetle, ako je priame slnečné svetlo. Dehydratujte tkanivové rezy v odstupňovaných sériách etanolu: 2 minúty v 70 % etanole, 2 minúty v 85 % a 2 minúty v 96 % etanole (pozrite NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.4). Nechajte tkanivové rezy úplne vyschnúť na vzduchu. Aplikujte primerané množstvo fluorochrómom značenej sondy, napr. 10 µl sondy Dako FISH, do centra tkanivového rezu. Okamžite umiestnite sklené krycie sklíčko s veľkosťou 18 mm x 18 mm (alebo napr. 22 mm x 22 mm) na sondu a nechajte ju rovnomerne sa rozísť pod krycím sklíčkom. Snažte sa vyhnúť vzniku bublín. Ak spozorujete vzduchové bubliny, jemne ich pomocou peánu vyklepte von. Utesnite krycie sklíčko aplikovaním tmelu na krycie sklíčko okolo okraja krycieho sklíčka. Nechajte, aby tmel na krycie sklíčko prekryl krycie aj podložné sklíčko a vytvoril tak tesnenie okolo krycieho sklíčka. Ubezpečte sa, že tmel na krycie sklíčko utesňuje celý okraj krycieho sklíčka. Vložte sklíčka do zariadenia Dako Hybridizer (kód S2450/S2451) a ak používate sondy Dako FISH, nastavte denaturáciu na 82 C (5 minút) a hybridizáciu na 45 C na celú noc (14 20 hod.). Pokračujte dňom 2, krok 4, dôkladné premývanie. Ďalšie pokyny nájdete v príručke k hybridizačnému zariadeniu. POZNÁMKA: Alternatívne môžete použiť ohrievací blok, hybridizačnú rúru a hybridizačnú komoru (pozrite nižšie). Umiestnite sklíčko na plochý kovový alebo kamenný povrch (ohrievací blok alebo hybridizačná rúra) zahriaty na 82 (±2) C. Denaturujte po dobu 5 minút a dbajte na to, aby teplota bloku neklesla pod 80 C. Umiestnite sklíčka do zahriatej zvlhčenej hybridizačnej komory. Zakryte komoru viečkom a ak používate sondy Dako FISH, inkubujte cez noc (14 20 hodín) pri teplote 45 (±2) C. DEŇ 2 Krok 4: Dôkladné premývanie Naplňte dve farbiace nádoby rozriedeným roztokom na dôkladné premytie (pozri NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.2). Pre 1 6 sklíčok v nádobe sa vyžaduje minimálny objem 100 ml rozriedeného roztoku na dôkladné premytie. Pre viac ako 6 sklíčok použite minimálne 15 ml pufra na sklíčko. Vložte jednu z nádob na farbenie obsahujúcich zriedený pufer Stringent Wash Buffer pri izbovej teplote do digestória a druhú do vodného kúpeľa. Zahrejte vodný kúpeľ a zriedený roztok na dôkladné premývanie na 65 (±2) C. Overte, či sa teplota stabilizovala. Prikryte nádobu vrchnákom, aby sa ustálila teplota a nedošlo k vyparovaniu. Teplotu v nádobe merajte pomocou kalibrovaného teplomera, aby ste zabezpečili správnu teplotu. Vyberte sklíčka z hybridizačnej komory. Pomocou peánu jemne odstráňte tmel na krycie sklíčko, ako aj krycie sklíčko a vložte podložné sklíčko do nádoby na predbežné premytie pri izbovej teplote. Po vybratí všetkých krycích sklíčok preneste sklíčka z nádoby na predbežné premytie pri izbovej teplote do nádoby vo vodnom kúpeli s teplotou 65 (±2) C. Zatvorte vrchnák na nádobe a potom vrchnák na vodnom kúpeli. Dôkladne premývajte presne 10 minút pri teplote 65 (±2) C. Vyberte podložné sklíčka z rozriedeného pufra na dôkladné premytie a namočte rezy v rozriedenom premývacom pufri na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C). Vymeňte zriedený premývací pufer a máčajte rezy ďalšie 3 minúty. Dehydratujte tkanivové rezy v odstupňovaných sériách etanolu: 2 minúty v 70 % etanole, 2 minúty v 85 % etanole a 2 minúty v 96 % etanole (pozrite NÁVOD NA POUŽITIE, časť A.4). Nechajte sklíčka úplne vyschnúť na vzduchu. P04094SK_03/K str. 17/28

18 Krok 5: Naviazanie Aplikujte 15 µl fluorescenčného väzobného média (fľaštička 5) obsahujúceho modré fluorescenčné kontrastné farbivo do cieľovej oblasti sklíčka a aplikujte krycie sklíčko (napr. 24 mm 50 mm alebo 24 mm 60 mm). Nechajte, aby sa médium rovnomerne rozložilo na vzorke. POZNÁMKA: Sklíčka je možné načítať po 15 minútach alebo do 7 dní od upevnenia sklíčok. Ak sú sklíčka vystavené svetlu alebo vysokým teplotám, môže dôjsť k vyblednutiu. Sklíčka je potrebné skladovať na tmavom mieste pri teplote 18 8 C. Kontrola kvality 1. Signály musia byť jasné, zreteľné a ľahko hodnotiteľné. 2. Normálne tkanivo predtým preukázané pre jamku FISH je potrebné použiť ako kontrolu spusteného testu. 3. Normálne tkanivové bunky by mali mať jasne viditeľné fluorescenčné signály, indikujúce, že sondy FISH sa úspešne hybridizovali na cieľové oblasti. 4. Chyba pri detekcii signálov pri normálnych tkanivových bunkách znamená chybu samotného testu a výsledky je nutné považovať za neplatné. 5. Z dôvodu narezania tkaniva môžu niektoré normálne bunky vykazovať menej signálov, ako je očakávané množstvo. 6. Morfológia jadra musí ostať neporušená a homogénne zafarbená pri vyhodnocovaní pomocou filtra DAPI. Početné priezračné bunky, prstencovité bunky a všeobecne nekvalitná morfológia znamenajú príliš silné enzymatické spracovanie vzorky alebo jej prílišnú denaturáciu, čo môže viesť k strate alebo fragmentácii signálov. Periférne farbenie, otvory v bunkách (filter DAPI) a/alebo silné zafarbenie zeleného cytozolického pozadia pri pozorovaní pomocou dvojitého filtra s texaskou červeňou/fitc môžu naznačovať nedostatočné natrávenie, ktoré môže viesť k strate signálu. Takéto vzorky nie sú vhodné pre ďalšie hodnotenie. 7. Rozdiely vo fixácii, spracovaní a zalievaní tkanív v laboratóriu používateľa môžu spôsobiť výraznú variabilitu výsledkov, ktorá si vyžiada pravidelné vykonávanie vlastných kontrol. Interpretácia výsledkov Pozorne si prezrite niekoľko oblastí buniek, aby ste vzali do úvahy možnú heterogenitu. Vyberte oblasť s dobrým rozložením jadier. Začnite analýzu v ľavom hornom kvadrante vybranej oblasti a pozorne prezerajúc zľava doprava spočítajte množstvo signálov v rámci okraja jadra každého z hodnotených jadier podľa nasledujúcich pokynov. Zaostrujte, aby ste našli všetky signály v jednotlivých jadrách. Nevyhodnocujte jadrá bez signálov. Nezahŕňajte jadrá, ktoré vyžadujú subjektívne hodnotenie. Vynechajte jadrá so slabou intenzitou signálu a nešpecifickým alebo výrazným pozadím. Používateľ musí určiť počet jadier, ktoré je potrebné spočítať pre každú sondu. Vyhnite sa oblastiam, kde sú hranice jadier nejednoznačné. Obmedzenia 1. Optimálna doba inkubácie pepsínového trávenia môže závisieť od fixácie tkaniva a/alebo hrúbky vzorky a je nevyhnutné, aby túto dobu určil a overil používateľ. 2. Informácie o účele použitia sondy FISH nájdete v príbalovom letáku k jednotlivým sondám FISH (v príslušných informáciách o produkte). 3. FISH predstavuje viackrokový proces, ktorý vyžaduje špecializované školenie v oblasti výberu vhodných činidiel, výberu, fixácie a spracovania tkaniva, prípravy sklíčka FISH a interpretácie výsledkov zafarbenia. 4. Výsledky FISH závisia od manipulácie s tkanivom a od jeho spracovania pred samotným farbením. Nesprávna fixácia, umývanie, sušenie, zahrievanie, delenie na rezy alebo P04094SK_03/K str. 18/28

19 kontaminácia inými tkanivami prípadne tekutinami môže ovplyvňovať hybridizáciu sondy. Príčinou nekonzistentných výsledkov môžu byť odchýlky v metódach fixácie a zalievania, alebo k takýmto výsledkom môže dochádzať v dôsledku vnútorných nepravidelností v tkanive. 5. Na dosiahnutie optimálnych a opakovateľných výsledkov je nevyhnutné úplne deparafinizovať sklíčka s tkanivami. Odstránenie parafínu je potrebné vykonať na začiatku procesu farbenia. (Prečítajte si NÁVOD NA POUŽITIE, časť B.2.) 6. Používajte výlučne vodný kúpeľ, ohrievací blok a hybridizačnú pec s kalibrovanou teplotou. Použitie iných typov zariadení môže viesť k odpareniu produktu Probe Mix počas hybridizácie s následným nevyhnutným overovaním používateľom. P04094SK_03/K str. 19/28

20 Riešenie problémov Problém Pravdepodobná príčina Odporúčaný postup 1. Žiadne signály alebo slabé signály 1a. Neprimeraná doba trávenia. 1a. Zaistite, aby sa používali tkanivové rezy fixované formalínom a zaliate v parafíne. Pomôcť by mohla Predĺžená doba trávenia, napríklad 7-15 minút alebo ešte dlhšie pri teplote 37 C. Prečítajte si časť B.3.a alebo B.3.b, krok 2, Riešenie problémov, bod 4d, 4e a prílohu 2. 1b. Súprava bola vystavená vysokým teplotám počas prepravy alebo skladovania. 1c. Nesprávne podmienky predbežného spracovania. 1d. Nesprávne podmienky denaturácie. 1b. Skontrolujte podmienky skladovania. Ubezpečte sa, že bol pri doručení zásielky prítomný suchý ľad. Zabezpečte, aby sa fľaštičky 2A a 5 skladovali pri teplote 2 8 C, a aby sa fľaštička 5 skladovala na tmavom mieste. 1c. Ubezpečte sa, že sa používa odporúčaný čas a teplota na predbežné spracovanie. Podľa potreby overte, či bol optimalizovaný inkubačný čas trávenia, pozrite časť B.3.a alebo B.3.b, krok 2. Čím bližšie je teplota na predbežné spracovanie k bodu varu, tým sú signály silnejšie. Zaistite správnu teplotu pri manipulácii s pepsínom. Pozri časť B.1. 1d. Overte, či sa používajú odporúčaná teplota a čas denaturácie. 1e. Nesprávna teplota hybridizácie. 1e. Keď používate sondy Dako FISH, hybridizujte pri teplote 45 (±2) C. 1f. Odparenie pufra sondy počas hybridizácie. 1f. Zaistite dostatočnú vlhkosť v hybridizačnej komore. Použite zariadenie Dako Hybridizer (kód S2450/S2451) a prúžky na kontrolu vlhkosti pre hybridizačné zariadenie (kód S2452). Použite tmel na krycie sklíčko. Pozri časť Riešenie problémov bod 5a a 5b. P04094SK_03/K str. 20/28

21 1g. Nesprávne podmienky dôkladného premytia. 1h. Mikroskop nefunguje správne - Nevhodná súprava filtrov - Nevhodná lampa - Príliš stará ortuťová výbojka - Vypálené filtre - Znečistené a/alebo prasknuté šošovky kolektora - Nevhodný olej použitý na ponorenie 1g. Ubezpečte sa, že sa používa odporúčaný objem, teplota a čas dôkladného premytia, a že krycie sklíčka boli odstránené pred vykonaním dôkladného premytia. 1h. Skontrolujte mikroskop a ubezpečte sa, či sú použité filtre vhodné na použitie s fluorochrómami, či nie sú opotrebované a či je ortuťová výbojka vhodná a nepoužíva sa po uplynutí očakávanej životnosti (pozri dodatok 1). Použite vhodný olej určený na ponorenie pre fluorescenciu. V prípade pochybností kontaktujte vášho miestneho predajcu mikroskopov. 1i. Strácajúce sa signály. 1i. Zabráňte dlhotrvajúcemu mikroskopickému skúmaniu a minimalizujte vystavenie intenzívnym svetelným zdrojom. 2. Oblasti bez signálu 2a. Množstvo sond je príliš malé. 2a. Zaistite, aby bolo množstvo sond dostatočné na pokrytie oblasti pod krycím sklíčkom. 3. Nadmerné zafarbenie pozadia 2b. Počas aplikácie sondy alebo uzatvárania sa vo vzorke zachytili vzduchové bubliny. 2c. Nedostatočné odstránenie parafínu. 3a. Neprimeraná doba trávenia. Silné zelené cytozolické pozadie môže naznačovať nedostatočné natrávenie. 3b. V časti B.3 došlo k vysušeniu rezov. 2b. Snažte sa vyhnúť vzniku bublín. Ak ich spozorujete, jemne ich pomocou peánu vyklepte von. 2c. Zaistite, aby bol parafín úplne odstránený z rezov. Pozri časť B.2. 3a. Zaistite, aby sa používali tkanivové rezy fixované formalínom a zaliate v parafíne. Predĺžená doba trávenia, napríklad 7 15 minút pri teplote 37 C by mohla pomôcť. Prečítajte si časť B.3.a alebo B.3.b. krok 2, časť Riešenie problémov bod 4e a dodatok 2. 3b. Postupujte podľa pokynov a zabráňte vyschnutiu sklíčok, ak to nie je špecifikované. P04094SK_03/K str. 21/28

22 3c. Parafín nie je odstránený úplne. 3c. Dodržiavajte postupy deparafinizácie a rehydratácie popísané v časti B.2 3d. Teplota dôkladného premytia bola príliš nízka. 3e. Dlhotrvajúce vystavenie hybridizovaného rezu intenzívnemu svetlu. 3f. Exspirované podložné sklíčka alebo nevhodné sklíčka môžu spôsobiť nadmerné červené hviezdnaté farbenie. 3d. Overte, či sa používa odporúčaná teplota dôkladného premývania. 3e. Zabráňte dlhotrvajúcemu mikroskopickému skúmaniu a minimalizujte vystavenie intenzívnemu svetlu. 3f. Používajte odporúčané typy sklíčok a uistite sa, že nie sú exspirované. Pozri časť Rezy zaliate v parafíne. 4. Zlá morfológia jadier alebo slabé farbenie jadier 3g. Nefluorescenčný olej na ponorenie zmiešaný s fluorescenčným väzobným médiom. 4a. Nesprávne podmienky predbežného spracovania môžu mať za následok nejasný alebo zakalený vzhľad. 4b. Vrenie počas predbežného spracovania môže viesť k poškodeniu morfológie a strate signálov. 4c. Nesprávne spracovanie pepsínom. 4d. Príliš dlhé spracovanie pepsínom rozpustí tkanivo a spôsobí stratu signálov. Nadmerné trávenie môže spôsobiť, že sa objavia priezračné bunky alebo prstencovité jadrá a jadrá so všeobecne nekvalitnou morfológiou. 3g. Použite veľké krycie sklíčka pri upevňovaní podľa odporúčania. Prečítajte si časť B.3.a alebo B.3.b, krok 5. Tým sa zabráni zmiešaniu oleja na ponorenie s väzobným médiom, zabráni autofluorescencii a neúmyselnému odstráneniu krycích sklíčok objektívom mikroskopu. 4a. Ubezpečte sa, že sa používa odporúčaný čas a teplota na predbežné spracovanie. Pozri časť Riešenie problémov bod 4b e. 4b. Zabráňte vreniu. Pozri B.3, krok 1. Takisto pozri časť Riešenie problémov bod 4d. 4c. Dodržiavajte odporúčané inkubačné doby pre pepsín. Pozri časť B.3, krok 2 a dodatok 2. Takisto pozri časť Riešenie problémov bod 1a, 1c 3a, 4d a 4e. 4d. Skráťte čas inkubácie pepsínom. Prečítajte si časť B.3.a alebo B.3.b, krok 2 a prílohu 2. Overte, či majú rezy hrúbku 2 6 µm. Takisto pozri časť Riešenie problémov bod 1a, 1c, 4b a 4e. P04094SK_03/K str. 22/28

23 5. Krycie sklíčko silno prilieha k podložnému sklíčku po hybridizácii, a tak sa ťažko odstraňuje. 4e. Príliš krátke spracovanie pepsínom môže viesť k strate signálov. Nedostatočne natrávené tkanivo môže spôsobiť periférne farbenie jadier a otvory v jadrách (filter DAPI); silno zelené pozadie v cytozole (dvojitý filter s texaskou červeňou/fitc). Všimnite si, že jadrá v nedostatočne natrávenom tkanive majú peknú dobrú morfológiu na rozdiel od príliš natráveného tkaniva. 4f. Príliš vysoká teplota denaturácie. 4g. Nesprávne podmienky hybridizácie. 5a. Krycie sklíčko nevhodne prilieha k podložnému sklíčku. 5b. Nesprávne podmienky hybridizácie. Môžu zapríčiniť zníženie alebo stratu signálov, poškodenie tkaniva a farbenie pozadia. 4e. Predĺžte čas inkubácie pepsínom na napr. 2-3-násobok použitej doby trávenia. Takisto pozri časť Riešenie problémov bod 1a, 1c, 3a, 4a a 4d. 4f. Overte, či sa používa odporúčaná teplota denaturácie. 4g. Pozri časť Riešenie problémov bod 1f a 5b. 5a. Neodstraňujte krycie sklíčko nasilu, ak silne prilieha k podložnému sklíčku. Ponorte sklíčko do nádoby s rozriedeným pufrom na dôkladné premytie s izbovou teplotou na päť minút a potom odstráňte krycie sklíčko. Dodržiavajte odporúčania týkajúce sa utesnenia krycieho sklíčka v časti B.3a alebo B.3.b, krok 3. Takisto pozri časť Riešenie problémov bod 1f a 5b. 5b. Zaistite dostatočnú vlhkosť v hybridizačnej komore. Použite zariadenie Dako Hybridizer (kód S2450/S2451) a prúžky na kontrolu vlhkosti pre hybridizačné zariadenie (kód S2452). Dodržiavajte pokyny uvedené v príbalovom letáku pre prúžky na kontrolu vlhkosti pre Hybridizer. Prečítajte si odporúčané podmienky na hybridizáciu v časti B.3.a alebo B.3.b, krok 3. Takisto pozri časť Riešenie problémov bod 1f a 5a. P04094SK_03/K str. 23/28

24 6. Vysoká úroveň zelenej autofluorescencie na sklíčku vrátane oblastí bez tkaniva FFPE. 6. Použitie exspirovaných alebo neodporúčaných podložných sklíčok. 6. Ubezpečte sa, či potiahnuté podložné sklíčka (silanizované podložné sklíčka Dako, kód S3003, alebo sklíčka potiahnuté lyzínom) neprekročili dátum exspirácie. POZNÁMKA: Ak nie je možné za príčinu problému považovať žiadnu z uvedených položiek alebo ak sa nepodarí problém vyriešiť odporúčaným postupom, obráťte sa so žiadosťou o pomoc na oddelenie technickej podpory spoločnosti Dako. P04094SK_03/K str. 24/28

25 Dodatok 1 Histologická súprava príslušenstva FISH, kód K5799 Špecifikácie fluorescenčného mikroskopu Dako odporúča nasledujúce vybavenie na použitie s histologickou súpravou príslušenstva FISH, keď používate sondy Dako FISH: 1. Typ mikroskopu Epifluorescenčný mikroskop. 2. Lampa 100-watová ortuťová výbojka (spravidla by sa mala vymeniť každých 200 hodín). 3. Objektívy Na skríning tkaniva sú použiteľné 10x fluorescenčné suché objektívy alebo 16x fluorescenčné objektívy ponorené v oleji. Na vysoké zväčšenie a vyhodnotenie signálov sa odporúčajú len fluorescenčné objektívy ponorené v oleji, napr. 63x alebo 100x. 4. Filtre Filtre sú samostatne určené na špecifické fluorochrómy a musia sa zvoliť podľa toho. Dako odporúča použitie špecifického filtra DAPI v kombinácii s kvalitným dvojitým filtrom s texaskou červeňou/fitc pri použití sond Dako FISH. Filter DAPI Dvojitý filter Texas Red/FITC Jednotlivé filtre Texas Red a FITC sa môžu používať na potvrdenie Fluorochrom Vlnová dĺžka excitácie Vlnová dĺžka emisie FITC 495 nm 520 nm Texaská červeň 596 nm 615 nm Filtre sú špecifické pre každý typ mikroskopu a použitie príslušných filtrov je pre interpretáciu rozhodujúce. Ak chcete získať podrobnejšie informácie, kontaktujte výrobcu mikroskopov alebo zástupcu spoločnosti Dako, prípadne navštívte webovú stránku spoločnosti Dako. 5. Olej Nefluorescenčný olej na ponorenie. Bezpečnostné opatrenia Špecifické fluorochrómy vyžadujú odlišné vybavenie. Pre sondy Dako FISH sa neodporúča 50-wattová ortuťová výbojka, nemôžu sa použiť rodamínové filtre a trojité filtre sa vo všeobecnosti neodporúčajú. Neoptimalizovaný mikroskop môže zapríčiniť problémy pri čítaní fluorescenčných signálov. Je dôležité, aby svetelný zdroj nebol po exspirácii a aby bol správne zarovnaný a sústredený. Zákazníci musia sledovať a dodržiavať odporúčania výrobcu týkajúce sa ortuťovej výbojky a mikroskopu je potrebné venovať starostlivosť. Je potrebné vyvinúť maximálne úsilie, aby bola vzorka vystavená čo najmenšiemu excitačnému svetlu, aby sa minimalizovalo vyblednutie fluorescencie. Odporúčame, aby ste sa pred spustením fluorescenčnej hybridizácie in situ pri nastavení mikroskopu poradili s výrobcom, alebo si prečítajte príslušnú literatúru. P04094SK_03/K str. 25/28

26 Dodatok 2 Voliteľný krok na optimalizáciu doby trávenia pepsínom Tento voliteľný krok je možné použiť na hodnotenie účinku trávenia pepsínom a na optimalizovanie doby trávenia použitej v kroku 2, pepsín. Aby ste mohli kontrolovať, či je použitá doba trávenia pepsínom dostatočná, zafarbite premytý tkanivový rez trávený pepsínom pomocou 10 µl propidium jodidu (400 ng/ml) dodaného používateľom. Krycie sklíčko s veľkosťou 22 mm x 22 mm umiestnite na propidium jodid a nechajte ho rovnomerne sa rozložiť pod krycím sklíčkom. Inkubujte 1 minútu. Použite fluorescenčný mikroskop s dvojitým filtrom s texaskou červeňou/fitc (pozri dodatok 1) na hodnotenie červeného sfarbenia jadier pomocou propidium jodidu. Ak je trávenie tkaniva prijateľné, mali by sa objaviť červené jadrá s dobre definovanými hranicami. Odstráňte propidium jodid namočením rezov v zriedenom premývacom pufri dvakrát na 3 minúty pri izbovej teplote (20 25 C) a pokračujte časťou B3, Protokol farbenia, krok 3, sonda FISH. Ak sú jadrá stále zelené pri autofluorescencii a nezafarbené načerveno pomocou propidium jodidu, je potrebné zopakovať cyklus trávenia: Namočte rezy do zriedeného premývacieho pufra dvakrát na 3 minúty pri izbovej teplote (20-25 C) a odstráňte propidium jodid. Aplikujte 5 8 kvapiek (250 µl) studeného (2 8 C) pepsínu (fľaštička 2) na pokrytie vzorky. Fľaštičku s pepsínom vždy skladujte pri teplote 2 8 C. Umiestnite sklíčka pri teplote 37 C na zahriaty ohrievací blok alebo do zariadenia Dako Hybridizer. Inkubujte 10 minút, ak sa nevyskytlo žiadne alebo len slabé trávenie. 10 minút je len orientačný údaj, používateľ by mal určiť optimálny čas. Znova namočte rezy do zriedeného premývacieho roztoku na 3 minúty pri izbovej teplote (20-25 C) na odstránenie pepsínu. Ešte raz aplikujte 10 µl propidium jodidu (400 ng/ml) na 1 minútu. Vyhodnoťte sfarbenie a namočte rezy do zriedeného premývacieho pufra dvakrát na 3 minúty pri izbovej teplote (20-25 C). V prípade potreby opakujte cyklus alebo pokračujte časťou B.3.a alebo B.3.b, Protokol farbenia, krok 3, sonda FISH. POZNÁMKA: Súprava obsahuje množstvo činidiel, ktoré postačuje na vykonanie 20 testov. Použitie premývacieho pufra a pepsínu v tomto voliteľnom kroku zníži celkový počet možných testov s touto súpravou. P04094SK_03/K str. 26/28

27 Referenčná literatúra 1. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 CFR 7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; Brown RSD, Edwards J, Bartlet JW, Jones C, Dogan A. Routine acid decalcification of bone marrow samples can preserve DNA for FISH and CGH studies in metastatic prostate cancer. J Histochem Cytochem : Alers JC, Krijtenberg P-J, Visser KJ, van Dekken H. Effect of bone decalcification procedures on DNA in situ hybridization and comparative genomic hybridization: EDTA is highly preferable to a routinely used acid decalcifier. J Histochem Cytochem : Provan AB, Hodges E, Smith AG, Smith JL. Use of paraffin wax embedded bone marrow trepine biopsy specimens as a source of archival DNA. J Clin Pathol : Sarsfield P, Wickham CL, Joyner MV, Ellard S, Jones DB, Wilkins BS. Formic acid decalcification of bone marrow trephines degrades DNA: alternative use of EDTA allows the amplification and sequencing of relatively long PCR products. Mol Pathol : Reineke T, Jenni B, Abdou MT, Frigerio S, Zubler P, Moch H, Tinguely M. Ultrasonic decalcification offers new perspectives for rapid FISH, DNA, and RT-PCR analysis in bone marrow trephines. Am J Surg Pathol : Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; P04094SK_03/K str. 27/28

28 Vysvetlenie symbolov Katalógové číslo Teplotné obmedzenie Číslo šarže Lekársky nástroj na diagnostiku in vitro Pozri návod na použitie Chrániť pred priamym slnečným svetlom (pozri časť Uskladnene) Obsah postačuje na <n> testov Použiť do Výrobca Piktogram GHS (pozri časť o preventívnych opatreniach) Piktogram GHS (pozri časť o preventívnych opatreniach) Piktogram GHS (pozri časť o preventívnych opatreniach) Piktogram GHS (pozri časť o preventívnych opatreniach) Piktogram GHS (pozri časť o preventívnych opatreniach) Verzia Výrobca: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 Tel DK-2600 Glostrup Fax Dánsko P04094SK_03/K str. 28/28