ZISŤOVANIE KINETICKÝCH PARAMETROV KATALYZOVANEJ REAKCIE
1. TEORETICKÝ ÚVOD Dôležitou súčasťou pri navrhovaní ale aj prevádzkovaní všetkých typov chemických reaktorov je znalosť kinetiky dejov prebiehajúcich v reaktore. Je teda dôležité vedieť ako rýchlo prebieha chemická reakcia, kedy dosiahnem požadovanú konverziu, aká bude maximálna produktivita a aké budú celkové náklady pri požadovanej konverzii alebo produktivite. Vyšetrovanie kinetiky je však na rozdiel od vyšetrovania rovnováh podstatne zložitejšie, pretože časová zmena stavu nezávisí len od začiatočného a konečného podmienok, ale je nutné vedieť aj akým mechanizmus sa chemická premena realizuje. Napriek mnohým pokusom spracovať kinetiku teoreticky, jediným možným riešením zistenia kinetiky chemickej reakcie je experiment Základom kinetických experimentov je meranie rýchlostí chemickej reakcie pri rôznych koncentráciách substrátov, zisťovanie vplyvu teploty a tlaku na rýchlosť reakcie, ale aj zisťovanie vplyvu látok ktoré síce nie sú síce zahrnuté v stechiometrickej rovnici ale v značnej miere ovplyvňujú priebeh reakcie (katalyzátory, inhibítory). Katalyzátory sú látky ktoré neovplyvňujú rovnováhu reakcie ale prispievajú k jej rýchlejšiemu priebehu. Toto je možné iba tak že premena substrátov na produkt za prítomnosti katalyzátora prebieha menej náročným energetickým spôsobom ako v prípade reakcie bez katalyzátora. Na predstavu najjednoduchším typom katalyzovanej reakcie je homogénna katalýza kde reaktanty aj katalyzátor majú rovnaké skupenstvo( kvapzln0, plynné). Typickou homogénnou katalýzou je výroba kyseliny sírovej komorovým(1746) spôsobom kde sa urýchľuje oxidácia SO2 na SO3 pomocou oxidov dusíka. Avšak homogénnu katalýzu reprezentujú aj všetky biochemické pochody v bunke kde reaktanty ale aj katalyzátory(enzýmy) sú vo vodnej fáze. Princíp katalyzovanej reakcie je teda bez ohľadu na štruktúru použitého katalyzátora (enzým, oxidy dusíka, Pt,V2O5, Fe2O3) rovnaký a rovnakým spôsobom sa sleduje a vyhodnocuje aj kinetika reakcií. Jediným rozdielom medzi enzýmami a klasickými katalyzátormi používanými v tradičných chemických výrobách sú podmienky za akých pracujú a ich špecificita. Väčšina enzýmov je na rozdiel od syntetických katalyzátorov vysoko špecifická a daný enzým je katalyzátorom len pre jednu reakciu, kde sa premieňa len určitý substrát na príslušný produkt. To prináša veľké výhody pretože odpadajú dodatočné náklady na separáciu nežiaducich reakčných produktov. Špecifičnosť enzýmu je dôsledkom jeho trojrozmerného priestorového usporiadania, ktoré umožňuje len určitému substrátu, o danom tvare a veľkosti, sa s ním spojiť na aktívnom mieste enzýmu. Z dôvodu relatívne krehkej priestorovej štruktúry enzýmy pracujú pri 2
podstatne miernejších podmienkach (nižšia teplota, tlak, konštantné ph) ako klasické katalyzátory. Navyše pre enzýmy je charakteristická vysoká účinnosť, napr. jedna molekula enzýmu je schopná pri 20 až 38 C premeniť 10 až 10 5 molekúl substrátu za sekundu čo o mnoho poriadkov prevyšuje rýchlosti reakcií katalyzovaných klasickými katalyzátormi. Pre priebeh homogénnych katalyzovaných reakcií bol vypracovaný veľký počet modelových predstáv. Väčšina z nich predpokladá vznik aktivovaného komplexu medzi katalyzátorom a aspoň jedným reaktantom. Po rozpade komplexu sa uvoľní reakčný produkt a voľný katalyzátor ktorý opäť vytvára komplex s novou molekulou substrátu. V prípade enzýmov je za katalytickú aktivitu zodpovedná relatívne malá oblasť molekuly, nazývaná aktívny centrum. Toto miesto obsahuje skupinu alebo skupiny, schopné reagovať s molekulou substrátu. Ak sa molekula enzýmu a substrátu zrazí vo vhodnej orientácii, je substrát v aktívnom mieste viazaný a vzniká tzv. komplex enzým-substrát (ES). Existencia komplexu bola reálne preukázaná pomocou elektrónovej mikroskopie a rentgenoštrukturnou analýzou, v niektorých prípadoch bol komplex aj izolovaný z reakčnej zmesi. Samo aktívne miesto tvorí zvyčajne priehlbinu na povrchu molekuly a substrát do neho zapadá ako do určitej "formy". Tým je zabránené väzbe iných látok a zaručená presná orientácia substrátovej molekuly. Väzbou substrátu sa súčasne mení štruktúra aktívneho miesta aj substrátu samého. Vzniká labilná konfigurácia, ktorá vyvoláva ďalšie štrukturálne zmeny, tj práve príslušnú katalyzovanú reakciu. Ako náhle je substrát chemicky zmenený na produkt, stráca schopnosť väzby na enzým, uvoľňuje sa produkt a aktívne miesto sa vracia do pôvodného stavu. Vyššie uvedený mechanizmus znázorňuje nasledujúca rovnica: S k1 k 3 k 2 + E SE E + P (1) kde E,S,SE,P sú enzým, substrát, komplex enzýmu so substrátom a produkt, k 1, k 2, k3 sú rýchlostné konštanty. Vyššie uvedený mechanizmus v podmienkach ustáleného stavu (steady-state) opisuje rovnica Michaelis Mentenovej v tvare: dc v = dt kde P dc = dt S Max, K M V = K Max M * c + c S S v, V sú rýchlosť a maximálna rýchlosť reakcie a Michaelisova konštanta. Pre maximálnu rýchlosť reakcie a Michaelisovu konštantu platí: V = k * c (2) Max 3 E 3
K k + k 2 3 M = (3) k1 kde c E je celková koncentrácia enzýmu. Z rovnice (1) je zrejmá súvislosť medzi rýchlosťou reakcie a koncentráciou substrátu. Pri veľmi malej koncentrácii substrátu, keď je c s oveľa menšie ako K M, rýchlosť je priamo úmerná koncentrácii substrátu podľa rovnice: V * c Max S v = (4) KM Naopak pri príliš vysokej koncentrácii substrátu, keď c s je oveľa väčšie ako K M rýchlosť dosiahne maximálnu hodnotu a nezávisí od koncentrácie substrátu: v = V Max (5) Keď c s = K M, potom VMax v = a hodnota K M je teda taká koncentrácia substrátu pri ktorej 2 je reakčná rýchlosť rovná polovici maximálnej rýchlosti. V prípade reakčnej kinetiky je možné vyhodnotiť kinetické parametre z diferenciálnych alebo integrálnych experimentálnych údajov. V prípade integrálnych údajov meriame časovú zmenu koncentrácie produktu alebo substrátu v reakčnej zmesi (priebehové krivky), v prípade diferenciálnych údajov meriame koncentráciu produktu alebo substrátu v reakčných zmesiach s rôznou začiatočnou koncentráciou substrátu z čoho sa potom ľahko zistí závislosť v = f ( c ) a vypočítajú kinetické parametre Michaelis Mentenovej rovnice. S Kinetický experiment prebieha tak, že v čase nula sa do vodného roztoku substrátu vyhriateho na reakčnú teplotu pridá enzým a v presných časových intervaloch sa odoberajú vzorky kde sa reakcia zastaví. Koncentrácie spotrebovaného substrátu alebo vzniknutého produktu v jednotlivých vzorkách sa stanoví vhodnou analytickou metódou. Pri vyhodnocovaní kinetických parametrov, sa použijú len začiatočné údaje zmeny koncentrácie od času (rýchlosť vzniku resp. zániku zložky diferenciálne údaje) keď sú oni ešte stále lineárnou závislosťou. Z nameraných údajov, koncentrácie substrátu/produktu ako funkcia času, sa vypočíta smernica priamkovej závislosti pre danú začiatočnú koncentráciu substrátu: dcp dcs = = = dt dt t= 0 t= 0 ( ri ) t 0 (6) 4
Obrázok 1. znázorňuje typické údaje namerané metódou začiatočných rýchlostí 7.00E-06 6.00E-06 r P (mmol/dm 3 /min) 5.00E-06 4.00E-06 3.00E-06 2.00E-06 1.00E-06 0.00E+00 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 c S0 (mol/dm 3 ) Obr. 1 Typické experimentálne údaje rýchlosti enzýmovej reakcie namerané metódou začiatočných rýchlostí. Hodnoty kinetických parametrov sa z experimentálnych údajov môžu zistiť buď graficky alebo lineárnou resp. nelineárnou regresiou. Keďže Michealis Mentenovej rovnice je nelineárna funkcia, kinetické parametre zistené lineárnou regresiou sú nepresné a linearizácia sa používa iba na prvotný odhad hodnôt kinetických parametrov. Presnejšou metódou na vyhodnotenie parametrov matematického modelu je nelineárna regresia. Zistenie kinetických parametrov je dôležité pre kalkuláciu produktivity reakčného systému. Produktivita sa niekde definuje aj ako špecifický výkon reaktora. Optimálna produktivita je jedným z najdôležitejších kritérií pri návrhu a prevádzkovaní reaktora. Vyjadruje koľko žiadaného produktu sa vyprodukuje za jednotku času v danom objeme v danom reakčnom čase. Vypočíta sa podľa vzťahu : c p *VL Pr = (3.33) V R ( t + t ) op i 5
kde Pr je produktivita systému, V R je objem reaktora,v L je objem kvapalnej fázy v reaktore, t op je operačný čas, t i je reakčný čas. Operačný čas predstavuje čas na vyprázdnenie, vyčistenie a znovu naplnenie reaktora. Z časového priebehu produktivity sa zistí maximálna produktivita pre danú vstupnú koncentráciu substrátu. Avšak maximálne produktivita nie je jediným kritériom pri návrhu reaktora, do úvahy treba brať aj náklady na dosiahnutie max. produktivity (napr. náklady na miešadlo, náklady na substrát, katalyzátor, náklady na dosiahnutie reakčnej teploty). Náklady na miešadlo, vyjadrené ako celkový príkon na miešadlo pre dosiahnutie max. produktivity, sú často dôležitým prevádzkovým nákladom. Ak je na hriadeli viac ako jedno miešadlo na výpočet príkonu možno aplikovať nasledujúci vzťah: P 3 5 = ni N p ρ L N d M (2.28) kde P je príkon na miešadlo v neaerovanom systéme, n I je počet miešadiel, N P je príkonové číslo pre Rushtonovu turbínu N P =5.2, ρ L je hustota miešanej kvapaliny, N je počet otáčok miešadla, d M je priemer miešadla. 2. CIEĽ PRÁCE 1. Uskutočniť merania rýchlosti enzýmovej reakcie metódou začiatočných rýchlostí v systéme invertáza-sacharóza. 2. Z experimentálnych údajov metódou lineárnej regresie vypočítať približné hodnoty parametrov V Max a K M 3. Presnosť parametrov vypočítaných lineárnou regresiou (VMax a K M ) overiť ich výpočtom metódou nelineárnej regresie ( Matlab). 4. Hodnovernosť výpočtu kinetických parametrov overiť porovnaním vypočítaných a fitovaných závislostí v = f ( c ) pričom rozhodujúcim testom vhodnosti bude S priliehavosť nameraných a vypočítaných rýchlostí reakcie. 5. Pomocou vypočítaných kinetických parametrov nasimulovať časové priebehy produktu pre rôzne začiatočné koncentrácie substrátu Pre jednotlivé vstupné koncentrácie substrátu zistiť maximálne produktivity. 6. Určiť koncentráciu substrátu pri ktorej sa dosahuje maximálna produktivita vztiahnutá na celkové množstvo energie dodané na miešadlo. 6
3. EXPERIMENTÁLNA ČASŤ 3.1 Materiály 3.1.1 Použitý enzým Ako experimentálny systém používame enzým kvasničnú invertázu (E.C 3.2.1.26) ktorá katalyzuje hydrolýzu sacharózy za vzniku glukózy a fruktózy podľa nasledujúcej reakcie: C 12 Η 22 Ο 11 + Η 2 Ο C 6 Η 12 Ο 6 + C 6 Η 12 Ο 6 (19) 3.1.2 Použité roztoky 1. acetátový pufor ph = 4.8 s koncentráciou 0,1 mol/l 2. zásobný roztok enzýmu 4 mg/ml vo vode (kvasničná invertáza, Frakcia V, aktivita 44 U/mg, Sigma) 3. 50 ml zásobný roztok sacharózy s koncentráciou 0,2 mol/l v 0,1 mol/l acetátovom pufri ph = 4.8 4. 2 ml z roztokov sacharózy s rôznou koncentráciou (zásobný roztok sacharózy riediť vážkovo veľmi presne!!! s acetátovým pufrom podľa rozpisu uvedenom v Tabuľke č.2) 3.2 Enzýmová reakcia 1. Enzýmová reakcia prebieha v uzavretých 1,5 ml Ependorfových skúmavkách. 750µl sacharózového roztoku s presnou koncentráciou (Tabuľka 2, vzorky č. 1-13 ) sa v termostate temperujú 15 minút na teplotu reakcie 30 C. 2. Po vytemperovaní naštartujeme enzýmovú reakciu tak, že pridáme do každej vzorky po 50 µl zásobného roztoku enzýmu podľa časového rozpisu uvedeného v Tabuľke 3, skúmavku tesne uzavrieme, zmes ihneď premiešame na vortexe a vrátime do termostatu. 7
(časový rozpis v Tabuľke č. 3, presný štart reakcie pre každú reakčnú zmes aktivujeme stopkami-funkcia split). 3. Približne po 30 minútach reakciu v Ependorfových skúmavkách zastavíme prídavkom 100µl roztoku NaOH s koncentráciou 2 mol/l a zmes zhomogenizujeme na vortexe (časový rozpis v Tabuľke č. 2, presný koniec reakcie pre každú reakčnú zmes aktivujeme stopkami - funkcia split). 4. Množstvo uvoľneného produktu enzýmovej reakcie (glukózy) stanovíme glukózovým testom spektrofotometricky. 3.3 Stanovenie glukózy glukózovým testom 3.3.1 Princíp Na stanovenie produktu enzýmovej reakcie glukózy sa používa glukózový test GLU GOD 6 x 250. Základom stanovenia glukózy je vytvorenie farebného komplexu ktorého absorbancia sa meria spektrofotometricky. Tento komplex vzniká pri selektívnej oxidácii glukózy na peroxid vodíka a glukonát pomocou glukózooxidázy. Vzniknutý peroxid vodíka sa stanovuje oxidačnou reakciou so substituovaným fenolom a 4-aminoantipyrínom katalyzovanom peroxidázou, pričom vzniká červeno sfarbený produkt. Princíp stanovenia uvoľnenej glukózy: β D glukóza + H + + (20) glukóza oxidáza 2O2 O2 D glukonát H 2O2 peroxidáza H 2 O2 + farbivoredukované farbivooxidáza + H 2O (21) 3.3.2 Postup 1. Roztok glukózového testu predhrejeme na 30 C. Do ependorfiek pipetujeme po 1 ml tohto roztoku. Počet ependorfiek je rovný počtu štandardov glukózy + 3 x počet vzoriek. 2. Do glukózového testu pridáme kvantitatívne po10 µl dobre zhomogenizovaných vzoriek alebo štandardov glukózy. Ependorfove skúmavky tesne uzavrieme, zmes dôkladne premiešame na vortexe. 3. Stojan s ependorfkami odložíme na tmavé miesto a necháme 30 min inkubovať. 8
4. Po ukončení inkubácie vzorky premiešame na vortexe a v každej zmeriame absorbanciu pri absorpčnom maxime produktu stanovenia (500 nm) oproti vode. Vzorka č.1 je slepým pokusom. 5. Na zostrojenie kalibračnej čiary použijeme už vopred pripravené štandardné roztoky glukózy s koncentráciou: 0-0.02 mol/l. 4. VYHODNOTENIE NAMERANÝCH ÚDAJOV 1. Z meraní absorbancie štandardných roztokov glukózy zhotovíme kalibračnú závislosť Abs = f ( ) c GL, vypočítame parametre kalibračnej rovnice a regresný koeficient. 2. Vypočítame koncentráciu uvoľnenej glukózy vo vzorkách pomocou kalibračnej čiary. 3. Rýchlosť vzniku produktu pre jednotlivé začiatočné koncentrácie sacharózy vypočítame podľa vzťahu: c V GL Celk r p = (22) t VRZ kde r p je rýchlosť enzýmovej reakcie (rýchlosť vzniku produktu), produktu-glukózy (mmol/l), t reakčný čas, V RZ je objem reakčnej zmesi (Vsach+Venzýmu). c GL koncentrácia V Celk je celkový objem po zastavení reakcie, 4. Metódou lineárnej regresie vypočítame parametre K M a V MAX a ich hodnoty použijeme ako začiatotočné hodnoty parametrov do nelineárnej regresie (Matlab). 5. Správnosť vypočítaných parametrov overíme graficky porovnaním experimentálnych a vypočítaných hodnôt závislostí r p = f cs ). ( 0 6. Pre rôzne začiatočné koncentrácie substrátu nasimulujeme časové priebehy koncentrácií produktu pomocou vypočítaných kinetických parametrov ( simulácia cca pre 8 hodnôt cs0 v rozsahu 0-200 mmol/l). 7. Vypočítame priebehy produktivity v čase (pre rôzne cs0) pre reaktor s parametrami: V L = 0.1 m 3, V R = 0.17 m 3, t oper =60 min. 9
Pr 8. Z grafickej závislosti = f ( cs0 ) určíme koncentráciu substrátu kde sa P* t MAX dosahuje maximálna produktivita vztiahnutá na celkové množstvo energie dodané na miešadlo (t MAX je reakčný čas kedy sa dosiahne maximálna produktivita). Pre výpočet príkonu uvažujte: Rushtonovu turbína 2 ks miešadiel, počet otáčok miešadla 180 RPM (rotation per minute), priemer miešadla 0.4m. Zanedbajte zmenu hustoty reakčnej zmesi pre rôzne vstupné koncentrácie substrátu. 9. Ako ovplyvní priebeh reakcie a produktivitu zvýšená koncentrácia katalyzátora -vysvetli na simulácii. 10. Ak by ste ako technológ mali k dispozícii 2 katalyzátory katalyzujúce rovnakú reakciu ktoré sa líšia iba v hodnote K M, ktorý katalyzátor by ste si ste si vybrali a prečo? Vysvetli na simulácii. 5. ZOZNAM POUŽITÝCH SYMBOLOV Symbol Abs Názov veličiny absorbancia pri 500 nm c koncentrácia produktu - glukózy GL cs 0 dc s dcp K M r p t začiatočná koncentrácia substrátu zmena koncentrácie substrátu zmena koncentrácie produktu konštanta Michealis-Mentenovej rýchlosť enzýmovej reakcie reakčný čas V celkový objem po zastavení reakcie Celk V MAX maximálna rýchlosť enzýmovej reakcie V objem reakčnej zmesi RZ V L V R Np objem kvapalnej fázy v reaktore objem reaktora príkonové číslo 10
Pr P RPM n dm t oper produktivita príkon na miešadlo rotation pre minute, otáčky za minútu počet miešadiel priemer miešadla operačný čas 11
6. PRÍLOHY TABUĽKA 2 Príprava roztokov substrátu vzorka č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 zás. roztok sacharózy (ml) 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 0.9 1 1.2 1.6 1.8 2 pufor (ml) 2 1.95 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.1 1 0.8 0.4 0.2 0 zás. roztok sacharózy presná hmotnosť (g) pufor, presná hmotnosť (g) riedenie výsledná koncentrácia substrátu (mmol/l) 12
TABUĽKA 3 Časový rozpis merania priebehu enzýmovej reakcie vzorka č. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 štart reakcie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 čas/min presný štart stop reakcie čas/min 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 presný stop presný čas reakcie /min 13