Microsoft Word - D_5.doc

Prepis

1 Výskumný ústav potravinársky v Bratislave Analýza a výskyt mykotoxínov v potravinách (Dizertaná práca) Vypracoval : Ing. ubomír Daško Školite : Ing. Milan Ková, CSc. Bratislava 2010

2 estne prehlasujem, že som predloženú prácu vykonal samostatne a všetky použité údaje z externých zdrojov sú v zozname odkazov použitej literatúry. Bratislava 02/03/2010 ubomír Daško

3 Chcel by som poakova môjmu odbornému školiteovi Ing. Milanovi Kováovi, CSc. za odborné vedenie, cenné rady a pomoc poas riešenia ako aj písania dizertanej práce. Súasne akujem vedeniu Výskumného ústavu potravinárskeho v Bratislave a mojim spolupracovníkom za ich podporu, pomoc a vytvorenie vynikajúcich podmienok pre realizáciu cieov mojej dizertanej práce. Moja vaka patrí aj Prof. E..Anklam z EC JRC, IHCP za to že mi umožnila v jej laboratóriách vypracova postup na stanovenie sterigmatocystínu.

4 Niektoré mykotoxíny patria k dokázaným karcinogénom alebo k podozrivým karcinogénom. Pre mnohé z nich je ich obsah regulovaný potravinárskou legislatívou. Vzhadom na negatívne úinky mykotoxínov na udský organizmus je cieom znižova ich obsah v potravinách na o najnižšiu hodnotu. Analytické metódy sú preto vemi významným nástrojom na sledovanie ich obsahu v rámci kontroly potravín. Predmetom predloženej práce je štúdium možností efektívneho zníženia ochratoxínu A a fumonizínov B 1 a B 2 v pive ako aj navrhnutie ekonomicky nenáronej skríningovej analytickej metódy pre sterigmatocystín, ktorý je prekurzorom aflatoxínu B 1. Fumonizíny a ochratoxín A prechádzajú do piva z jamea, ktorý sa používa na ich výrobu. Ochratoxín A je typický mykotoxín, ktorý je produkovaný rôznymi hubami poas skladovania cereálií. Na druhej strane fumonizíny sú typickými pre kontamináciu jamea fuzáriami už poas vegetaného obdobia na poli. Je preto pravdepodobné, že ich môžeme detegova aj v pive. Sterigmatocystín je predmetom potravinárskej legislatívy len v eskej republike a na Slovensku. Preto je potrebné navrhnú analytickú metódu, ktorá umožní organizáciám zodpovedným za uplatovanie potravinárskej legislatívy, aby tento mykotoxín zaviedla do pravidelných plánov potravinového dozoru. Práca je rozdelená do dvoch základných skupín. Prvá as je venovaná problematike prípravy a vnútrolaboratórnej validácie analytických metód na stanovenie ochratoxínu A, fumonizínov a sterigmatocystínu. Cieom tejto asti bolo, aby navrhnuté metódy mali limit detekcie minimálne na hladine µg/kg. Zámer je možné dosiahnu použitím fluorescennej detekcie. Pre ochratoxín A tento fakt nie je problém, lebo za vhodných podmienok separácie je možné v jeho molekulách generova fluorescenciu. Fumonizíny nefluoreskujú a sterigmatocystín vemi slabo za špecifických podmienok. Preverili sme potenciálne derivatizané reagenty pre fumonizíny a navrhli optimálny postup automatickej derivatizácie s využitím autosamplera. Automatizácia garantuje vysokú reprodukovatenos derivatizácie. Pre sterigmatocystín sme navrhli derivatizaný postup bez použitia reagentov. Na separáciu sterigmatocystínu sme použili HPTLC s NH 2 chemicky viazanou fázou a po termickej úprave dosiahneme požadovanú fluorescenciu molekúl sterigmatocystínu. V procese extrakcie sterigmatocystínu sme použili extrakciu na pevnej fáze s fenyl chemicky viazanou fázou a tým eliminovali nutnos aplikácie chloroformu. V druhej asti sme sa venovali problematike minimalizácie ochratoxínu A a fumonizínov v pive. Najskôr sme pomocou modelových systémov preverili sorpné vlastnosti rôznych sorbentov. Testovali sme aj efekt externého asovo stabilného a asovo premenlivého homogénneho magnetického poa na sorpciu. Po vyhodnotení výsledkov s použitím modelovej zmesi sme aplikovali vzorky piva s prídavkom vybraných mykotoxínov. V modelových systémoch efektívne nešpecifické sorbenty (Al 2 O 3 - alumina, uhlík) sa ukázali ako nevhodné pre vzorky piva. V prípade piva sme dosiahli efektívnu minimalizáciu mykotoxínov s použitím 3-chloropropyl a kyanidových ligandov naviazaných na pevnom povrchu. Najlepšie výsledky boli získané s použitím externého asovo premenlivého homogénneho magnetického poa, ktorého použitie sa javí ako technolôogicky zvládnutené.

5 I Obsah a použité skratky Súhrn... 4 I Obsah... 5 I 1 Použité skratky... 9 II Úvod III Súasný stav problematiky III 1 Ochratoxín A III 1 1 Mikrobiálny pôvod ochratoxínu A III 1 2 Molekulová štruktúra ochratoxínov III 1 3 Toxické vlastnosti ochratoxínu A III Akútna toxicita III Štúdium karcinogenity dlhotrvajúce pôsobenie ochratoxínu A III Pôsobenie na udí III 1 4 Výskyt ochratoxínu A III 1 5 Možnosti minimalizácie ochratoxínu A III 1 6 Analýza ochratoxínu A III 2 Fumonizíny III 2 1 Mikrobiálny pôvod fumonizínov III 2 2 Molekulová štruktúra fumonizínov III 2 3 Toxické vlastnosti fumonizínov III Akútna toxicita a dlhotrvajúce pôsobenie na organizmus III Pôsobenie na udí III 2 4 Výskyt fumonizínov III 2 5 Minimalizácia fumonizínov III 2 6 Analýza fumonizínov III 3 3 Sterigmatocystín

6 I Obsah a použité skratky III 3 1 Mikrobiálny pôvod sterigmatocystínu III 3 2 Molekulová štruktúra sterigmatocystínu III 3 3 Toxické vlastnosti sterigmatocystínu III Karcinogénne úinky III 3 4 Výskyt sterigmatocystínu III 3 5 Analýza sterigmatocystínu IV Cie práce V Materiál a metódy V 1 Chemikálie a štatistické spracovanie V 2 Stanovenie ochratoxínu A V 3 Stanovenie fumonizínov V 3 1 Derivatizácia fumonizínov V 3 2 Chromatografické stanovenie fumonizínov V 4 Vzorky piva V 5 Sorbenty na záchyt mykotoxínov V 6 Zariadenie na generovanie magnetického poa V 7 Sterigmatocystín derivatizácia a stanovenie VI Výsledky a diskusie VI 1 Vývoj metódy na stanovenie ochratoxínu A VI 1 1 Všeobecné požiadavky pre metóda na stanovenie ochratoxínu A VI 1 2 Spracovanie matrice VI 1 3 Kvantifikácia ochratoxínu A VI 2 Vývoj metódy na stanovenie fumonizínov VI 2 1 Derivatizácia fumonizínov VI Derivatizaná zmes o-ftaldialdehyd a merkaptoetanol VI Derivatizaná zmes o-ftaldyaldehyd a N-acetylcisteín

7 I Obsah a použité skratky VI Derivatizané inidlo dansylchlorid VI Derivatizané inidlo 4-chloro-7-nitrobenzofurazán VI 2 2 Porovnanie derivatizaných postupov modelový systém VI 2 3 Optimalizácia derivatizácie a separácie fumonizínov VI 2 4 Optimalizácia extrakcie fumonizínov zo vzoriek piva VI 3 Vývoj metódy na stanovenie sterigmatocystínu VI 3 1 Výber derivatizaných inidiel na stanovenie sterigmatocystínu VI Anorganické soli VI Organické derivatizané inidlá VI Derivatizácia bez derivatizaného inidla VI 3 2 Extrakcia sterigmatocystínu z cereálnych produktov VI 3 3 Separácia sterigmatocystínu VI 3 4 Kvantifikácia sterigmatocystínu VI 4 Interakcie fumonizínov a ochratoxínu A s pevnými materiálmi VI 4 1 Adsorpcia z modelových zmesí VI Štúdium adsorpnej kapacity sorbentov na báze minerálnych látok a minerálnych polymérov pre ochratoxín A a fumonizíny B 1 a B 2 z modelových zmesí VI Štúdium adsorpnej kapacity sorbentov na báze organických polymérov pre ochratoxín A a fumonizíny B 1 a B 2 z modelových zmesí VI Štúdium adsorpnej kapacity špecifických povrchových aktívnych centier naviazaných na pevnú matricu pre ochratoxín A a fumonizíny B 1 a B 2 z modelových zmesí VI Štúdium kapacity pivovarníckych sorbentov VI 4 2 Extrakcia fumonizínov a ochratoxínu A zo vzoriek piva VII Záver VIII Závery pre prax a alšie štúdium IX Summary

8 I Obsah a použité skratky X Literatúra XI Prílohy XI 1 Príloha XI 2 Príloha XI 3 Príloha XI 4 Príloha XII Zoznam publikovanej literatúry XII 1 Publikácie v peer-review asopisoch XII 2 Patentová ochrana XII 3 Prezentácia na konferenciách

9 I Obsah a použité skratky AOAC Association of Official Analytical Chemsits HPLC Vysokoúinná kvapalinová chromatografia TLC Tenkovrstvová kvapalinová chromatografia HPTLC Vysokoúinná tenkovrstvová kvapalinová chromatografia FB 1 Fumonizín B 1 FB 2 Fumonizín B 2 OTA Ochratoxín A STE Sterigmatocystín EU Európska únia LC MS Kvapalinová chromatografia s hmotnostne spektroskopickou detekciou OPA o- ftaldialdehyd DC dansyl chlorid APCI Chemická ionizácia pri atmosferickom tlaku (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) SIM Monitoring jedného iónu (Single Ion Monitoring) NBD-Cl 4-chloro-7-nitrobenzofurazán MET Merkaptoetanol SPPI Slovenská ponohospodárska a potravinárska inšpekcia PBS fosfátový tlmivý roztok MP jp asovo stabilné homogénne magnetické pole MP sp asovo oscilujúce homogénne magnetiské pole A. Aspergillus P. Penicillium IARC Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny (International Agency for Research of Cancer) SAX Silný meni aniónov N Ac N-acetoxycisteín IUPAC Medzinárodná únia pre istú a aplikovanú chémiu (International Union for Pure and Applied Chemistry) ŠVPS Štátna veterinárna a potravinárska správa CEN DNA Centrum európskej normalizácie Deoxy ribonukleová kyselina UV/VIS Ultrafialová/viditená spektroskopia 9

10 II. Úvod Bezpenosti a kvalite potravín sa venuje stále väšia pozornos. V pozadí týchto aktivít sú neustále sa prehlbujúce vedomosti v oblasti potravinárskych vied ako aj analytickej chémie, ktorá tu má výrazný akceleraný efekt. Stáva sa bežným štandardom stanovi obsah toxických látok v potravinách na úrovni µg/kg a nižšie. Práve analytická chémia dáva základ na neustále sa znižujúce legislatívne limity pre mnohé kontaminanty nielen pre požiadavky úradnej kontroly ale aj distribútorov potravín. K jedným z najnebezpenejších kontaminantov v potravinách môžeme priradi aj mykotoxíny produkty toxinogénnych húb. História poznania týchto látok siaha do šesdesiatych rokov minulého storoia. V Británii úspešne odhalili príinu hromadného úhynu moriakov, ktorá bola spôsobená aflatoxínmi prítomnými v krmive dovezenom do Británie z Afriky. Huby Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus, ktoré produkujú aflatoxíny sa vyskytujú hlavne v oblastiach s vysokou teplotou a vlhkosou (priestor medzi obratníkmi Raka a Kozorožca). Výskyt toxinogénnych húb nie je viazaný len na vysokú teplotu a vlhkos. Sú problémom aj v našich zemepisných šírkach a klimatických podmienkach. Mykotoxíny radíme k endogénnym cudzorodým látkam. Pojmom endogénne cudzorodé látky oznaujeme zlúeniny, ktoré sú pre daný druh potraviny cudzorodé. Vznikajú ako produkty kontaminujúcich mikroorganizmov alebo ako dôsledok nežiadúcich chemických reakcií rôznych zlúenín, ktoré sú prítomné v potravine [1]. Mykotoxíny sú typickí predstavitelia innosti nežiadúcich mikroorganizmov, v tomto prípade toxinogénnych húb [2]. V literatúre sa asto oznaujú ako sekundárne metabolity [3]. Pojem sekundárny metabolit bol používaný v oblasti biochémie rastlín, kde sa týmto pojmom oznaovali látky, ktoré neboli nevyhnutné pre ich život (flavonoidy, terpény,...) [3]. Na druhej strane pojmom primárne metabolity sa oznaovali látky nevyhnutné pre život organizmov (sacharidy, lipidy, amíno kyseliny, bielkoviny,...). Transfer termínu sekundárne metabolity do oblasti biochémie mikroorganizmov je spojený práve s mykotoxínmi [4]. Sekundárne metabolity, ako produkty sekundárneho metabolizmu, nemajú osobitný význam (zatia nie je známy) pre život organizmu. Mykotoxíny sa definujú ako typické sekundárne metabolity húb, produkované po sebe idúcimi sériami enzýmových reakcií z niekokých typov medziproduktov sekundárneho metabolizmu [3]. Zo skupiny sekundárnych metabolitov sa v súasnosti zaína vyleova skupina látok (polyfenoly ochrana organizmu, alelopatia, reprodukcia) a pre ne sa aplikuje pojem biologicky aktívne látky [5]. Predpokladá sa, že mykotoxíny hrajú dôležitú úlohu v alelopatii mikroorganizmov. Primárny metabolizmus je v podstate rovnaký pre všetky živé systémy, kým sekundárny metabolizmus je známy predovšetkým u nižších formách života. 10

11 II. Úvod Úinky mykotoxínov na biologické organizmy sú rôzne [6-8]. Vo všeobecnosti boli u nich pozorované negatívne úinky ako akútna toxicita, cytotoxicita, neurotoxicita, teratogenita, mutagenita, karcinogenita, imunosupresia, insekticídne úinky, fytotoxicita. Treba poveda, že všetky spomenuté negatívne úinky sa samozrejme nekumulujú u každého mykotoxínu. Napríklad aflatoxín B 1 je preukázaný chemický karcinogén a sú známe aj hodnoty jeho akútnej toxicity [3], ale v prípade fumonizínov nie je známa žiadna akútna toxicita, ale je tu predpoklad na ich karcinogénne úinky [9]. Na druhej strane zearalenón radíme k estrogénon a tiež rozširuje paletu známych endokrinných disruptorov [10]. Tiež sa predpokladá, že akútna toxicita tohto mykotoxínu je zanedbatená. Mykotoxíny sú zlúeniny s rozdielnou molekulovou štruktúrou. Uritú podobnos v molekulovej štruktúre môžeme nájs len u mykotoxínov tej istej skupiny. Napríklad fumonizíny známe sú štyri rôzne chemické zlúeniny s podobnou molekulovou štruktúrou [3]. Obdobné závery platia pre aflatoxíny alebo pre mykotoxíny odvodené od sterigmatocystínu (celkove sedem chemických jedincov). Veká variácia v štruktúre týchto molekúl mala za následok, že až s uritým asovým odstupom boli identifikované alšie mykotoxíny po aflatoxínoch. Po identifikácii aflatoxínov sa výskum orientoval v prvých krokoch na hadanie zlúenín s podobnou molekulovou štruktúrou, ako je u aflatoxínov. Z dôvodu rôznosti štruktúry sú aj podmienky analytického stanovenia jednotlivých mykotoxínov rôzne. Najastejšie používaná technika je kvapalinová chromatografia. Na jej základe sú vytvorené a v mnohých prípadoch už aj medzilaboratórne validované metódy [11]. Uvedené metódy sú urené v prvom rade pre laboratória zamerané na výkon úradného dozoru na trhu s potravinami. V mnohých prípadoch sa jedná o ekonomicky nároné postupy, pred samotným stanovením pomocou kvapalinovej chromatografie sa využíva imunoafinitné preistenie a zakoncentrovanie sledovaného mykotoxínu. Samotné imunoafinitné postupy (ELISA) sa využívajú predovšetkým vo firmách, ktoré sa zaoberajú so spracovaním potravinárskych surovín rizikových z pohadu výskytu mykotoxínov. Prvým cieom tejto práce je navrhnú analytické postupy na stanovenie fumonizínov a ochratoxínu A v pive ako aj sterigmatocystínu v cereáliách. Následným druhým cieom je navrhnú možnos minimalizácie obsahu ochratoxínu A a fumonizínov v pive. 11

12 III. Súasný stav problematiky!"#$%&'()*+ Ochratoxín A je produkovaný v kontaminovaných potravinách mnohými toxinogénnymi hubami kmea Aspergillus, predovšetkým sa jedná o druh Aspergillus ochraceus, A. carbonarius, A. niger. Tiež sa udáva, že jediným druhom z kmea Penicillium, ktorý produkuje OTA je Penicillium verrucosum [9, 12]. V rozpore s týmto tvrdením sú iné literárne zdroje [3], ktoré k producentom ochratoxínu A (OTA) radia aj mnohé iné druhy kmea Penicillium P. palitans, P. viridicatum, P. commune, P. purpurescencens, P. cyclopium, P. chrysogenum a P. variabile. Jednotlivé mikroorganizmy sa výrazne líšia aj v prostredí, v ktorom sa nachádzajú, rastlinnými komoditami, na ktorých rastú a v množstve výskytu v závislosti od geografickej polohy a klimatických podmienok. Penicillium verrucosum rastie len pri teplotách pod 30 o C a hodnota vodnej aktivity musí by menej ako 0,8. Z týchto dôvodov sa nachádza len v chladných oblastiach našej planéty. Je to zdroj OTA na cereáliách a cereálnych výrobkoch napríklad v Kanade a v Európe. Vzhadom na to, že cereálie sú astou zložkou aj krmív pre hospodárske zvieratá a OTA je pomerne stabilný v zažívacom trakte zvierat, môžeme ho nájs aj v produktoch zvieracieho pôvodu predovšetkým v bravových oblikách a peeni [13]. Z dôvodu, že Penicillium verrucosum sa nevyskytuje v tropických a subtropických klimatických pásmach, cereálne produkty z tejto oblasti budú kontaminované OTA z iného zdroja, predovšetkým z húb kmea Aspergillus. Aspergillus ochraceus rastie v miernom teplotnom pásme pri vodnej aktivite viac ako 0,8. Tento mikroorganizmus bol sporadicky detegovaný v pomerne širokej palete uskladovaných potravinárskych komodít vrátane cereálií, ale je len zriedkavo zdrojom výraznej kontaminácie ponohospodárskych produktov s OTA [14]. A. ochraceus môže kontaminova kávové zrná poas ich sušenia na slnku a preto sa pokladá za zdroj kontaminácie zelenej kávy s OTA. A. carbonarius rastie pri vyšších teplotách a je vysoko odolný voi slnenému žiareniu a sušeniu na slnku. Spája sa s ovocím, predovšetkým s hroznom. Je zdrojom kontaminácie erstvého hrozna, sušených hrozienok a tiež aj vína a kávy s OTA., -+#.(+(/'%&'()*# Analýzou produktov toxinogénnych húb kmea Aspergillus bolo identifikovaných pä chemických jedincov s vemi podobnou molekulovou štruktúrou [3]. Z týchto piatich podobných chemických jedincov sa najastejšie v prírode vyskytuje práve OTA. Ostatné jemu podobné zlúeniny 12

13 III. Súasný stav problematiky ochratoxín B, ochratoxín C, 4-hydroxyochratoxín A, ochratoxín a sa vyskytujú len vemi zriedkavo [15-21]. COOH NH O OH O O COOH OH O O CH 3 NH O Cl CH 3 Ochratoxín A Ochratoxín B COOEt O OH O COOH O OH O NH O NH O CH 3 CH 3 Cl Cl OH Ochratoxín C 4-hydroxyochratoxín A OH O HOOC O CH 3 Cl Ochratoxín a Obrázok 1. Molekulová štruktúra mykotoxínov skupiny ochratoxín. Vzhadom na to, že dominantným predstaviteom skupiny ochratoxínov je OTA budeme sa venova práve jemu. Ostatné modifikácie nie sú ani dostatone podrobne opísané v literatúre. Prakticky všetky štúdie toxicita, mutagénne vlastnosti, analytika a pod. sa robili a sú publikované práve pre OTA. 13

14 III. Súasný stav problematiky 0 )%1#'2(2(%&'()*+ Hodnoty LD 50 pre rôzne druhy testovaných zvierat boli publikované od viacerých autorov [22-26]. Najcitlivejšie boli psy a ošípané, najmenej citlivé zase laboratórne myši a potkany. Taktiež vyššia je citlivos v prípade mladých experimentálnych potkanov v porovnaní s dospelými jedincami. Niektoré výsledky testov sú v nasledujúcej Tabuke 1.: Tabuka 1. OTA hodnoty LD 50 pre vybrané experimentálne živoíchy. Druh živoícha LD 50 (mg/kg telesnej hmotnosti) Orálne intraperitonálne Intravenózne Myš Potkan Mláa potkana 3,9 Pes 0,2 Ošípaná 1 Kura 3,3 Pokusným potkanom bolo podávané kontaminované krmivo na úrovni 2,4; 4,8; 9,6; alebo 24 mg/kg poas 14 dní. V prípade dvoch najvyšších koncentrácií sa u týchto zvierat pozorovala retardácia rastu, znížená spotreba stravy a tiež bol pozorovaný zvýšený obsah dusíka v moi zvierat [26]. V prípade ošípaných boli pokusné zvieratá kmené kontaminovaným krmivom na úrovni 0,2; 1 a 5 mg/kg poas piatich, ôsmych, dvanástich týždov a v niektorých prípadoch až dva roky. U zvierat boli pozorované poruchy moového ústrojenstva, redukovaná bola aktivita moových enzýmov. U samíc bola pozorovaná porucha moového ústrojenstva [27, 28]. V prípade hydiny, ktorá bola kmená kontaminovanou potravinou s obsahom OTA 4 mg/kg poas 2 mesiacov úmrtnos dosahovala 42 %. Po znížení obsahu OTA na hladinu 0,8 mg/kg úmrtnos klesla na úrove 12 až 15 % [29].! " Krmivo s obsahom OTA až do 40 mg/kg bolo podávané experimentálnym myšiam 44 týždov. Následne myši boli kmené stravou bez OTA 5 týždov. Z deviatich myší, ktoré prežili u piatich 14

15 III. Súasný stav problematiky bol pozorovaný nádor na peeni. U kontrolných zvierat, ktoré boli kmené stravou bez OTA neboli pozorované žiadne tumory na peeni alebo na iných orgánoch [30]. V prípade experimentálnych potkanov, ktoré boli kmené kontaminovanou potravou tak, že zvieratá dostávali denné dávky 210 µg/kg telesnej hmotnosti OTA sa pozoroval karcinóm na moovom ústrojenstve u 30 zvierat z celkového potu 50 kusov [9]. V prípade ke zvieratá boli kmené nižšími dávkami OTA 70 µg/kg telesnej hmotnosti, výskyt nádoru na moovom ústrojenstve bol nižší. V tomto prípade 16 z 51 experimentálnych potkanov malo nádor. V prípade genotoxických štúdii sa dosiahli dos protichodné výsledky. Boli publikované pozitívne výsledky s evidentnými následkami [31-34] v tejto oblasti, ako aj negatívne [35, 36]. Väšina štúdií zameraných na pozorovanie génových mutácii pôsobením OTA na baktérie bolo negatívnych [9]. #!$" Predpokladá sa, že polas odbúrania OTA z udského organizmu je približne 35 dní [37-39]. Krv sa pokladá za najvhodnejší marker pre posúdenie expozície jedinca OTA poas posledných týždov. Krv bola používaná ako biomarker pre odhad kontaminácie potravín OTA. Diagnostikova onemocnenia spôsobené práve OTA nie je jednoduché. Poruchy moového systému sa prejavujú až po dlhšom ase po expozícii organizmu OTA. Chudokrvnos je sprievodným javom vyvolaným konzumáciou kontaminovanej potravy. Jej vekou nevýhodou je, že sa nejedná o dostatone špecifický marker. Z toho dôvodu odhali OTA, ako príinu zdravotných porúch, nie je jednoduché. OTA je úzko zviazaný s endemickou nefropatiou. Veké úsilie bolo venované pre potvrdenie tohto predpokladu. Endemická nefropatia je vážna choroba postihujúca obliky. Bola identifikovaná pre špecifické oblasti balkánskeho polostrova Bosna a Hercegovina, Bulharsko, Chorvátsko, Rumunsko a Srbsko [9]. Onemocnenie zaína bez akýchkovek akútnych prejavov. Jeho vývoj je vemi pomalý, prejavuje sa poškodením moového traktu a obliiek [40]. Vekos obliiek v prvých štádiách choroby je nezmenená, ale postupne progresom onemocnenia sa obliky zmenšujú [9]. Je vemi ažké túto chorobu odhali v prvých štádiách jej priebehu. Predpokladá sa, že mortalita práve na uvedené onemocnenie je približne 2 3 na 1000 úmrtí [41]. Pozoruhodné zmenšenie obliiek je pozorovatené až po smrti. V extrémnom prípade boli pozorovaní len 20 g obliky [9]. Onemocnenia tohto typu sú ovea väšie v endemických oblastiach ako v iných neendemických oblastiach [41]. Hoci OTA bol detegovaný v potravinách prakticky na celom svete [42], vzorky potravín odobratých v endemických oblastiach vykazovali podstatne vyššie koncentrácie. Obsah OTA v endemických oblastiach bol niekoko krát vyšší, ako v neendemických oblastiach [43]. Rovnako obsah OTA 15

16 III. Súasný stav problematiky v krvi udí z endemických oblastí bol viacnásobne, vyšší ako u udí z iných oblastí [44]. Nízky obsah OTA bol detegovaný v krajinách, v ktorých sa nevyskytujú takéto endemické oblasti [45, 46, 47]. Obsah OTA v krvi udí z neendemických oblastí sa pohybuje v rozmedzí od 0,1 do 10 ng/ml [48-51]. Predpokladá sa aj degradácia DNA [52] OTA bol detegovaný aj v materskom mlieku. 9 z 50 vzoriek materského mlieka z rôznych oblastí Talianska bolo kontaminovaných s OTA pri koncentráciách 1,2 až 6,6 ng/ml materského mlieka [9] (%&'()*+ Medzi primárne komodity, ktoré sú kontaminované OTA patria na prvom mieste cereálie a káva. Tieto rastlinné produkty bývajú najastejšie napadnuté toxinogénnymi hubami. Z uvedeného dôvodu najviac prehadov o kontaminácii potravín je úzko spojený práve s analýzou cereálií a následne aj výrobkov z nich. Jednou z najsledovanejších komodít je káva i už zelená, pražená alebo instantná. Z analyzovaných vzoriek káv bolo zistené pomerne vysoké percento kontaminácie [53-56]. OTA bol stanovený aj v 11 vzorkách jamea z celkového množstva 103 analyzovaných vzoriek v USA [16]. Ryža patrí tiež k potenciálnym donorom OTA v našej výžive. V 8 vzorkách ryže dovážanej do Dánska z celkového množstva 22 kontrolovaných vzoriek bol zistený výskyt OTA [57]. Podobne v 12 zo 41 vzoriek ryže importovanej do Nórska bol detegovaný OTA [9]. alšou komoditou je kukurica. V 14 z 139 vzorkách kukurice dovážanej do Vekej Británie bola potvrdená prítomnos OTA [58]. Nepriamym dôkazom kontaminácie potravín s OTA v Afrike je vysoké percento (35 %) kontaminácie materského mlieka pri strednej koncentrácii 7,9 ng/g [59]. Vysoké percento kontaminácie materského mlieka, ako aj priemerný obsah OTA v materskom mlieku je dôkazom vemi vysokej kontaminácie potravín s OTA v Afrike. Bolo by potrebných viac prehadov o výskyte OTA v krajinách mimo Európy, nakoko k celkovým prehadom o kontaminácii potravín prispievajú výsledky od európskych potravinárskych laboratórií až 85 % [9]. Z výrobkov na báze cereálnych surovín je najviac sledované pivo [60]. Veká pozornos bola venovaná aj vínu [61]. Tabuka 2 dáva prehad o priemerných koncentráciách OTA vo vybraných komoditách [9]. 16

17 III. Súasný stav problematiky Tabuka 2. Vážený priemer koncentrácie OTA vo vybraných komoditách. Komodita Poet vzoriek Vážený priemer koncentrácií (µg/kg) Pivo 660 0,025 Cereálie (všetky) ,94 Jame 350 0,53 Kukurica 95 7,5 Ovos 280 0,44 Ryža 45 0,06 Raž 790 1,2 Pšenica ,38 Cereálne výrobky ,19 Kakao a okoláda 270 0,18 Káva spolu ,86 Z toho zelená 130 1,0 Pražená ,76 Instantná 290 1,4 Sušené hrozienka 860 2,3 Hrozno 68 0,44 Víno všetko ,32 Bravové obliky 380 0,12 Mäsové výrobky 810 0,052 Kontaminácia piva domácej produkcie ochratoxínom A bola overená v roku 1998 na Slovenskej ponohospodárskej a potravinárskej inšpekcii. Výsledky tejto kontroly sú v Tabuke 3. 17

18 III. Súasný stav problematiky Tabuka 3. Ochratoxín A v pivách vyrobených na Slovensku v roku 1998 íslo Vzorka piva Ochratoxín A (µg/kg) 1 Svetlé pivo Corgo 10 % Tmavé pivo Corgo 12 % Menej ako Tmavé pivo Horden 10 % Menej ako Svetlé pivo Barbakan 11,5 % Menej ako Svetlé pivo Steiger 12 % Tmavé pivo Urpín 11 % Svetlé pivo Gemer 12 % Svetlé pivo Perla 12 % Svetlé pivo Amstel Svetlé pivo Zlatý bažant 10 % Svetlé pivo Zlatý bažant 12 % Tmavé pivo Šariš 12 % Svetlé pivo Šariš 12 % Tmavé pivo Tatran 11 % Svetlé pivo Tatran 12 % Tmavé pivo Stein 11 % Svetlé pivo Stein 12 % Tmavé pivo Trnavský palatín 16 % Menej ako Svetlé pivo Popper 11 % 0.15 Zdroj údajov:. Daško, Š. Crkoová: Analýza mykotoxínov na SPPI, K dispozícii je pomerne obmedzené množstvo informácii zameraných na sledovanie zmien úrovne kontaminácie cereálnych produktov a výrobkov z nich v závislosti od asu. Z publikovaných výsledkov pre ilustráciu vyberáme nasledovné porovnania. Vo Vekej Británii analyzovali cereálne produkty v roku 1993 a V roku 1993 len 2 z 611 cereálnych vzoriek 18

19 III. Súasný stav problematiky bolo kontaminovaných s OTA na hladine 15 ng/g, naproti tomu v roku 1994 to bolo 22 vzoriek zo 450, priom obsah OTA bol v rozsahu od 1 do 32 ng/g [9]. Podobné merania sa robili aj v Chorvátsku v rokoch 1997 (35 % vzoriek kontaminovaných, 57 ng/g) a v roku 1996 (10 % vzoriek kontaminovaných, 38 ng/g) [62]. V rokoch 1996 až 1999 v Taliansku sledovali obsah OTA vo víne. Celkove analyzovali 169 vzoriek, priom v tomto prípade rozdiely medzi jednotlivými rokmi neboli významné [9]. V tejto súvislosti treba spomenú aj zásadný problém pri stanovení OTA v cereálnych produktoch. Uvedený problém je spojený s odberom vzorky. OTA nie je homogénne distribuovaný v celej dávke (vrece, plný nasypaný kontajner, niekoko vriec) cereálií. Vyskytuje sa v tzv. ohniskových koncentráciách. To znamená, že v niektorých cereálnych zrnách je koncentrácia vemi vysoká a iné sú bez OTA. Je preto vemi dôležité, ako sa odoberie vzorka. Je možné, že na pomerne znanej variácii kontaminácie cereálnych produktov s OTA v medzironých sledovaniach sa môže podiea aj spôsob odberu reprezentatívnej vzorky z celej dávky. Oproti tomu, v prípade vína sú medzironé variácie zanedbatené. Víno je kvapalné médium, v ktorom dochádza k homogénnej distribúcii OTA. Problém ohniskovej kontaminácie hroznových bobú tu nehrá žiadnu úlohu. Aj tento fakt je vhodné bra do úvahy pri posudzovaní výsledkov medzironých meraní v prípade cereálnych produktov a homogénnych kvapalných produktov rastlinného pôvodu, u ktorých je veký predpoklad prítomnosti OTA. 5 62(77'8%-%&'()*+ Zásadné princípy možnej dekontaminácie boli publikované a možno ich zhrnú do nasledovných bodov [64 67]: - Inaktivácia mykotoxínov transformáciou na netoxické zlúeniny - spóry a mycélia húb by mali by zniené, aby nevznikali nové mykotoxíny - potravina alebo krmivo by si pri tom malo zachova svoju nutrinú hodnotu - fyzikálne vlastnosti surovín by sa nemali podstatne zmeni - proces musí by ekonomicky akceptovatený a technologicky realizovatený V zásade sú tiež tri možnosti na to, aby sme sa mohli vyhnú škodlivým vplyvom mykotoxínmi kontaminovaných potravín [64]: - prevencia kontaminácie - dekontaminácia kontaminovaných potravín alebo krmiva - inhibícia mykotoxínov pomocou adsorpcie Pre možnos redukcie obsahu OTA založenej na prevencii jeho vzniku sú vemi dôležité okrem klimatických podmienok dva faktory. Jedným je geografická lokalizácia a druhým je druh plodiny. 19

20 III. Súasný stav problematiky Tieto dva faktory sú primárne urujúce pre posúdenie, ktoré z troch hlavných toxinogénnych húb (Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius, Penicillium verrucosum) rastú na danej plodine a produkujú OTA. A. ochraceus sa vyskytuje hlavne v uskladnených potravinách. Nezistila sa ich prítomnos na plodinách pred zberom [9]. Optimálne podmienky pre rast týchto húb sú spojené s vysokou hodnotou vodnej aktivity a s vyššou teplotou. Vhodným vetraním skladových priestorov, udržiavaním nízkej teploty môžeme do znanej miery eliminova pôsobenie týchto húb [9]. Najlepšie výsledky sa dosiahli v uvedenom smere v prípade kávových zn [68]. Po zbere dochádza ešte na farmách k dvom zásadne rozdielnym postupom zameraným na istenie zozbieraných plodov. V prípade produkcie kávy Arabica sa zrná zbavia krycej vrstvy mokrou cestou - flotáciou a následne sa dajú suši. V prípade výroby robusty dochádza k hrubému preistenie kávových zn pomocou sít. V oboch prípadoch nasleduje sušenie a ak poas troch dní klesne hodnota vodnej aktivity pod 0,8, tak je len vemi malá pravdepodobnos tvorby OTA. Takýmto spôsobom sa inaktivuje A. ochraceus aj A. carbonarius. Proces sušenia musí by nastavený tak, aby hodnota vodnej aktivity bola v rozmedzí 0,8 až 0,9 maximálne tri dni. Kritickým kontrolným bodom je z uvedeného dôvodu regulácia teploty pri sušení. Po spracovaní kávových zn môže dôjs následne k ich baleniu a transportu na miesto ich alšieho spracovania (praženie). Po opísanom prvotnom spracovaní kávových zn je veká pravdepodobnos, že sa vyhneme kontaminácii s OTA. Podstatne väší problém je v prípade kontaminácie cereálnych produktov s Penicillium verrucosum. Optimálne podmienky rastu týchto húb poskytujú klimatické podmienky typické pre Európu alebo Kanadu. Patria k hlavným zdrojom kontaminácie potravín s OTA u nás. Zvýšenie teploty skladovania o 5 o C a zvýšenie vlhkosti o 2 3 % má za následok zníženie asu skladovania cereálnych produktov bez kontaminácie s OTA na polovicu [9]. Zatia sa nepodarilo nájs optimálne podmienky na dlhodobé skladovanie v našich klimatických podmienkach tak, ako tomu bolo v prípade kávy v Brazílii [9]. K pokusom o dekontamináciu potravín eventuálne krmiva môžeme priradi aj postupy s využitím mikroorganizmov. V tomto smere boli publikované pozitívne výsledky len pre aflatoxíny [69-71] a to pôsobením baktérií Flavobacterium aurantiacum. Totálna premena aflatoxínov na neškodné chemické zlúeniny nie je úplná a súasne je dos pomalá [72-75]. Z chemických možností detoxikácie je najznámejšie pôsobenie amoniaku na aflatoxíny. Najviac sa používa predovšetkým v USA [76]. V prípade OTA nie sú známe žiadne signifikantné pozitívne výsledky ako dôsledok pôsobenia baktérií alebo iných mikroorganizmov. 20

21 III. Súasný stav problematiky V prípade OTA je snaha orientova sa viac na sorbenty, ktoré by mali imobilizova mykotoxín. V tomto smere sa úspešné výsledky dosiahli prídavkom zeolitov do krmiva s cieom eliminova aflatoxíny [77]. Pre OTA sa však zeolity ukázali ako málo efektívne adsorbenty [77]. Prehad používaných adsorbentov s cieom eliminácie mykotoxínov spracovali A. Huwig a kol. [77]. Z dokumentovaných údajov vyplýva, že pre OTA sa efektívne dá využi aktívne uhlie. Ostatné testované sorbenty nevykazovali efektívnu sorpciu zeolity, organické polyméry a ani kvasinky [77]. OTA patrí aj ku kontaminantom vína. Možnosti použitia rôznych adsorbentov s cieom eliminova OTA z vína sa venoval M. Castellari a kol. [61]. Testovali rôzne sorbenty zeolity, uhlík, celit, silikagél, celulózu, želatínu, pektín, vajený albumín, draselný kazeinát. Z použitých sorbentov najefektívnejší bol uhlík, ke dokázal zníži obsah OTA vo víne až o 61 %. Treba však poveda, že súasne s redukciou obsahu OTA došlo aj k redukcii iných látok vo víne, u ktorého sa výsledné senzorické vlastnosti zmenili [61]. 9 '48'%&'()*+ Urenie obsahu mykotoxínov v dávke cereálnych produktov je znane problematické. Je to dôsledok nehomogénnej distribúcie kontaminovaných zložiek dávky v jej objeme. Z toho dôvodu sa problematike odberu vzoriek pre kontrolu obsahu mykotoxínov venuje pozornos oddelene od samotného stanovenia obsahu mykotoxínov v laboratórnej vzorke. Problematika odberu vzoriek je spoloná pre všetky mykotoxíny. Je tu reálna možnos zovšeobecnenia. Vzhadom na veký význam mykotoxínov Codex Alimentárius vydal manuál pre tvorbu plánov na odber vzoriek [78]. Nemalá pozornos oblasti odberu vzoriek pre mykotoxíny sa venuje aj v EU [79-82]. Práve odber vzorky má hlavný vplyv na hodnotu neistoty je to až 76 %. Samotná homogenizácia vzorky sa podiea na neistote stanovenia viac ako 16 % a meranie v laboratóriu sa odhaduje na úrovni 2 % z celkovej neistoty stanovenia mykotoxínov v dávke cereálnych produktov [83]. Odber vzorky má veký dopad na výsledky posúdenia dávky. Je dôležité zabezpei odber reprezentatívnej vzorky [84]. Pokia zväšíme vekos vzorky z 5 kg na 66 kg tak zabezpeíme redukciu varianého koeficienta spojeného s odberom vzorky z 266,5 na 53,3 [83]. Zásadne je potrebné dodržiava požiadavku legislatívnych predpisov EU [79 82] spojenú s vekosou vzorky závislou od vekosti dávky až do 30 kg. Personál zodpovedný za odber vzoriek musí ma k dispozícii aj vhodné nástroje na odber vzoriek [85]. Následne je významný postup spojený s tvorbou odvodených vzoriek zo základnej vzorky. Odvodené vzorky sú dôležité pre majitea dávky pre prípadne sporné situácie (arbitrážne konania), ako aj pre samotné laboratórium, aby sa dali vykona opakované analýzy. Tu je dôležitý krok homogenizácie odobratej základnej vzorky. Ideálna je homogenizácia celého množstva 30 kg vzorky spolu s vodou a následne 21

22 III. Súasný stav problematiky po dôkladnom premiešaní príprava odvodených vzoriek. Takto zabezpeíme o najväšiu homogenitu odvodených vzoriek. Samotná dezintegrácia je vemi dôležitá. V závislosti od vekosti rozdrvených astíc môžeme hovori o znížení hodnoty varianého koeficienta z 56,3 na 5 po nahradení mlyna Romer výkonnejším mlynom Wiley [83]. Uskladovanie vzoriek (urených na iné ciele ako urýchlené stanovenie mykotoxínov) je v pri teplote 20 o C. Vzorky na urýchlené stanovenie sa uskladujú pri teplote 4 o C. Z uvedeného dôvodu pred samotným stanovením obsahu OTA v cereáliách by sme mali postupova nasledovne: 1. odber reprezentatívnej vzorky (30 kg) 2. homogenizácia vzorky (vo vode) 3. rozdelenie celej homogénnej vzorky na tretiny 4. z jednej tretiny vytvori odvodené vzorky (jedna odvodená vzorka by mala obsahova 0,5 kg cereálií vztiahnuté na suchý pôvodný materiál, pred prídavkom vody) 5. odovzda vzorky do laboratória na stanovenie obsahu OTA (2 odvodené vzorky pre paralelné stanovenie) 6. odovzda odvodenú vzorku majiteovi dávky 7. zvyšné vzorky odloži do mraziaceho boxu pre prípadné arbitrážne konanie alebo riešenie sporov Pre samotné kvantitatívne stanovenie OTA sa najastejšie používa tenkovrstvová kvapalinová chromatografia (TLC) alebo vysokoúinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Na vyhodnocovanie sa využíva fluorescencia OTA. V prípade TLC používame densitometer a pri využití HPLC používame fluorescenný detektor. Vysokoúinná tenkovrstvová kvapalinová chromatografia (HPTLC) je vhodná pre stanovenie obsahu OTA na podobnej koncentranej hladine ako je tomu pri HPLC. TLC nedosahuje tak nízky detekný limit, ako je tomu pri HPTLC. V prípade TLC medzilaboratórne bola validovaná metóda vhodná pre hladiny stanovenia 10 ng/g (ppb) [86]. Pred samotným stanovením OTA je dôležitá úprava extraktu. Môžeme použi klasickú extrakciu na pevnej fáze najviac sa aplikuje chemicky viazaná fáza C18 na silikagéli. Za uvedených podmienok môžeme stanovi OTA na hladine 2 ng/g [87, 88]. V súasnej dobe sa do popredia dostávajú metódy s využitím imunoafinitných interakcií na zachytenie (preistenie) OTA. Takéto postupy sú vhodné na stanovenie nižších hladín OTA v cereáliách - 0,1 ng/g [89, 90]. Pre stanovenie OTA sa odporúa používa najmä metódy AOAC a CEN [91-93]. V prípade požiadavky spracova veké množstvo vzoriek za o najkratší as, je možné výhodne použi 22

23 III. Súasný stav problematiky ELISA metódy. Existuje pomerne vea výrobcov a dodávateov materiálov pre úspešné využitie ELISA postupov. Metóda CEN [88] je urená na stanovenie OTA vo víne a pive s obsahom OTA v rozsahu 0,1 3 ng/ml.,!"#$:+78*# Fumonizíny sú mykotoxíny produkované toxinogénnymi hubami rodu Fusarium. Z celého rodu Fusarium len tri druhy jedincov produkujú fumonizíny v zaujímavých množstvách Fusarium verticillioides, Fusarium moniliforme a Fusarium proliferatum [9]. Fusarium verticillioides a Fusarium proliferatum patria k najbežnejším a najastejšie sa vyskytujúcim hubám kontaminujúcim predovšetkým kukuricu. Optimálne podmienky pre rast týchto húb sú spojené s vyššou teplotou a relatívne vysokou hodnotou vodnej aktivity 0,9. Druhým faktorom, ktorý má pravdepodobne pozitívny vplyv na ich rast a produkciu toxínov, je termický stres [9]. Fumonizíny vznikajú v kukurici len poas etapy jej rastu ešte na poli, prípadne v prvých štádiách uskladnenia. Z geografického pohadu sa fumonizíny vyskytujú prakticky vo všetkých klimatických podmienkach, ich prítomnos bola zistená v mnohých oblastiach sveta. Pozoruhodná rôznorodos ich výskytu bola pozorovaná z pohadu opakovaných štúdií po následných rokoch. Okrem kukurice sa vyskytujú aj v iných komoditách, ako sú ryža, slad (pivo) a pšenica.,, -+#.(+(/':+78*# V literatúre boli popísane štyri štruktúrne podobné zlúeniny Fumonizíny B 1, B 2, B 3, a B 4 [94, 95]. Posledný z fumonizínov fumonizín B 4, bol opísaný len v jednom prípade. Identifikovaný bol v ryži v Južnej Kórei v koncentráciách nižších, ako boli koncentrácie fumonizínov B 1, B 2 a B 3 [96]. 23

24 III. Súasný stav problematiky Fumonizín B 1 R 1 = OH; R 2 = OH Fumonizín B 2 R 1 = OH; R 2 = H Fumonizín B 3 R 1 = H; Fumonizín B 4 R 1 = H; R 2 = OH R 2 = H Obrázok 2. Molekulová štruktúra fumonizínov. Podobne, ako v prípade ochratoxínov, aj z fumonizínov dominantným reprezentantom, ktorý sa najastejšie vyskytuje v prírode, v najväších koncentráciách, je fumonizín B 1. V menších koncentráciách je niekedy prítomný aj fumonizín B 2 a výrazne zriedkavo sa vyskytuje fumonizín B 3. Fumonizín B 4 bol zistený len v už spomínanom jednom prípade. Všetky toxikologické štúdie sa robili práve na fumonizíne B 1.,0 )%1#'2(2(:+78*#!% Z pohadu akútnej toxicity fumonizínov nie sú známe žiadne kritické úinky. Predpokladá sa, že akútna toxicita týchto zlúenín je zanedbatená [9]. Pomerne znané množstvo experimentov bolo robených na pokusných zvieratách. Z nich vyplýva, že najviac napadnutým orgánom bola pee a pri dlhodobejšej expozícii pokusných zvierat fumonizínom prejavovali sa patologické zmeny aj na oblikách [97 102]. Zaujímavé je asto rozdielne pôsobenie na pokusné myši v závislosti od pohlavia. Pokusné zvieratá boli kmené rôznymi dávkami fumonizínu B 1 poas 90 dní. Dávky sa pohybovali v rozsahu od 0,3 do 29 mg/kg telesnej hmotnosti. Obsah cholesterolu v krvi samíc bol podstatne vyšší, zatia o u samcov nebol pozorovaný tento efekt [97]. V inom prípade testovali na skupine samcov a samíc myší pomerne veké dávky fumonizínu B 1 od 99 24

25 III. Súasný stav problematiky do 480 mg/de. Týmto dávkam boli pokusné zvieratá vystavené poas 28 dní. Na záver u samcov kmených najvyššími dávkami boli pozorované patologické zmeny na peeni, v prípade samíc to isté zistenie bolo vo všetkých skupinách [98]. To znamená, že samice myší sú podstatne citlivejšie na pôsobenie fumonizínu než samce. Krátkodobé pokusy na experimentálnych zvieratách potvrdili negatívny úinok predovšetkým na pee a vyššiu citlivos u samíc [98]. Pri dlhodobých štúdiách je cieom pozorova predovšetkým karcinogénne úinky, genotoxické efekty a vplyv na reprodukné schopnosti experimentálnych zvierat. Hepatokarcinogénne úinky fumonizínu B 1 boli študované v skupine pokusných potkanov, ktoré dostávali rozdielne dávky mykotoxínu v krmive 1, 10 a 25 mg/kg krmiva poas roka. Urité zmeny boli pozorované na skupine zvierat, ktoré boli kmené dávkami 10 mg/kg. Minimálne zmeny boli zistené u zvierat zo skupiny s najnižšou dávkou fumonizínu. V prípade najvyššej dávky bolo už u 9 zo 17 zvierat pozorované evidentné karcinogénne poškodenie peene a samíc aj obliiek [100]. Skupine experimentálnych potkanov bola poas 610 až 691 dní podávané krmivo, ktoré bolo odobraté z potravín urených pre humánnu výživu. V tomto prípade sa nerobili detailné štúdie z pohadu výskytu fumonizínov v daných dávkovaných krmivách. Potvrdil sa však vemi vysoký výskyt tumorov na peeni pokusných zvierat [103, 104]. Experiment vykonali v oblasti charakteristickej s pomerne vysokým výskytom rakoviny pažeráka u udí. Výsledky naznaujú na možnú príinu zvýšeného výskytu tohto ochorenia v uvedenej oblasti. Z pohadu karcinogenity fumonizínov boli prijaté nasledovné závery expertnou skupinou IARC 8 : 1. Nie sú dostatoné dôkazy pre karcinogenitu toxínov produkovaných Fusarium verticillioides u udí. 2. Sú dostatoné dôkazy na experimentálnych zvieratách o karcinogénnych úinkoch týchto toxínov. 3. Sú len obmedzené dôkazy o karcinogenite fumonizínu B 1 na experimentálnych zvieratách. Závery boli publikované v roku Od tejto doby sa nahromadili alšie výsledky a dnes je už dostatoné množstvo dôkazov o karcinogenite fumonizínu B 1 aj na experimentálnych zvieratách [9]. Z pohadu genotoxických úinkov sú publikované dos rozporuplné výsledky. Na jednej strane je skupina experimentálnych údajov dokazujúcich urité genotoxické zmeny [ ] na druhej strane boli publikované negatívne výsledky žiadne zmeny na genóme [111, 112]. 25

26 III. Súasný stav problematiky Z pohadu reproduknej toxicity sa nepotvrdili úinky na experimentálne myši alebo potkany. V prípade králikov sa však pozorovali toxické efekty na pregnantné samice a to už pri pomerne malých dávkach fumonizínu B 1 0,25 mg/kg telesnej hmotnosti na 3 19 de podávania kontaminovaného krmiva. Abnormality plodu sa neprejavili v jeho deformácii ale vo výrazne zníženej hmotnosti [9]. Chronická toxicita vyvolaná dlhodobým dávkovaním (63 dní) v krmive moriek sa neprejavila negatívne na rastových prírastkoch pokia obsah fumonizínov bol menej ako 20 mg/kg krmiva [113]. #!$" V prípade pôsobenia na udí sa predpokladá negatívny vplyv fumonizínov na ezofágus (pažerák) zvýšený výskyt rakoviny ezofága. Súvislos medzi zvýšeným výskytom rakoviny ezofága a prítomnosou fumonizínov v potravinách je výrazný predovšetkým na miestach, kde kukurica a z nej odvodené potraviny tvoria dominantnú zložku stravy populácie, prípadne oblasti, kde je nedostatok erstvej zeleniny a ovocia, alebo obyvatestvo nemá požadované ekonomické zázemie pre možnos zabezpei dostatone nutrine hodnotnú a pestrú stravu [ ]. Tiež sa potvrdilo, že zvýšený výskyt rakoviny ezofága v oblastiach s pomerne vysokým výskytom kontaminovanej kukurice fumonizínmi je úzko spojený s nedostatkom niektorých minerálov. Nedostatok minerálov v strave obyvatestva bol zistený nie len v dôsledku nevhodných stravovacích praktík, ale aj ich nedostatku v pôde [103]. Predpokladá sa, že nedostatok horíka, molybdénu a iných mikronutrientov zinku a medi spôsobuje tiež vyšší výskyt rakoviny ezofága [119]. V severnom Taliansku bol výskyt rakoviny ezofága detegovaný v množstve 17 prípadov na obyvateov [116], priom namerané hladiny boli od 0,15 do 3,8 mg/kg. V uritých oblastiach íny boli zistené podstatne väšie množstvá udí chorých na rakovinu ezofága 135 až 140 na obyvateov [115]. Okrem rakoviny ezofága bol potvrdený aj zvýšený výskyt rakoviny peene [120, 121]. V teplých klimatických oblastiach sa predpokladá synergický úinok pôsobenia aflatoxínov spolu s fumonizínmi. Z týchto dôvodov je aj výskyt rakoviny peene v týchto oblastiach výrazne vyšší. Predpoklady boli potvrdené na experimentálnych zvieratách [100].,3 42 (:+78*# Hlavným zdrojom fumonizínov sú fuzáriové huby. Tie sa radia medzi známe kontaminanty cereálií, predovšetkým kukurice. Z toho dôvodu najviac publikovaných literárnych údajov sa týka práve kontaminácie kukurice [ ]. Získane výsledky sa pohybujú až do hodnôt presahujúcich koncentranú úrove 1 mg/kg. 26

27 III. Súasný stav problematiky Okrem tradiného zdroja fumonizínov kukurice, ich obsah bol zistený aj v iných produktoch ako napríklad v pive [128, 129]. Z celkového množstva 29 znaiek piva distribuovaných v USA bolo 25 domácej výroby a štyri boli z dovozu [128]. Z analyzovaného množstva vzoriek bolo 86 % pozitívnych na prítomnos fumonizínu B 1 a 41 % vzoriek obsahovalo aj fumonizín B 2. Ani v jednom prípade však nebola pozorovaná prítomnos fumonizínu B 2 bez fumonizínu B 1. Celková suma fumonizínov sa pohybovala v rozsahu medzi 0,3 až 12,7 ng/ml. Podobnými meraniami sa zaoberali aj v Kanade [ ], priom zo 41 vzoriek piva domácej výroby len 4 vzorky obsahovali fumonizín B 1 v koncentrácii presahujúcej 2 ng/ml. Najvyššia zistená hodnota bola 59 ng/ml. Z uvedených štyroch vzoriek dve obsahovali aj fumonizín B 2 v koncentrácii viac ako 2 ng/ml. Maximálny obsah fumonizínu B 2 bol 12 ng/ml. Komplexné prehady výskytu fumonizínov v pivách európskej produkcie nie sú ešte spracované. Medzi alšie sledované komodity môžeme priradi mlieko a hovädzie mäso. Fumonizíny boli detegované v hovädzom mäse len po dlhodobom kmení zvierat vysoko kontaminovaným krmivom [133]. V prehade stanovenia fumonizínov v 165 vzorkách mlieka v USA len v jednej sa zistil obsah fumonizínu B 1 na hladine 1,3 ng/ml [134]. V štúdiách, zameraných na možný transfer fumonizínu B 1 do mlieka sa zvieratám dávalo kontaminované krmivo s obsahom 125 mg/kg fumonizínu B 1 priom nebol zistený žiaden jeho prenos do mlieka [135]. V prípade ošípaných kmených pravidelnými dávkami 2-3 mg/kg fumonizínu B 1 v krmive sa tiež nepozorovala jeho akumulácia v svalovom tkanive, ale bola zistená jeho prítomnos v oblikách a v peeni [136]. V ryži bol tiež zistený detegovatený obsah fumonizínu B 1 na úrovni 10 ng/g [137]. Všeobecný prehad kontaminácie rizikových produktov fumonizínmi sa vykonal za podpory fondov Európskej únie [138]. V Taliansku sledovali kontamináciu pšenice a zo 100 vzoriek bolo 76 kontaminovaných. To len naznauje, že podobnú pozornos je potrebné venova aj trhovo významnej komodite akou je napríklad pivo. Odhadom príjmu fumonizínov sa v znanej miere zoberalo aj FAO v spolupráci s WHO. V rámci projektu GEMS/Food bol potvrdený príjem týchto toxínov do organizmu v rôznych astiach sveta [9]: 27

28 III. Súasný stav problematiky Tabuka 4. Odhad príjmu fumonizínov vo svete. Príjem fumonizínov Príjem fumonizínov v µg/de na osobu Stredný aleký Afrika Latinská Európa východ východ Amerika Minimum 0,2 0,1 0,4 0,2 0,0 Maximum Stred Štandardná odchýlka ,5 7'8%':+78*# V prípade kukurice máanie a drvenie kukurice vo vode umožuje redukciu obsahu fumonizínov až o 50 % [139]. Zahrievanie má pozitívny efekt na zníženie obsahu fumonizínov len, ak sa dosahuje teplota viac ako 150 o C [ ]. Úinnos minimalizácie fumonizínov sa znižuje s asom, priom sa predpokladá, že dochádza k naviazaniu molekúl fumonizínov na matricu [135]. Fermentaný proces redukuje obsah fumonizínov len v obmedzenej miere [144]. Využitie adsorbentov na zachytávanie fumonizínov nebolo ešte testované nie sú dostupné publikácie na túto tému. Aktivity orientované na minimalizáciu fumonizínov sa orientujú na preventívne opatrenia. Jedným z nich je snaha pripravi také hybridy kultúrnych plodín, ktoré by v menšej miere zachytávali fuzáriové huby a tým by sa predišlo tvorbe fumonizínov [145, 146]. Efektívnos týchto postupov je znane obmedzená. Získané kultivary sú odolnejšie voi fuzáriam, ale po ich presadení do iných klimatických lokalít, strácajú schopnos menej zachytáva fuzária. Pozberová možnos znižovania obsahu fumonizínov je do znanej miery limitovaná. Je známe, že kontaminované zrná kukurice majú ervenú farbu, takže separácia zn by mohla iastone rieši problém fumonizínov. V hromadnej výrobe je však prakticky nepredstavitené nieo také realizova. Druhou možnosou je hne po zbere zníži hodnotu vodnej aktivity zn pod hodnotu 0,6. Je známe, že fuzária potrebujú pre svoj rast hodnotu vodnej aktivity nad 0,9. Bezpený obsah vlhkosti v kukurici sa odporúa na úrovni % [147]. Ožarovanie kontaminovaných cereálií s gama žiarením má tiež pozitívny vplyv na znienie fuzárií, ale nemá pozitívny dopad na zníženie obsahu fumonizínov [148]. 28

29 III. Súasný stav problematiky,9 '48':+78*# Pre stanovenie mykotoxínov sa vo všeobecnosti najviac používajú separané metódy s rôznou detekciou, predovšetkým kvapalinová chromatografia. Vzhadom na ich pozorované toxické úinky je obsah fumonizínov v potravinách legislatívne regulovaný [2]. Vo všeobecnosti je snaha ich koncentráciu drža na o najnižšej úrovni. Z toho dôvodu na stanovenie fumonizínov je potrebné použi postup s o najnižším detekným limitom. V kvapalinovej chromatografii týmto požiadavkám vyhovujú detekné systémy založené na hmotnostnej spektroskopii alebo fluorescencii. Hmotnostná spektroskopia je v súasnosti ešte dos ekonomicky nároná, tak sa pozornos orientuje na druhú možnos a to stanovi fumonizíny pomocou fluorescennej detekcie. Základnou požiadavkou pre úspešné použitie je, aby stanovovaná molekula mala dostatonú fluorescenciu. Fluorescencia závisí od prítomnosti chromofórov v molekule a od jej planarity. Vzhadom na molekulovú štruktúru fumonizínov (vi stranu 24) je evidentné, že fumonizíny samotné nebudú fluoreskova. Preto je nevyhnutná derivatizácia týchto molekúl. V štruktúre fumonizínov sú štyri karboxylové kyseliny a jedna amino skupina. Využi reakcie karboxylovej skupiny je nevýhodné lebo sú štyri. Bolo by nevyhnutné, aby došlo k selektívnej reakcii vždy s tou istou karboxylovou skupinou v každej molekule fumonizínu. To však nie je reálne. Vekým predpokladom je, že by sme získali veké množstvo rôznych derivatizaných produktov, o by sa prejavilo pri ich separácii prítomnosou viacerých píkov v chromatografickom zázname. Preto je nevyhnutné orientova sa pri derivatizácii na amino skupinu. Tá je iba jediná v molekule fumonizínov a tak dostaneme vždy len jeden reakný produkt. Pri výbere derivatizaného inidla treba ma na zreteli urité základné požiadavky na inidlo: - chemická reakcia musí prebehnú jednoznane, kvantitatívne - inidlo musí ma o najvyššiu fluorescenciu - reakný produkt musí by stabilný dostatoný as - reakcia by mala by rýchla, nenároná na špecifické podmienky - derivatizácia musí by reprodukovatená - dôležitá je aj toxicita reakného inidla V súasnosti je dostupná pomerne široká paleta reagencií vhodných pre reakcie s primárnymi amínmi [149, 150]. Pre fumonizíny sa najastejšie používa zmes derivatizaných inidiel o- ftaldialdehyd a 2 merkaptoetanol [151]. Samotná derivatizaná reakcia prebieha poda nasledovnej schémy: 29

30 III. Súasný stav problematiky S R CHO CHO + + A NH 2 R SH N A A zvyšok molekuly fumonizínu (vi stranu 24) R zvyšok molekuly 2-merkaptoetanolu Obrázok 3. Reakná schéma derivatizácie fumonizínov. Reakciou vzniká komplex s dostatonou fluorescenciou. Testovali sa aj iné možné náhrady za 2 merkaptoetanol [151]. Okrem uvedenej zmesi derivatizaných inidiel je v literatúre opísaný aj 4-fluoro-7-nitrobenzofurazán [152]. V oboch prípadoch vznikajú tiež fluoreskujúce komplexy. Ekonomicky menej nároné je však používa zmes o-ftaldialdehydu a 2-merkaptoetanolu. Na kvantifikáciu derivatizovaných molekúl fumonizínov sa používa HPLC. TLC je možné tiež využi na kvantifikáciu fumonizínov, ale derivatizácia sa robí až po separácii [ ]. V prípade náhrady TLC s HPTLC sú získané detekné limity porovnatené s HPLC. Pri použití HPTLC (alebo aj TLC) sa na derivatizáciu používa fluoreskamín [154]. Pre skríningové úely je výhodné použi aj imunoafinitné súpravy [ ]. Dosahujú sa s nimi celkom dobré výsledky, porovnatené s HPLC, o sa týka limitu detekcie [159]. Zaiatkom 90. rokov sa na úpravu extraktu zo vzorky využívala predovšetkým extrakcia na pevnej fáze. V tomto prípade sa všeobecne používala iónovýmenná fáza silný vymiea aniónov (SAX) [160]. Postup založený na extrakcii fumonizínov z cereálnych produktov zmesou metanol : voda (3 : 1), následnom preistení extraktu na iónovýmennom materiáli a stanovení fumonizínov po derivatizácii s o-ftaldialdehydom pomocou HPLC s fluorescennou detekciou bol medzilaboratórne validovaný za podpory IUPAC [161]. Po následnom rozšírení stanovenia aj o fumonizín B 3 [162] bola metóda opätovne revalidovaná a stala sa oficiálnou metódou AOAC [163]. V niektorých prípadoch však výažnos danej metódy bola nízka a vtedy sa na preistenie extraktu používala namiesto iónovýmenných sorbentov bežná C18 chemicky viazaná fáza [164, 165]. Uvedením na trh imunoafinitných kolóniek znamenalo významný prelom v metódach stanovenia fumonizínov. Využitie tohto princípu pri úprave vzoriek znamenalo získanie podstatne istejšieho extraktu a tým aj lepšiu možnos eliminácie koeluujúcich látok [166, 167]. V rámci EU bola organizáciou CEN navrhnutá metóda založená na extrakcii pomocou 30

31 III. Súasný stav problematiky imunoafinitných kolóniek [168] a jej neskoršou modifikáciou a zlepšením [169]. Ale stále nie je úplná spokojnos s metódou stanovenia fumonizínov. Problémy sa prejavujú práve pri stanovení inej komodity ako sú cereálie a to pivo. Uvedený analytický postup je urený pre stanovenie fumonizínov B 1 a B 2 v kukurici a kukuriných výrobkoch [169] a umožuje stanovenie fumonizínov na hladine 0,01mg/kg. 0!"#$2(-;7'(% 2(*+ Sterigmatocystín (STE) je hlavným predstaviteom skupiny siedmych mykotoxínov. Najväšiu pozornos získali v sedemdesiatych rokoch 20. storoia. Produkujú ich mnohé huby rodu Aspergillus [3, 170]. STE je prekurzorom aflatoxínu B 1 v procese jeho biologickej syntézy [3, 171, 172]. Tento proces je dnes dobre známy a opísaný napríklad v [171]. Finálnym produktom biologického procesu je STE u húb Aspergillus nidulas [173], Aspergillus versicolor [5] ako aj u huby Emericella rugulosa [171]. Nesporulujúce alebo slabo sporulujúce mikroorganizmy Aspergillus versicolor obsahujú väšie množstvo STE v porovnaní Aspergillus versicolor conídiami, ktoré obsahujú vemi malé množstvo STE [174]. Aspergillus versicolor je charakteristický schopnosou rás na materiáloch s malou výživovou hodnotou a s nízkou vodnou aktivitou. Preto sa asto nachádza na múroch obydlí [174]. Podmienky pre rast Aspergillus versicolor a produkciu STE vymedzujú hranice teploty - minimálna 4 o C a maximálna 40 o C. Optimálne termické podmienky sú v rozmedzí 20 až 30 o C. Hraniné hodnoty ph sú v rozsahu 3 až 8, optimálne je ph 5. Vodná aktivita môže by v medzi hodnotami a w 0,3 0,98, optimálne 0,84 [174]. 0, -+#.(+(/'2(-;7'(% 2(*+ Do skupiny sterigmatocystínov radíme celkove 7 rôznych štruktúrne podobných molekúl [3, 172]. Hlavným predstaviteom je STE: 31

32 III. Súasný stav problematiky O R R 3 O O R 1 O R 2 1. R = R 3 = H; R 1 = OCH 3 ; R 2 = OH...sterigmatocystín 2. R = R 3 = H; R 1 = R 2 = OH... dimetyl sterigmatocystín 3. R = H; R 1 = OCH 3 ; R 2 = R 3 = OH... 5-hydroxysterigmatocystín 4. R = R 3 = H; R 1 = R 2 = OCH 3... O-metylsterigmatocystín 5. R = OH; R 1 = R 2 = OCH 3 ; R 3 = H... aspertoxín 6. R = H; R 1 = OCH 3 ; R 2 = R 3 = OH... 5-hydroxydihydrosterigmatocystín 7. R = R 3 = H; R 1 = OCH 3 ; R 2 = OCH 3... dihydro-o-metylsterigmatocystín Obrázok 4. Molekulová štruktúra mykotoxínov skupiny sterigmatocystín STE bol izolovaný prvý raz v roku 1954 a jeho štruktúra bola definovaná o osem rokov neskôr [175]. 00 )%1#'2(2(2(-;7'(% 2(*+ &'( STE sa pripisujú karcinogénne úinky [170, 176]. Detailné pôsobenie STE na bunku je predmetom štúdie, ktorú publikovali T-X Xie a kol. [177]. Sledovali vplyv pôsobenia STE na bielkovinu p53, ktorá hrá dôležitú úlohu ako ochranca genómu [178] v bunke. P53 je bielkovina s 393 aminokyselinami s polasom života približne 20 minút [179] má významnú funkciu v prípade apoptózie buniek. Druhá vemi významná úloha pôsobenia tejto bielkoviny je v kontrole DNA a v následnom uzavretí bunkového cyklu ak dôjde k poškodeniu DNA [178]. Bunka sa následne po uzavretí bunkového cyklu nemôže alej replikova. Opakom génu p53 je gén MDM2, ktorého bielkovina inhibuje uzavretie bunkového cyklu aktivovaného práve bielkovinou p53 [177]. Predpokladá sa, že oba tieto faktory pôsobenia bielkoviny p53 sú dôležité 32

33 III. Súasný stav problematiky pre ochranu organizmu pred mutáciami DNA a aj nádorovým ochorením. V 50 % nádorov bola detegovaná bielkovina MDM2 a neboli tam prítomné žiadne molekuly bielkoviny p53 [179]. T-X Xien a kol. [177] sledovali obsah p53 bielkoviny a MDM2 bielkoviny v bunkách, ktoré boli vystavené pôsobeniu STE po dobu 12 a 24 hodín. Pôsobením STE nedošlo k aktivácii p53 génu a práve opane bol aktivovaný gén MDM2. Tento jav bol potvrdený po 12, ako aj po 24 hodinách pôsobenia STE [177]. Dôsledkom uvedeného pozorovania je fakt, že v bunkách, na ktoré pôsobil STE nedošlo k uzavretiu bunkového cyklu. Predpokladá sa, že karcinogénne pôsobenie STE spoíva v aktivácii génu MDM2 a následne k blokovaniu génu p (2(-;7'(% 2(*+ Hlavný producent STE Aspergillus versicolor bol najastejšie identifikovaný na stenách domov, ktoré boli vystavené intenzívnemu pôsobeniu vody záplavám [174]. Na stanovenie sterigmatocystínu použili HPLC s UV detekciou pri 248 nm. Metóda umožnila detegova STE na hladine 1 mg/kg [174]. V Holandsku, v centrálnom Škótsku a v Londýne v 9 z 11 testovaných domových interiéroch boli tiež zistené huby Aspergillus versicolor ako aj v 50 % testovaných škôl [180]. Podobné výsledky boli zistené aj v obdobných testoch vo Fínsku [181]. Tu bol STE detegovaný v 24 % testovaných vzoriek z domových interiérov, ktoré boli predtým vystavené záplavám. Jednou z mála dostupných komplexných štúdií so zameraním na zistenie obsahu STE v potravinách je práca Food Standards Agency vo Vekej Británii [182]. V roku 1998 podrobili analýze 283 vzoriek zo 17 rôznych komodít na báze syrov, kukurice a iných cereálií. Ani v jednej testovanej vzorke nebol detegovaný STE. Detekný limit použitej metódy bol 3 µg/kg. Štúdia naväzovala na predchádzajúce projekty, ktoré zaali v roku Vtedy bol STE detegovaný v 2 z 29 vzoriek kukurice, v 13 vzorkách múk na báze pšenice nebol detegovaný. Predchádzajúca kontrola v potravinových výrobkoch bola v rokoch 1997 a 1998 [182]. Vtedy sa celkovo skontrolovalo 263 vzoriek, priom STE nebol detegovaný v žiadnej zo vzoriek. Napriek týmto výsledkom a vzhadom na to, že STE sa sporadicky môže vyskytova v potravinách, rozhodli sa v tejto kontrole naalej pokraova. Jednou z mála prác, kde bol STE detegovaný v potravinách bola hubami silne kontaminovaná ryža [175]. STE bol stanovený aj vo vzorkách kávy [183] a piva [184]. 05 '48'2(-;7'(% 2(*+ STE nepatrí k prchavým látkam a preto najvhodnejšia možnos jeho stanovenia je založená na extrakcii zo vzorky, zakoncentrovaní a stanovení použitím vhodnej separanej metódy. Aj pre 33

34 III. Súasný stav problematiky STE platia rovnaké požiadavky na stanovenie limit detekcie by mal by na hladine µg/kg. V opanom prípade nie je možné vyhovie požiadavke potravinovej legislatívy 5 µg/kg [2]. V literatúre sú opísané postupy stanovenia tejto látky pomocou kvapalinovej chromatografie s detekciou založenou na meraní absorbancie v UV oblasti [185, 186]. Detekný limit na úrovni mg/kg, ktorý je možné dosiahnu s UV/VIS detektorom, je samozrejme nevyhovujúci. Samotný STE má vemi slabú fluorescenciu v silne kyslom prostredí. Ani derivatizáciou dvojitej väzby vo furánovom kruhu jej hydrolýzou ( o je asto používaný spôsob na zvýšenie fluorescencie u aflatoxínov) nedošlo k zvýšeniu fluorescencie tejto zlúeniny [187]. Výrazne indukova fluorescenciu sa podarilo až s využitím po kolónovej derivatizácie, kedy reakným inidlom bol roztok chloridu hlinitého [188, 189]. Uvedeným spôsobom bolo možné stanovi STE na hladine 20 µg/kg. Najlepší výsledok z pohadu detekného limitu bol publikovaný na hladine 2,4 µg/kg v syre [189]. Na dosiahnutie požadovanej hladiny detekcie bola na stanovenie použitá kvapalinová chromatografia s hmotnostne selektívnym detektorom [189, 190]. V súasnej dobe je to metóda s najnižšou hodnotou detekného limitu pre cereálne výrobky. Alternatívnym postupom k detekcii pomocou hmotnostne selektívneho detektora môže by postup založený na separácii extrahovaného STE pomocou tenkovrstvovej chromatografie (TLC) a následne derivatizáciou s roztokom chloridu hlinitého. Po zahriati dôjde k vytvoreniu komplexu medzi chloridom hlinitým a STE, ktorý fluoreskuje. Pomocou vhodného detekného systému je možné následne stanovi STE s využitím metódy externého štandardu [ ]. Pri spracovaní vzorky je potrebné na extrakciu použi chloroform. Je to spoloný krok pre záverenú kvantifikáciu s TLC alebo s MS detektorom. Spolonou nevýhodou oboch postupov na stanovenie STE je nutnos použi chloroform v extraknom procese. Ani prípadná aplikácia gélovej chromatografie nedáva možnos vyhnú sa použitiu chloroformu [189]. V prípade aplikácie TLC je nevýhodou derivatizácia s roztokom chloridu hlinitého. Pri postrekovaní TLC dosky môže dôjs úniku kvapiek roztoku chloridu hlinitého do prostredia, o je nebezpené z pohadu zdravia personálu. Vysoko-úinná tenkovrstvová kvapalinová chromatografia (HPTLC) s použitím NH 2 chemicky viazaných fáz sa úspešne používa pri stanovení napríklad cukrov s využitím fluorescennej detekcie [ ]. Po separácii a termickej úprave sa generuje fluorescencia vo škvrnách, ktoré zodpovedajú práve eluným asom (R f hodnota) fruktózy alebo glukózy [196]. Nie je známe k akej molekulovej transformácii dochádza v molekulách analyzovaných cukrov. Akceptuje sa vysvetlenie vzniku nešpecifických zlúenín [ ]. Vekou výhodou tohto postupu je generovanie fluorescencie bez použitia reagentov. HPTLC výrazne umožuje šetri 34

35 III. Súasný stav problematiky rozpúšadlá a súasná automatizácia v uvedenej oblasti dáva možnos na reprodukovatené stanovenia aj STE. 35

36 IV. Cie práce <= >< Kvapalinová chromatografia v spojení s fluorescennou detekciou je vhodný nástroj na detekciu rôznych látok na hladine µg/kg. Z tohto dôvodu má uvedená technika dominantné postavenie v analýze mykotoxínov. V prípade mnohých mykotoxínov je použitená až po vhodnej derivatizácii týchto látok. Prvým cieom predloženej práce je navrhnú analytický postup na stanovenie fumonizínov a ochratoxínu A v pive so zameraním na o najnižší detekný limit. V prípade sterigmatocystínu je cieom pripravi alternatívnu analytickú metódu k LC/MS na jeho stanovenie v cereálnych produktoch. V druhej asti sa navrhne a overí postup na možnú minimalizáciu fumonizínov a ochratoxínu A v pive. Pre dosiahnutie uvedených cieov je nevyhnutné vykona nasledovné práce: 1. návrh metódy na stanovenie ochratoxínu A v pive 2. výber vhodných derivatizaných inidiel pre fumonizíny 3. separácia a detekcia derivatizovaných molekúl fumonizínu 4. stanovenie fumonizínov v pive 5. výber derivatizaných inidiel na stanovenie sterigmatocystínu 6. návrh extrakného postupu sterigmatocystínu z cereálnych produktov bez aplikácie chlórovaných rozpúšadiel 7. vypracovanie vhodného separaného postupu na stanovenie sterigmatocystínu 8. výber sorbentov pre elimináciu fumonizínov a ochratoxínu A z piva 9. overenie možnosti použitia externého fyzikálneho poa na imobilizáciu vybraných mykotoxínov z piva 36

37 V. Materiál a metódy >? Všetky použité chemikálie boli minimálne stupa istoty pre analýzu. Rozpúšadlá a zložky mobilnej fázy pre HPLC voda, metanol, acetonitril boli stupa istoty pre HPLC. Merania sme robili minimálne v troch opakovaniach. Kalibrané iary sme konštruovali minimálne zo 6 koncentraných hodnôt. Na výpoty sme použili program Windows Excel. Urovanie limitov detekcie a kvantifikácie sme odvodili od hodnoty štandardnej smerodajnej odchýlky stanovenia príslušného analytu na hladine blízko limitu stanovitenosti. Získanú hodnotu štandardnej odchýlky stanovenia sme vynásobili íslom 3 a tak dostali limit detekcie. Pri násobení hodnoty štandardnej smerodajnej odchýlky íslom 10 sme dostali limit kvantifikácie. Uvedený spôsob urovania limitov kvantifikácie a detekcie je vhodnejší ako postup výpotu parametrov z kalibranej iary. Aplikáciou postupu z kalibraných iar a štatistického programu StatGrafix sme dostali nižšie hodnoty pre limity detekcie a kvantifikácie. Reálnejší obraz o dvoch zásadných metrologických parametroch metódy podáva nami použitý postup. Kvapalinová chromatografia - i už kolónová alebo tenkovrstvová v spojení s detekciou založenej na meraní fluorescencie je dominantným nástrojom využívaným na stanovenie mykotoxínov. Pre stanovenie ochratoxínu A (Sigma Aldrich, Louisiana, USA) sme požili kvapalinový chromatograf Agilent Technologies 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, USA). Kvaternálne erpadlo s automatickým dávkovaom dávkovali vzorky na kolónu Zorbax SB C18, 4,6x250 mm, vekos astíc 5 µm tiež od Agilent Technologies. Na detekciu sa použil fluorescenný detektor s nastavením vlnových džok: excitaná 335 nm a emisná 460 nm (je výhodné použi možnos detektora mera emisiu v širokom pásme vlnových džok s automatickým výberom maxima prístrojom). Na kvantifikáciu bola použitá metóda externého štandardu, ktorý bol dodaný firmou Sigma - Aldrich. Na prípravu vzoriek boli použité imunoafinitné kolónky Ochraprep od firmy Biopharm Rhone (Glasgow, United Kingdom). Mobilná fáza bola zmes acetonitril voda (s prídavkom 20 ml adovej kyseliny octovej na 1000 ml vody) v pomere 50 : 50 (v/v); acetonitril - Sigma Aldrich (Louisiana, USA); voda (odpor 14,5 ΜΩ) - Purite Select (Purite Ltd., Oxon, United Kingdom). Samotný ochratoxín A nefluoreskuje pri ph 7 a viac, ale pri ph menej ako 5 dochádza k výraznej fluorescencii, ktorá sa následne využíva na jeho stanovenie. 37

38 V. Materiál a metódy 0 -#'(8%':+78*# Derivatizácia fumonizínov je nevyhnutný krok pre ich stanovenie na koncentranej hladine µg/kg. Kritériám pre výber vhodných derivatizaných inidiel vyhovujú nasledovné zlúeniny: 1. o-ftaldialdehyd (OPA) (Merck, Darmstadt, Nemecko) 2. 4-chloro-7-nitrobenzofurazan (NBD-Cl) (Fluka, Buchs, Nemecko) 3. 5 dimetylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid - dansylchlorid (DC) (Merck, Darmstadt, Nemecko) Stabilita reakných komplexov s OPA je asovo znane obmedzená a preto sa k OPA pridávajú alšie reagenty, ktoré stabilizujú reakný produkt (reakná schéma na strane 30). Z potenciálnych možností sme testovali stabilitu komplexov s 2 merkaptoetanolom (MET) (Merck, Darmstadt, Nemecko) alebo s N-acetyl-L-cysteínom (N-AC) (Merck, Darmstadt, Nemecko). Kinetiku tvorby a stabilitu derivatizovaných molekúl fumonizínu sme študovali s UV/VIS spektrofotometrom Specol (Carl Zeiss, Jena, Nemecko) pri vlnovej džke 335 nm. Na kinetické merania sme použili fumonizín B 1 (Sigma Aldrich, Louisiana, USA). Je to dominantný predstavite skupiny fumonizínov a vzhadom na jeho štruktúrnu príbuznos s ostatnými fumonizínmi predpokladáme u nich obdobné reakno-kinetické vlastnosti. Výsledky zo štyroch reakných systémov tvorili základ pre následný výber najvhodnejšieho reakného inidla alebo zmesi inidiel pre ich využitie v celej metóde na stanovenie fumonizínov: 1. o-ftaldialdehyd (OPA) + 2 merkaptoetanol 2. o-ftaldialdehyd (OPA) + N-acetyl-L-cysteín 3. 4-chloro-7-nitrobenzofurazan 4. dansylchlorid 0, <&7'(;':%12('#--:+78*# Kvapalinový chromatograf Agilent Technologies 1100 s kolónou Zorbax SB C18, 4,6 x 250 mm, vekos astíc 5 µm (Agilent Technologies, Palo Alto, USA) sme použili aj na stanovenie fumonizínov B 1 a B 2 (Sigma Aldrich, Louisiana, USA). Excitaná vlnová džka fluorescenného detektora bola 335 nm len pre NBD-Cl bola 465 nm. Detektor umožuje automatickú detekciu maximálnej emisnej vlnovej džky a preto nie je potrebné túto zvláš mera pre rôzne derivatizané inidlá alebo ich zmesi. Na elúciu boli použité metanol, 38

39 V. Materiál a metódy acetonitril a vodný roztok kyseliny octovej. Všetky chemikálie boli z toho istého zdroja, ako v prípade metódy na stanovenie ochratoxínu A. Na extrakciu fumonizínov zo vzoriek piva sme použili metódu Scott and Lawrence (126). Imunoafinitné kolónky Fuminoprep (Biopharm Rhone, Glasgow, United Kingdom) sú vhodné na extrakciu všetkých fumonizínov. V spolupráci so Štátnou veterinárnou a potravinárskou správou sme získali vzorky piva od rôznych výrobcov, od všetkých domácich pivovarov a aj niekoko vzoriek zahraniného pôvodu. Všetky vzorky piva boli vyrobené v roku Vekos jednej vzorky bol 1 liter. Celkove sme mali 19 vzoriek piva. Na vývoj analytických postupov bolo použité svetlé pivo Stein 10 %. Z tohto piva sa pripravili modelové vzorky s vhodným obsahom analyzovaných mykotoxínov.! Možnos minimalizácie mykotoxínov v modelových vzorkách piva sme overili na pevných materiáloch. Na tento cie boli testované nasledovné pevné materiály sorbenty. Al 2 O 3 - Alumina neutral Al 2 O 3 -Alumina zásaditá Al 2 O 3 -Alumina kyslá Ambesorb Combigel XE- 305 Lipofílny Sephadex Florisil Standard Silikagél (Merck, Darmstadt, Nemecko) Silikagél 3-Aminopropyl 3-Chloropropyl Oktyl Oktadecyl Amberlite XAD-4 Diaion/Sephabeads SP850 39

40 V. Materiál a metódy Dowex Optipore L- 493 Všetky sorbenty s výnimkou Silikagélu od firmy Merck boli dodané od Sigma-Aldrich (Louisiana, USA). Modelové experimenty sme robili pomocou jednorázových plastových striekaiek s plastovými fritami s objemom 3 ml. " # $ Ochratoxín A tiež aj fumonizíny sú molekuly s výrazným dipólovým momentom. Z toho dôvodu sa predpokladá ich sorpcia hlavne na polárnych sorbentoch. Molekuly charakteristické dipólovým momentom sa v magnetickom poli neorientujú náhodne, ale dochádza k zmene ich orientácie v závislosti na smere magnetického poa. Preto v navrhnutých experimentoch sme študovali možnos zvýši sorpciu mykotoxínov na vybraných pevných materiáloch aj pomocou homogénneho magnetického poa. V závislosti od zdroja elektrického prúdu môže by toto pole bu stále alebo premenlivé (jednosmerný alebo striedavý elektrický prúd). Zariadenie, ktoré má požadované vlastnosti je cievka bez jadra. V dutine, namiesto jadra je takto vytvorené homogénne magnetické pole. Telo cievky musí by vyrobené tak, aby sa dali spravi dve sériové vinutia prerušené materiálom tela cievky. Po zapojení na zdroj jednosmerného elektrického prúdu s hodnotou 12 V je potom v dutine cievky homogénne magnetické pole. Po zapojení cievky na zdroj striedavého prúdu je v dutine cievky medzi dvoma vinutiami homogénne striedavé magnetické pole. Požadované zariadenie bolo zhotovené v konštrukných dielach Výskumného ústavu potravinárskeho. Rozmery cievky sú zvolené tak aby umožnili zasunú do dutiny cievky jednorázové plastové striekaky naplnené testovanými sorbentami. Zrnitos sorbentov je dostatoná na to, aby testované vzorky piva sa dali premýva s využitím gravitanej sily prípadne podtlaku. Podtlak sa vytvorí pripojením striekaky na zariadenie urené na extrakciu na pevnej fáze (Supelco, Sigma-Aldrich, Louisiana, USA). Schéma zariadenia je v Prílohe. 1. % &# Podobne ako u fumonizínov aj v príde STE je nevyhnutná derivatizácia, aby sa dosiahla fluorescencia, pomocou ktorej je možný posun detekného limitu na hladinu µg/kg. Molekulová štruktúra STE (Sigma Aldrich, Louisiana, USA) je znane podobná štruktúre aflatoxínu B 1. Preto ako prvý pokus derivatizácie sme použili postup s Kobra celou (Biopharm Rhone, Glasgow, United Kingdom). Jej aplikácia v prípade aflatoxínu B 1 výrazne zvyšuje jeho fluorescenciu o následne umožuje jeho detekciu na hladinách µg/kg. Po použití Kobra cely pre STE žiadna zmena vo fluorescencii nebola pozorovaná. Preto je 40

41 V. Materiál a metódy nevyhnutné použi alternatívne postupy pre derivatizáciu. Vzhadom na molekulovú štruktúru STE (vi kapitolu II-3.2) nasledovné známe derivatizané inidlá organické zlúeniny boli testované: 1. Derivatizácia keto skupiny Dansyl hydrazíne 2. Derivatizácia hydroxyl skupiny 3. Tvorba komplexov Derivatizané testy sme robili s použitím vybraných inidiel a TLC dosiek so silikagélom (Merck, Darmstadt, Nemecko) na vyhodnocovanie fluorescencie derivatizovaných molekúl STE. UV lampa s vlnovou džkou 360 nm a 254 nm sa použila na rýchly skríning s vizuálnym hodnotením. Použitie TLC dosiek umožovalo jednoduché použitie vhodných variácií fyzikálnych podmienok (teplota, vlnové žiarenie). Po otestovaní vybraných derivatizaných inidiel a vyhodnotení výsledkov TLC dosky so silikagélom testy boli robené aj s použitím modifikovaného silikagélu C18 chemicky viazaná fáza, ako aj NH 2 chemicky viazaná fáza (Merck, Darmstadt, Nemecko). Zariadenie Linomat IV (Camag, Muttenz, Switzerland) sme použili na nanášanie vzoriek na HPTLC dosky s NH 2 chemicky viazanou fázou. Na vyhodnocovanie bol použitý Camag TLC Scanner (Camag, Muttenz, Switzerland). Po vypracovaní metódy na derivatizáciu STE 80 vzoriek cereálií francúzskej výroby bolo analyzovaných na prítomnos STE. 41

42 VI Výsledky a '()#.--%1!6'$'#!-7-(A$''2('#--%&'()*+ Výsledky stanovenia ochratoxínu A v slovenských pivách v roku 1998 na bývalej SPPI sú prezentované v asti III 1-4 v Tabuke 3. Badatený je nízky obsah tohto mykotoxínu na hladine výrazne pod legislatívnymi požiadavkami, ale pozoruhodné je, že až 79 % vzoriek obsahovalo stanovitelné množstvo OTA. Z uvedeného dôvodu požiadavky na analytickú metódu sú nasledovné: Limit stanovitelnosti na hladine 0,03 µg/kg a limit detekcie na hladine 0,01 µg/kg. Na stanovenie OTA na požadovaných koncentraných hladinách sme použili HPLC s fluorescennou detekciou. Základom navrhnutej metódy je postup založený na nasledovných krokoch: 1.) Spracovanie matrice s využitím imunoafinitnej adsorpcie 2.) Separácia 3.) Stanovenie OTA metódou externého štandardu.,!'%#'-7'(%- Predpokladáme, že OTA v pive je homogénne distribuovaný. Tento predpoklad je plne odôvodnitený, nakoko OTA sa v dôsledku polarity svojej molekuly v pive rozpúša. Problém ohniskového výskytu OTA v slade je teda eliminovaný. V tomto prípade prvým krokom spracovania vzorky je jej dôkladné odplynenie. Testovali sme nasledovné možnosti: 1.) odplynenie v ultrazvukovom kúpeli 2.) odplynenie prefiltrovaním piva cez papierový filter 3.) kombinácia oboch vyššie spomenutých postupov. Optimálnym riešením bola tretia možnos to znamená odplynenie v ultrazvukovom kúpeli a následná filtrácia cez skladaný filtraný papier. Takto pripravená vzorka piva pretekala cez imunoafinitnú kolónku plynulo, problémy spôsobené nedôsledným odplynením sa prejavili spomalením prietoku ako aj znížením výažnosti. Po dôkladnom odplynení sme v druhom kroku zameranom na extrakciu OTA z piva použili imunoafinitné kolónky OCHRAPREP (R-Biopharm Rhône, LTD, Glasgov, Veká Británia). Kolónky sme uskladovali pri teplote 5 o C. Preto pred pokusmi sme ich temperovali na teplotu laboratória minimálne 2 hodiny pred použitím. Pred samotnou extrakciou OTA bolo nevyhnutné kolónky kondicionova. Kondicionovanie kolónky spoívalo v premytí s 10 ml 42

43 VI Výsledky a diskusie PBS (fosfátový tlmivý roztok s ph = 7,37). Následne sme cez kolónku nechali pretiec 150 ml piva. Prietok vzorky cez kolónku bol 3 kvapky za dve sekundy. Tento prietok sme dosiahli len pôsobením gravitácie o znamená, že nebolo potrebné používa podtlak pomocou vodnej vývevy. Na zaiatku sme optimalizovali množstvo piva, ktoré môžeme premy cez jednu imunoafinitnú kolónku. Optimum z pohadu faktora zakoncentrovania, rýchlosti pretekania cez kolónku (postupné spomaovanie prietoku) a s tým súvisiaceho asu bolo 150 ml piva. Testovali sme vplyv úpravy piva na výažnos. Vo vzorke 150 ml piva sme upravili ph na 7, zriedili sme ho pridaním 50 ml PBS, ku ktorému sme pridali polyetylén glykol (PEG) s molekulovou hmotnosou 6000 g/mol v takom množstve, aby sme mali 10 % (hmot.) zastúpenie PEG v 50 ml PBS. Sledovali sme vplyv uvedených úprav vzorky na výažnos OTA. Tabuka 5. Vplyv úpravy vzorky piva na výažnos OTA Úprava piva Plocha píku OTA (mau/s) Neupravené pivo 32,6 Pivo s úpravou ph = 7 32,0 Pivo + 50 ml (PBS a 10 % PEG) 34,0 Z výsledkov uvedených v Tabuke 5 je evidentné, že zmeny nemali vplyv na výažnos OTA a preto sme v alších experimentoch používali len pivo bez týchto úprav. Po zachytení OTA na imunoafinitnom sorbente v kolónke sme použili na premytie 10 ml vody a kolónku sme vysušili vzduchom. Kolónku sme pripojili k vodnej výveve a vysali vodu zachytenú na sorbente. Vodu nie je možné kvantitatívne úplne odstráni. Následne sme OTA vymyli pomocou metanolu. Testovali sme rôzne objemy metanolu na vymytie OTA. Výsledky sú uvedené v Tabuke 6. Tabuka 6. Vplyv množstva metanolu použitého na vymytie na výažnos OTA. Objem metanolu (ml) Plocha píku OTA (mau/s) 1 31,0 1,5 45,7 2 68,0 4 68,2 43

44 VI Výsledky a diskusie Na základe získaných výsledkov na vymývanie OTA z imunoafinitných kolóniek sme ako optimum používali 2 ml metanolu. Metanol sme zachytávali do 5 ml destilanej banky s guatým dnom. Rozpúšadlo sme odparili pomocou vákuovej rotanej odparky pri teplote 50 o C a reziduálnu vodu sme odstránili odfukovaním prúdom dusíka. Suchý zvyšok sme rozpustili v 0,5 ml mobilnej fázy. Zmes sme preniesli do 2 ml tmavej vialky, uzatvorili a dali do automatického dávkovaa kvapalinového chromatografu. 0 #'(:%'%&'()*+ Na stanovenie sme používali HPLC zariadenie automatickým dávkovaom a s dvoma detektormi detektor s diódovým polom a fluorescenným detektorom. Excitaná vlnová džka bola nastavená na 335 nm a pre merania emisie sme používali mód multi emisia. Takto sme mali garanciu urenia plochy píku OTA pri maximálnej emisnej vlnovej džke. Mobilnou fázou bola zmes metanolu a okyslenej vody (20 ml adovej kyseliny octovej sme pridali do ml vody) v pomere 51 : 49 (v/v.). OTA Obrázok 5. Chromatografický záznam štandardu OTA (koncentrácia 0,0125 mg/l). 44

45 VI Výsledky a diskusie OTA Obrázok 6. Chromatografický záznam vzorky piva s prirodzeným obsahom piva 0, 072 µg/kg. Pre spracovanie validaného protokolu sme použili pivo Zlatý bažant 10 o. V prvom kroku sme zistili prirodzený obsah OTA, ktorý bol 0,072 µg/kg. Výažnos navrhnutej metódy sme overili pomocou prídavku štandardu OTA tak, že konené koncentrácia OTA v pive bola 0,197 µg/kg. Validaný protokol definuje základné metrologické parametre analytickej metódy. Je základnou charakteristikou metódy, ktorú sme používali na vyhodnocovanie vplyvu sorbentov na interakcie s OTA v modelových systémoch. V navrhnutej metóde sme spracovali 150 ml vzorky piva, ktoré sme následne zakoncentrovali do koneného objemu ureného na separáciu pomocou HPLC - 0,5 ml, ím dochádza k 300 násobnému zakoncentrovaniu analytu. To nám umožnilo pohodlné stanovenie OTA na požadovanej koncentranej hladine. Je tu možnos zvýši hodnotu faktoru zakoncentrovania a to rozpustením suchého zvyšku po destilácii v 0,25 ml metanolu. Tým sme zvýšili jeho hodnotu na 600. alšou možnosou je nástrek 100 µl na separanú kolónu. Takýto veký objem je možné nastreknú na kolónu, ak je extrakt rozpustený v mobilnej fáze. V prípade rozpustenie suchého zvyšku len v metanole, maximálny objem použitený ako nástrek na separanú kolónu bol 20 µl. Je to dané vekosou priemeru použitej separanej kolóny. Pri rozpustení suchého zvyšku v metanole a nástreku 100 µl na kolónu dochádzalo k výraznému rozmytiu OTA, o neumožnilo identifikova jeho eluný pík. Vysoký stupe zakoncentrovania vzorky umožnilo práve použitie materiálu, ktorý využíva princíp imunoafinitných interakcií na zachytávanie OTA. Imunoafinitné ligandy sú úzko špecifické práve pre ochratoxín A, o potvrdzuje aj ilustraný chromatografický záznam vzorky piva Obrázok 6. Uvedenou separáciou sme dosiahli úrove stanovenia OTA na 45

46 VI Výsledky a diskusie požadovanej vemi nízkej hladine a tak aj kontrolovali, do akej miery sú úspešné postupy urené na zníženie obsahu OTA v potravinách. Druhou podmienkou na stanovenie OTA na koncentranej úrovni menej ako ppb je aplikácia detekcie založenej na meraní fluorescencie. Molekuly OTA majú len vemi nízku fluorescenciu v prípade ich rozpustenia v organických rozpúšadlách alebo v ich zmesiach s vodou. Výrazná fluorescencia sa pozoruje u OTA len v kyslom prostredí. To je dôvod preo sme pridávali relatívne veké množstvo kyseliny octovej do mobilnej fázy (v bežných HPLC meraniach sa taký vysoký obsah kyselín nepoužíva). Vzhadom na to, že fluorescencia je úzko spojená s planaritou molekuly, musí kyslé prostredie generova výrazne konformané zmeny v molekule OTA. Uvedený, relatívne jednoduchý spôsob výrazného zvýšenia fluorescencie, umožnil vyhnú sa derivatizaným reakciám. Na druhej strane bolo potrebné dba na selekciu separanej kolóny. V súasnej dobe požiadavke stability pri nízkom ph najlepšie vyhovuje práve kolóna Zorbax SB C18, ktorú sme úspešne využili pri našich experimentoch. Porovnatené kolóny od iných výrobcov (Merck, Darmstadt, Nemecko) nie sú tak stabilné pri ich dlhodobom používaní pri tak nízkom ph. V Prílohe. 2 je protokol vnútrolaboratórnej validácie metódy, ktorú sme použili na stanovenie OTA v pivách pri overovaní efektivity modelových vzoriek. '()#, -#'(8%':+78*# Vzhadom na to, že rozdiely v štruktúre fumonizínov B 1 a B 2 nie sú vemi veké, optimalizáciu derivatizácie sme robili s použitím štandardu fumonizínu B 1. Z oboch štandardov sme pripravili zásobný a pracovný roztok. Zásobný roztok štandardu, ktorý bol skladovaný pri teplote -18 o C sme pripravili rozpustením toxínu v zmesi acetonitril : voda v pomere objemov 1 : 1 na výslednú koncentráciu mg/ml. Pracovný roztok štandardu sme pripravili zriedením zásobného roztoku štandardu na hladinu 31.4 µg/ml. Pracovný roztok štandardu sme skladovali pri teplote 4 o C. Zásobný roztok fumonizínu FB 2 sme pripravili rovnakým postupom, ako zásobný roztok FB 1 na koncentráciu mg/ml. Pracovný roztok štandardu FB 2 sme zriedili na obsah 6.3 µg/ml. Podmienky skladovania oboch štandardov boli identické. Po urení optimálnych podmienok derivatizácie FB 1 sme tieto použili aj na derivatizáciu FB 2. Cieom derivatizaných reakcií bola NH 2 skupina, ktorá je stéricky ahko dostupná pre naviazanie vhodného fluorescenného inidla. Postupy opísané v kapitole III 2 6 sme aplikovali na štyri rozdielne reakné systémy. Porovnali sme ich efektovitu z pohadu stability a vekosti fluorescencie po reakcii s NH 2 skupinou. 46

47 VI Výsledky a diskusie ) * %(+%,- Základnú reaknú zmes sme pripravili z 40 mg OPA rozpustenom v 1 ml metanolu. Do roztoku sme pridali 5 ml tetraboritanu dvojsodného s koncentráciou 0.1 mol/l vo vode. Zmes sme premiešali na Vortexe poas jednej minúty. Do homogénnej zmesi sme pridali 50 µl 2- merkaptoetanolu. Zmes sme opätovne premiešali na Vortexe poas 1 minúty. Pripravený zásobný roztok derivatizanej zmesi sme skladovali pri teplote 4 o C a používali sme jeden týžde. Po tomto ase bolo potrebné pripravi erstvý roztok reaknej zmesi. Stabilitu sme preverili pravidelnými meraniami poas 4 týždov. Po týždni sme pozorovali zmeny v absorbancii zmesi. Kinetiku derivatizanej reakcie sme sledovali pomocou UV//VIS spektrofotometra. Merania sme robili s roztokom FB 1 s koncentráciou 4,1 µg/ml (400 µl pracovného roztoku FB 1 sme zriedili na 2770 µl s 0.1 mol/l roztokom tetraboritanu dvojsodného vo vode a pridali sme rôzne množstvo derivatizaného roztoku 60 µl, 30µl, 10 µl). Obsah FB 1 4 µg/ml sme vybrali na základe predpokladaného obsahu tohto mykotoxínu v reálnych vzorkách. Výsledky merania kinetiky derivatizanej reakcie sú na Obrázku 7. V prípade HPLC meraní s fluorescenným detektorom sme postupovali mierne odlišne. Na derivatizanú reakciu sme použili 450 µl roztoku pracovného štandardu FB 1 a pridali sme 50 µl derivatizanej zmesi. Po pretrepaní zmes bola pripravená na nástrek do HPLC systému. 0,05 0,04 Absorbancia 0,03 0,02 0, as (minúty) 10 ul 30 ul 60 ul Obrázok 7. Kinetika derivatizácie FB 1 so zmesou OPA + MET. 47

48 VI Výsledky a diskusie Výsledky prezentované na Obrázku 7 poukazujú na dôležitos použitého množstva reaknej zmesi. V prípade malého množstva zmesi reakných inidiel predstavujúcej prídavok 10 µl, optimum derivatizácie sme dosiahli po 6 minútach od pridania reaknej zmesi do roztoku FB 1. Ak sme pridali 60 µl, tak došlo k poklesu množstva derivatizovaných molekúl FB 1 už po 6 minútach. Relatívne stabilný produkt sme získali po pridaní 30 µl reaknej zmesi. Aj v tomto prípade dochádza po ase k rozkladu derivatizovaných molekúl FB 1. Optimálne množstvo pridanej reaknej zmesi je 30 µl za podmienok, v ktorých sme robili experimentálne merania. ) * %(+%,-., " Pri druhom derivatizanom systéme sme merkaptoetanol nahradili s N-acetylcisteínom. Reaknú zmes sme aj v tomto prípade pripravili podobným spôsobom, ako to bolo pri predchádzajúcej zmesi (OPA + MET) (40 mg OPA sme rozpustili v 1 ml metanolu a do roztok pridali do 5 ml 0.1 mol/l roztoku tetraboritanu dvojsodného rozpusteného vo vode). Zmes sme zhomogenizovali pomocou Vortexu poas jednej minúty a následne sme do nej pridali 50 mg N-AC. Vortex sme použili opä na dodatonú homogenizáciu reaknej zmesi poas jednej minúty. Kinetiku derivatizanej reakcie sme sledovali pomocou UV//VIS spektrofotometra. Merania sme robili s roztokom FB 1 s koncentráciou 4,1 µg/ml. Pri spracovaní sme použili rovnaký postup ako v prípade reakcie s Met + OPA. Výsledky merania kinetiky derivatizanej reakcie sú na Obrázku 8. V prípade HPLC meraní s fluorescenným detektorom sme postupovali mierne odlišne. Postup bol zhodný s postupom, ktorý sme použili pri zmesi OPA + MET. 48

49 VI Výsledky a diskusie 0,05 0,04 Absorbancia 0,03 0,02 0, as (minúty) 10 ul 30 ul 60 ul Obrázok 8. Kinetika derivatizácie FB 1 so zmesou OPA + N-AC. Po zámene merkaptoetanolu za N-acetoxycisteín je množstvo pridaného derivatizaného inidla ešte dôležitejším faktorom Obrázok 8. Celkový trend je v oboch prípadoch porovnatený 10 µl reakného inidla OPA + N-AC vyžaduje až 21 minút na dosiahnutie optimálnej reakcie. V zmesi OPA + N-AC derivatizaná reakcia prebieha pomalšie ako v zmesi OPA-MET. Aj v tomto prípade je najlepšie ak použijeme 30 µl derivatizanej zmesi. Je tiež dôležité, aby sme mali dostatoný optimálny nadbytok. ) * %('( Dansylchlorid (5 Dimethylaminonaphthalene-1-sulfonylchloride, DC) sme testovali už ako samostatnú chemickú zlúeninu, ktorá výrazne fluoreskuje. Derivatizaný roztok pre kinetické merania s UV/VIS spektrofotometrom sme pripravili rozpustením DC v acetonitrile. Koncentrácia DC v derivatizanom roztoku bola 1 mg/ml. Po zmiešaní reakných inidiel sme dosiahli záverený obsah FB 1 4 µg/ml. Túto úrove sme dosiahli zriedením 2100 µl roztoku FB 1 s 300 µl derivatizaného roztoku a 300 µl nasýteného roztoku hydrouhliitanu sodného. Zmes sme zhomogenizovali pomocou Vortexu poas 1 minúty. Po homogenizácii sme dali reaknú zmes do vodného kúpea nastaveného na 40 o C po dobu 30 minút. Následne sme zmes rýchlo schladili na teplotu miestnosti. Pred samotným meraním sme pridali 300 µl fosfátového tlmivého roztoku s ph =

50 VI Výsledky a diskusie 0,075 Absorbancia 0,065 0,055 0, as (minúty) Obrázok 9. Kinetika derivatizácie FB 1 s DC. Po zvolenom ase 30 minút, dansylácia FB 1 kompletne prebehla (Obrázok 9). Vzniknutý reakný produkt bol stály (merania sme robili len po 150. minútu, o sme považovali za dostatone dlhý as). Výhoda DC spoíva vo vemi dobrej stabilite vzniknutého reakného produktu. Nevýhodou je pomerne dlhý as, kým požadovaná reakcia prebehne. )/ * %('(/,,0,!%-%+ Roztok NBD-Cl sme pripravili v metanole s koncentráciou 9.1 mg/ml. Do roztoku FB 1 s konenou koncentráciou 4 µg/ml sme pridali 100 µl roztoku tetraboritanu dvojsodného s koncentráciou 0.1mol/l a 50 µl roztoku NBD-Cl. Zmes sme zhomogenizovali pomocou Vortexu poas jednej minúty. Následne sme ju zahrievali poas 5 minút pri teplote 60 o C. Po schladení na teplotu miestnosti sme pridali 100 µl zmesi metanol : 0.05M NaH 2 PO 4 (s ph = 5) v pomere objemov (1 : 1). 50

51 VI Výsledky a diskusie 0,205 0,2 Absorbancia 0,195 0,19 0,185 0, as (minúty) Obrázok 10. Kinetika derivatizácie FB 1 s NBD-Cl. Rôznym spôsobom sme menili termické podmienky, ako aj as derivatizácie FB 1 molekúl s NBD-Cl ale nepodarilo sa nám získa extrém (maximum absorbancie) v rámci maximálneho asu 151 minút, poas ktorého sme sledovali absorbanciu reaknej zmesi. Vo všetkých prípadoch priebeh zmien absorbancie bol podobný ako na Obrázku 10. NBD-Cl nie je vhodné derivatizané inidlo pre fumonizíny. Jeho hlavnou nevýhodou je dlhý as reakcie, o môže ma negatívny dopad na reprodukovatenos meraní.,, #'-$-#'(8'B4%&!2(+!#C7$-#42 2(17 Vyššie opísané modelové reakcie sme robili v definovaných podmienkach bez prítomnosti možných koextraktov z piva. Cieom bolo opísa asový priebeh chemických reakcií spojených s derivatizáciou fumonizínu B 1 a predovšetkým posúdi stabilitu vzniknutých reakných produktov. Derivatizácia s 4-Chloro-7-nitrobenzofurazánom neviedla k úspešnej derivatizácii FB 1 (Obrázok 10). Nepodarilo sa nám nastavi podmienky reakcie tak, aby sme pozorovali extrémnu hodnotu absorbancie. Vzhadom na rastúci gradient závislosti zmeny absorbancie od asu predpokladáme, že reakcia sa neskonila poas nami zvoleného asového intervalu pozorovania. Z tohto dôvodu nepokladáme NBD-Cl za vhodnú zlúeninu pre derivatizáciu fumonizínov. Dansylchlorid poskytuje po reakcii s FB 1 stabilný produkt vo vybranom asovom intervale (Obrázok 9). as 30 minút zvolený na priebeh a ukonenie chemickej reakcie je potrebné 51

52 VI Výsledky a diskusie dodrža. Vysoká stabilita reakného produktu je dôležitá v prípade, ak sa nepoužíva automatický dávkova vzoriek pre nástrek vzoriek na kolónu. OPA i už v spojení MET alebo N-AC vykazuje vemi rýchlu reakciu s FB 1. Jej nevýhodou je dos krátka doba stability derivatizovaných molekúl FB 1 (Obrázok 7 a 8). Prítomnos MET sa prejavuje v rýchlejšom priebehu reakcie (Obrázok 7 krivka 10 µl) ako v prípade N-AC (Obrázok 8 - krivka 10 µl). Dôležitým faktorom je množstvo použitého reakného inidla (Obrázok 7 a 8). Vzhadom na rýchlos chemickej reakcie derivatizácie fumonizínov najvýhodnejšie je použi kombináciu derivatizaných inidiel OPA + MET. K reprodukovateným meraniam je ale nevyhnutné ma možnos kontroly asu derivatizanej reakcie, ako aj prídavok derivatizaného inidla. Takéto možnosti zvyajne poskytuje použitie dnešných moderných HPLC zariadení vybavených automatickým dávkovaom vzoriek. Toto zariadenie sme využili pri meraní stability derivatizovaných molekúl FB 1. Pre uvedený cie sme požili automatický dávkova vzoriek, ktorý umožuje vykonáva s definovanými parametrami reprodukovatene miešanie viacerých inidiel z preddefinovaných vialiek, ako aj premiešavanie finálnej zmesi. Výhodou bolo, že následne sme nastrekli derivatizovaný štandard FB 1 a tak sme na meranie jeho obsahu použili priamo meranie fluorescencie vyjadrené ako plocha píku FB 1. Derivatizovaný fumonizín sme nastrekli v ase, ktorý sme pokladali za optimálny pre danú derivatizanú zmes alebo reagent. Tento as sme oznaili ako as 0. To znamená, že napríklad v prípade DC as nula je as, ktorý uplynul od zaiatku derivatizanej reakcie 30 minút. Následne sme nastrekli na separanú kolónu danú zmes ešte po 3 a 6 hodinách státia v autosampleri. Výsledky sú v Tabuke 7. 52

53 VI Výsledky a diskusie Tabuka 7. Porovnanie asovej stability derivatizovaných molekúl fumonizínu B 1. Derivatizaná zmes as [hodiny] Plocha píku [mau*s] FB µg/ml OPA + MET OPA + N-AC Dansylchloride NBD-Cl Výsledky meraní stability derivatizovaných molekúl FB 1 a ich fluorescencie potvrdzujú, že NBD-Cl nie je vhodné derivatizané inidlo. Rovnako je prekvapivá vemi nízka fluorescencia derivatizovaných molekúl FB 1. Najväšia fluorescencia je pozorovaná pri použití zmesi OPA + MET. V tomto prípade, hne po prebehnutí derivatizanej reakcie je maximum fluorescencie. Po ase nastáva jej veký pokles. Po 3 hodinách je to až 58 %. Preto je vemi dôležité, aby sa derivatizácia fumonizínov robila vždy za reprodukovatených podmienok, ktoré je možné spoahlivo kontrolova len s použitím vhodného typu autosamplera. Autosampler musí ma možnos vzájomného miešania a presného dávkovania vzoriek medzi vialkami. Pokia takéto zariadenie nemáme k dispozícii je nevyhnutné použi na derivatizáciu DC aj za cenu, že detekný limit takejto metódy bude výrazne vyšší, ako je tomu pri použití zmesi OPA + MET. To je dôsledkom 25krát nižšej fluorescencie derivatizovaných molekúl FB 1 s DC. V prípade zmesi OPA + N-AC je pokles fluorescencie po troch hodinách prakticky zanedbatený predstavuje len 0,9 %. Z pohadu stability derivatizovaných molekúl FB 1 so zmesou OPA + N-AC je použitie tejto zmesi výhodnejšie ako zmesi OPA + MET. Zmes OPA + N-AC sa prejavuje 4krát nižšou fluorescenciou FB 1 ako je to v prípade použitia zmesi OPA + MET. 53

54 VI Výsledky a diskusie Z pohadu dosiahnutia o najnižšej hodnoty detekného limitu stanovenia fumonizínov je optimálna zmes na derivatizáciu FB 1 zmes OPA + MET. Derivatizáciu a následný nástrek na separanú kolónu je nevyhnutné robi s pomocou vhodného autosamplera. Pri manuálnej kontrole derivatizácie, ako aj manuálnom nástreku na kolónu môže dôjs k vemi vysokej chybe v opakovatenosti meraní.,0!(7'8%'$-#'(8%-'2-!'%-:+78*# Pre stanovenie fumonizínov sme vybrali zmes OPA + MET, ktorá poskytuje najvyššiu odozvu pri použití fluorescenného detektora. Derivatizaný proces sme robili pomocou autosamplera. Pri použití zmesi OPA + MET je dôležité, aby bola v dostatonom optimálnom nadbytku. Vzhadom na predpokladaný obsah fumonizínov v analyzovaných vzorkách sme použili zmes so zložením: 40 mg OPA + 5 ml 0,1 mol/l roztoku tetraboritanu dvoj sodného + 1 ml metanolu + 30 µl MET. Zmes treba dôkladne premieša. Stabilita zásobnej zmesi je maximálne jeden týžde pri uskladovaní pri 4 o C (strana 47). Samotný priebeh derivatizanej reakcie je závislý od reprodukovateného množstva pridanej reaknej zmesi do vzorky a následného premiešania. Treba tiež dodržiava konštantný objem vzorky. Prídavok derivatizanej vzorky zo zásobnej vialky do vialky so vzorkou je jednoduché kontrolova. Preverili sme rôzne množstvá pridanej derivatizanej zmesi do modelového roztoku fumonizínu B 1 a sledovali aký má vplyv na plochu píku (Tabuka 8). Súasne sme optimalizovali postup premiešania vzorky s prídavkom reaknej zmesi. Použitý autosampler umožuje niekoko možností voby (Tabuka 9). Optimalizáciu miešania vzorky sme robili pri najmenšom množstve pridanej derivatizanej zmesi. Za týchto podmienok sme najlepšie preverili efekt jednotlivých technických možností miešania reagentov. Tabuka 8. Optimalizácia množstva derivatizanej zmesi. Koncentrácia FB 1 bola 1,25 µg/ml. Množstvo derivatizanej zmesi (µl ) Plocha píku FB 1 (mau*s) 2,5 411, ,2 7,5 4014, ,0 54

55 VI Výsledky a diskusie Tabuka 9. Optimalizácia miešania derivatizanej zmes. Koncentrácia FB 1 bola 1,25 µg/ml. Technické riešenie Plocha píku FB 1 (mau*s) SEAT def. 15,13 AIR def. 38,5 SEAT max 10,6 AIR max 9,6 Zmiešavacie merania sme robili pri objeme derivatizanej zmesi 2,5 µl. I ke tento objem nebol optimálny, pre urenie najvhodnejšieho spôsobu premiešania vzorky bol použitený z pohadu kvalitatívneho vyhodnotenia. Z Tabuky 9 vyplýva, že najvhodnejšie miešanie dosiahneme nastavením prístroja na Air.def miešanie. Z Tabuky 8 je evidentné, že dostatoný nadbytok derivatizanej zmesi je vemi dôležitým faktorom pre získanie správnych výsledkov stanovenia obsahu fumonizínov. alším krokom pri stanovení fumonizínov bola ich separácia pomocou HPLC zariadenia a identifikácia s fluorescenným detektorom. Základnou podmienkou separácie pomocou HPLC je, aby kapacitný faktor použitej kolóny pre sledovaný analyt bol väší ako 1. Testovali sme rôzne zloženia mobilnej fázy pre možnos izokratickej analýzy. ph vodnej zložky mobilnej fázy sme nastavili v prípade použitia fosfátového tlmivého roztoku na 3,2. V týchto podmienkach sme sa nevyhli chvostovaniu derivatizovaných molekúl fumonizínov, ako aj ich štiepeniu. Nahradením fosfátového tlmivého roztoku kyselinou octovou (10ml adovej kyseliny octovej v 1000 ml vody) sme tiež odstránili chvostovanie, ale v prípade použitia reálnych vzoriek piva v retennom ase fumonizínov sa eluoval pík neznámej látky. Až zmenou obsahu kyseliny octovej vo vodnej zložke (70 ml adovej kyseliny octovej v 1000 ml vody) a jej zastúpenia v zložení mobilnej fázy sa nám tento problém podarilo odstráni. Pre možnos dosiahnutia dobrého oddelenia derivatizovaných molekúl fumonizínov od potenciálnych koextraktov sme zvolili alternatívu k izokratickej separácii a to gradientovú separáciu (Obrázok 11). 55

56 VI Výsledky a diskusie FB 1 FB 2 Obrázok 11. HPLC záznam separácie Fumonizínov B 1 a B 2. Chromatografický záznam na Obrázku 11 odhauje alší problém a to štiepenie píkov v prípade oboch molekúl fumonizínov (plná iara). Fumonizíny obsahujú v štruktúre svojich molekúl 4 karboxylové skupiny. Tieto skupiny môžu disociova v závislosti od ph prostredia, v ktorom sa nachádzajú. Pre dostatonú separáciu a akceptovatenú hodnotu kapacitného faktora je nevyhnutné použi aj vodu, ako modifikátor organickej zložky mobilnej fázy. Dôležité je ph použitej vodnej zložky. Plná iara reprezentuje chromatografický záznam pri ph vodnej zložky 2,9 a chromatogram s prerušovanou iarou zase elúciu pri ph vodnej zložky 2,6. Jednoznane je nevyhnutné dba na to, aby ph vodnej zložky bolo minimálne 2,6. Na separáciu sme preto použili nasledovný gradient (Tabuka 10) Tabuka 10. Nastavenie optimálneho gradientu pre separáciu fumonizínov. as (minúty) Metanol [%)] Acetonitril B [%] 1000 ml voda + 70 ml adová kyselina octová [%]

57 VI Výsledky a diskusie Požadovanú hodnotu ph, ktorá garantuje symetrické a neštiepené píky pre derivatizované molekuly fumonizínov dosiahneme prídavkom na 7 % (objemových) adovej kyseliny octovej do vodnej zložky mobilnej fázy. Zvýšenie detekného limitu môžeme dosiahnu aj nástrekom väšieho objemu vzorky. Parametre použitej separanej kolóny umožujú nástrek až 100 µl vzorky. Pri takomto objeme nástreku sme tiež pozorovali štiepenie píkov. Je teda zrejmé, že okrem ph mobilnej fázy, sa prejavujú aj iné efekty. Odstránenie štiepenia píkov derivatizovaných molekúl fumonizínov by sme mohli dosiahnu pravdepodobne aj tým, ak by sme zvýšili obsah vodnej zložky v nastrekovanej vzorke. Toto nie je možné vzhadom na optimalizovaný derivatizaný proces. Z uvedeného dôvodu sme znížili celkový dávkovaný objem na 30 µl. Za týchto podmienok došlo k eliminácii štiepenia píkov derivatizovaných molekúl fumonizínov. Zníženie nastrekovaného objemu na 30 µl nemá dramatický vplyv na zmenu detekného limitu fumonizínov.,3!(7'8%'-)('%-:+78*#8#8-!#' V prípade stanovenia ochratoxínu A sa vemi dobre osvedili imunoafinitné kolónky na extrakciu a zakoncentrovanie toxínu z piva. Po elúcii toxínu sme už získali vemi istý extrakt bez interferujúcich zložiek. Z toho dôvodu sme aj pre extrakciu a zakoncentrovanie fumonizínov použili imunoafinitné kolónky. Imunoafinitné kolónky Fumoniprep sme skladovali pri teplote 4 o C a preto pred použitím sme ich nechali temperova poas 2 hodín na teplotu laboratória. Po temperovaní boli kondicionované s 10 ml PBS. Na kondicionovanie nebolo potrebné používa externú podporu vákuového zariadenia ureného pre extrakciu na pevnej fáze. Vzorka piva bola pred použitím prefiltrovaná cez filtraný papier. Takto sme dosiahli aj odstránenie oxidu uhliitého, ktorého prítomnos mala negatívne dopady na reologické vlastnosti vzorky piva pri jej spracovaní s imunoafinitnou kolónkou. Následne sme do 15 ml vzorky pridali 15 ml PBS. Cez kondicionovanú kolónku sme následne premyli 30 ml zriedenej vzorky piva. Ani v tomto prípade nebolo potrebné použi externé vákuové zariadenie, gravitácia ako hnacia sila bola dostatoná. Reziduá vzorky sme vymyli 10 ml PBS. Následne kolónka bola vysušená vzduchom a fumonizíny eluované s 3 ml metanolu. Metanol degraduje aj imunoafinitné ligandy naviazané na povrchu pevného nosia. Celý metanolový extrakt sme zachytili a metanol odparili pomocou vákuovej rotanej odparky až po objem cca 0,5 ml. Reziduálne rozpúšadlo sme odstránili dosucha pomocou jemného prúdu dusíka. Zvyšok sme rozpustili v 500 µl zmesi acetonitril + voda (1:1, v/v) ím zakoncentrovaná vzorka bola pripravená na analýzu. 57

58 VI Výsledky a diskusie Navrhnutý gradient garantoval dobrú separáciu derivatizovaných molekúl fumonizínu od reziduálnych látok, ktoré sa nepodarilo vymy z imunoafinitných kolóniek (Obrázok 12). FB 1 FB 2 Obrázok 12. Chromatogram vzorky piva s prídavkom fumonizínov B 1 a B 2. Plná iara - vzorka piva bez prídavku fumonizínov. Prerušovaná iara vzorka piva s prídavkom fumonizínov. V prezentovanom prípade je evidentné, že imunoafinitné kolónky na extrakciu a zakoncentrovanie fumonizínov z reálnych vzoriek piva nie sú tak extrémne selektívne, ako je to v prípade imunoafinitných kolóniek urených na extrakciu OTA. Dôvod bude pravdepodobne v tom, že imunoafinitné ligandy pre fumonizíny musia by efektívne nie len pre jednu molekulu, ako je to v prípade kolóniek Ochraprep. Fumoniprep kolónky by mali efektívne zachyti všetky tri molekuly fumonizínov tri mierne odlišné štruktúry. Túto úvahu potvrdzujú aj výsledky v Tabuke 11. Výažnos FB 1 je 93,8 % a pre FB 2 je to 78,9 %. Obe hodnoty výažnosti sú dostatoné, ale je zrejmé, že imunoafinitné ligandy preferenne zachytávajú FB 1. Toto je výhodné aj z toho dôvodu, že prirodzený výskyt fumonizínov sa postupne znižuje od FB 1 smerom k FB 3. Z uvedeného dôvodu je dôležité v prvom rade o najpresnejšie stanovi obsah FB 1, nakoko je to dominantný produkt fuzárií (kapitola III 2-4). 58

59 VI Výsledky a diskusie Tabuka 11. Vybrané metrologické parametre stanovenia fumonizínov v pive. íslo Prídavok FB 1 a FB 2 do modelovej Nameraný obsah Nameraný obsah vzorky piva [µg/l] FB 1 [µg/l] FB 2 [µg/l] Priemerná hodnota 3,82 3,21 Výažnos % 93,8 78,9 Štandardná odchylka s x [µg/l] 0, Limit detekcie [µg/l] Limit stanovenia [µg/l] Metóda na stanovenie fumonizínov je v Prílohe. 3. '()# 0 4-$-#'(8'B4%&B$-'2('#--2(-;7'(% 2(*+ ) ' Vzhadom na neúspech s derivatizáciou STE pomocou Kobra Cell zariadenia a úspechu s použitím chloridu hlinitého (kapitola III 3-5) sme sa rozhodli v prvom kroku otestova aj iné soli rôznych kovov. Mechanizmus derivatizácie s chloridom hlinitým nie je známy, ale použitá so pravdepodobne zablokuje voné zmeny rôznych stérických konformácií STE. Dôsledkom tohto efektu sa generuje planárna štruktúra STE a s tým spojená jeho fluorescencia, nakoko 59

60 VI Výsledky a diskusie aktívne chromofóry sa nachádzajú v jeho molekulovej štruktúre. Zamerali sme sa na otestovanie izovalentných iónov, ako je hliník v chloride hlinitom, ako aj ióny s nižším alebo vyšším valentným stupom ako 3. Pred týmito experimentmi sme si pripravili zásobný metanolický roztok STE s koncentráciou 0,875 mg/ml. Roztok sme skladovali pri teplote -18 o C. (odporúanie výrobcu). Zo zásobného roztoku sme pripravili pracovný roztok s koncentráciou 8,75 µg/ml. Pracovný roztok štandardu STE sme skladovali pri teplote 4 o C. Sledovali sme stabilitu skladovania pracovného roztoku STE. Poas 6 mesiacov sme dosahovali stabilné odozvy absorbancie roztoku. Testy sme robili na tenkovrstvových doskách (TLC) so silikagélom. Silikagél bol deponovaný na hliníkovej fólii. Hliníková fólia je mäkká, o umožnilo ju nastriha na malé asti pásy. Na pásy sme naniesli lokálne škvrnu - 10 µl pracovného roztoku STE. Po odparení rozpúšadla, sme na škvrnu naniesli ešte aj roztok s príslušnou soou. Nanášanie roztoku solí sme robili zariadením na sprejovanie TLC dosiek. Pred každým použitím sme toto zariadenie dôkladne umyli, aby nedošlo ku krížovej kontaminácii medzi soami. Roztok solí sme pripravili tak, že sme rozpustili 1 g soli v 70 ml vody a pridali ešte 30 ml metanolu. Pomocou UV lampy sme pozorovali, i nedochádza k fluorescencii škvrny s obsahom STE. Pozorovania sme robili hne po sprejovaní TLC dosky, ako aj po jej zahriati a odparení rozpúšadiel. Za referennú hladinu fluorescencie sme brali do úvahy výsledky získané s Al(Cl) 3. Použitá so FeCl 3 ZnCl 2 KBr NaI KH 2 PO 4 ZrCl 4 Sr(NO 3 ) 2 Efekt na sterigmatocystín žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave zmena fluorescencie na úrovni s AlCl 3 po termickej úprave žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave La(NO 3 ) 3 zmena fluorescencie 50 % z hodnoty AlCl 3 Ce(NO 3 ) 3 žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave Zr(NO 3 ) 4 rovnaký pozitívny efekt ako v prípade ZrCl 4 Valencia prvku v použitej soli má dominantný vplyv na generovanie fluorescencie v molekule STE. Fluorescencia nebola pozorovaná v prípade použitia iónov s valentnosou I alebo II. 60

61 VI Výsledky a diskusie Okrem valencie iónov sekundárny efekt má aj samotný použitý katión. Fe +3 a Ce +3 majú identickú valentnos ako Al +3 ale žiaden pozitívny efekt na fluorescenciu. V prípade iónov La +3 sme pozorovali fluorescenciu u STE ale výrazne nižšiu ako je v prípade Al +3. Ión Zr +4 je rovnako efektívny v spojení s aniónom Cl -1 alebo NO Toto naznauje, že v prípadné malé anióny minerálnych kyselín nemajú výrazný efekt na aktivitu katiónu. NH 3 H 3 PO 4 žiadna zmena vo fluorescencii po sprejovaní ani po termickej úprave pozorovaná fluorescencia po sprejovaní, jej strata po termickej úprave Testovali sme aj amoniak, ale nemal pozitívny vplyv na fluorescenciu STE. Zaujímavý je efekt H 3 PO 4 v roztoku, pri ktorom sme pozorovali fluorescenciu u STE. Preto sme spravili pokus pomocou HPLC, kde sme pridali do mobilnej fázy H 3 PO 4. V tomto prípade sme ale nepozorovali žiaden pík pomocou fluorescenného detektora. Je zrejmé, že efekt H 3 PO 4 je závislý od použitej koncentrácie tejto kyseliny. V prípade HPLC separácie bol obsah H 3 PO 4 5 % vo vodnej zložke mobilnej fázy. Obsah kyseliny na úrovni 5 % nebol dostatoný na zmenu fluorescencie STE. Z technických dôvodov nie je vhodné používa vyšší obsah kyseliny fosforenej vo vodnej zložke mobilnej fázy v prípade HPLC. Overili sme aj eventuálnu možnos synergického pôsobenia katiónov s vyššou valentnosou na fluorescenciu sterigmatocystínu. Použili sme ekvimolárnu zmes iónov Al +3 a Zr +4. Anión bol v oboch prípadoch Cl -1 a v druhom experimente sme použili pre Zr +4 ako anión NO Bez ohadu na to, aký anión alebo zmes aniónov sme použili žiaden synergický efekt sme nepozorovali. Fluorescencia STE bola na úrovni, ako keby sme použili iba jeden katión. Vplyv vekosti aniónu sme testovali s prídavkom kyseliny stearovej k roztoku AlCl 3 a Zr(NO 3 ) 4. V oboch prípadoch sme pozorovali zníženie fluorescencie. Môžeme konštatova, že generovanie fluorescencie v STE je závislé od valentnosti a od druhu použitého katiónu. V prípade trojvalentných katiónov je pozitívny efekt pozorovaný najlepšie s Al +3 iónom. Nie je jasné, preo obdobný efekt nemajú katióny Fe +3, Ce +3 a La +3. K efektivite Al +3 pravdepodobne prispieva aj amfotérny charakter hliníka. Pozitívny efekt sme dosiahli s použitím katiónu ešte vyššej valencie a to Zr +4. Malé anióny minerálnych kyselín nemajú vplyv na fluorescenciu STE. Negatívne sa prejaví až efekt väších aniónov organických kyselín, ako to bolo v prípade kyseliny stearovej. Použitie kyseliny octovej nemalo vplyv na fluorescenciu STE, ale tu je potrebné si uvedomi, že po termickej úprave sa kyselina octová odparila. V zásade sa nedá hovori o vplyve jej aniónov na fluorescenciu molekúl STE. Minerálne kyseliny majú pozitívny efekt na fluorescenciu STE, ale musia by použité v relatívne vysokých koncentráciách, o prakticky znemožuje ich využitie ako generátorov fluorescencie STE. Dôvodom pozitívneho efektu kyselín vo vyšších koncentráciách môže by 61

62 VI Výsledky a diskusie spôsobený ionizáciou atómov kyslíka v konjugovaných furánových cykloch, ím sa môže generova planárna štruktúra STE. Presný mechanizmus pôsobenia Al +3 eventuálne Zr +4 iónov na molekulu STE nie je známy. Jediným vysvetlením je, že tieto ióny efektívne vplývajú na planárnu štruktúru molekúl STE, o sa prejavuje fluorescenciou. Zo štruktúry STE (kapitola III 3-2) nie je zrejmé, ktoré centrá molekuly je potrebné zablokova aby výsledkom bola planárna štruktúra molekúl STE. ) 1' %('(+ Molekula STE obsahuje viacero polárnych skupín. Našim zámerom bolo atakova tieto polárne skupiny a tak sa pokúsi o generovanie fluorescencie. Pri aplikácii organických látok ako potenciálnych fluorescenných inidiel, sme použili v prvom kroku 1,3-diamíno benzén dichlorid (Obrázok 13). NH 2 HCl NH 2 HCl Obrázok 13. 1,3-diamíno benzén dichlorid. Našim cieom bolo pomocou NH 2 skupín zablokova karbonylovú a hydroxylovú skupinu (eventuálne jednu z nich) prostredníctvom vodíkových väzieb alebo priamou syntézou v molekule STE. Reakciu sme robili opä na TLC doskách a aj v zmesi jednotlivých zložiek v reakných bankách. Pokia bol roztok v kvapalnom stave, tak sme pozorovali fluorescenciu. Po termickej úprave TLC dosiek sme fluorescenciu stratili. Pokúsili sme sa pomocou HPLC a fluorescenného detektora zisti, i daný reakný produkt je možné separova a identifikova pomocou fluorescenného detektora. Po použití chromatografie sme neidentifikovali žiadny pík. Predpokladáme, že vo vodnom roztoku v kyslom prostredí vznikol iónogenny komplex aminoskupín s karbonylom alebo hydroxyl skupinou, priom v týchto podmienkach neprebehla chemická reakcia. Vzhadom na pozorované efekty, sa dá predpoklada, že ak sa podarí zablokova karbonylovú a hydroxylovú skupinu, tak molekula STE zane fluoreskova. Preto v alšom kroku sme sa pokúsili o priamu reakciu karbonylovej skupiny s 2,3-dinitro-1- hydrazínom (Obrázok 14, A) a s dansylhydrazínom (Obrázok 14, B), ktoré sa používajú ako reakné inidlá pre karbonylové skupiny s cieom stanovi tieto látky pomocou fluorescencie. 62

63 VI Výsledky a diskusie CH 3 N CH 3 NH 2 NH NO 2 O S O HN NO 2 NH 2 A B Obrázok 14. Molekulová štruktúra derivatizaných inidiel A-dinitro hydrazín, B dansyl hydrazín. 2,3-dinitro-1-hydrazín reaguje s karbonylovou skupinou poda reaknej schémy (Obrázok 15): Obrázok 15. Reakná schéma 2,3-dinitro-1-hydrazínu s karbonylovou skupinou. 63

64 VI Výsledky a diskusie Zo schémy je evidentné, že reakcia prebieha v kyslom prostredí. Testovali sme rôzne minerálne (kyseliny chlorovodíková, sírová, dusiná, fosforená), ako aj organické kyseliny (kyselina octová, kyselina mravia). Reakcie sme robili vo vialkách alebo na TLC doskách s termickými úpravami. Ani v jednom prípade sa nám nepodarilo generova fluorescenciu v molekulách STE. Vysvetlením je, že naviazaná karbonylová skupina nemá v zásade charakter klasickej karbonylovej skupiny. Karbonylová skupina je súasou konjugovaného cyklickému systému a tým nie je dostatone reaktívna. Toto sme potvrdili aj použitím dansyl hydrazínu, ktorý sa úspešne používa na derivatizáciu karbonylových skupín. Organickými inidlami sa nám nepodarilo generova fluorescenciu v molekulách STE. ) 2* %+3!% %('( Jedine použitím Al +3 alebo Zr +4 iónov sa nám podarilo efektívne derivatizova molekuly STE tak, že sme získali potenciálnu možnos použi daný postup ako finálny krok pre realizáciu fluorescenných meraní. Bola to šanca mera obsah STE na hladine µg/kg. Al +3 ióny sa musia formou spreju nanies na TLC dosku, následne ju zohria, odpari rozpúšadlo a potom môžeme mera fluorescenný tok získaných derivatizovaných molekúl STE. Druhá možnos použitia Al +3 iónov na derivatizáciu STE v HPLC je opísaná Scudamorom (189). Pri oboch postupoch sa musí používa roztok hlinitých solí, ktoré môžu ma negatívny efekt na zdravie loveka. Preto by bolo ideálne, ak by sa dalo vyhnú nutnosti používa soli hliníka eventuálne alších prvkov ( Zr +4 ), ktoré sú zase aj ekonomicky dos nároné. Pokúsili sme sa otestova možnos použitia chemicky viazaných fáz na silikagéli ako potenciálnych zdrojov derivatizácie STE. Je nevyhnutné aby tieto chemicky viazané fázy generovali planárny tvar molekúl STE. Samotný STE už obsahuje chromofór, preto nie je potrebné nejaký chromofór na chemicky viaza. Vzhadom na známe literárne údaje (kapitola III 3-5) sme skúsili experiment s NH 2 chemicky viazanou fázou. Roztok STE sme naniesli na TLC dosku s NH 2 chemicky viazanou fázou. Na TLC dosku so silikagélom sme naniesli rovnaké množstvo roztoku STE a následne sprejovali s AlCl 3. Obe dosky sme dali do sušiarne vyhriatej na 110 o C. Po krátkom ase sme vybrali TLC dosku s AlCl 3 a po 10 minútach aj dosku s NH 2 chemicky viazanou fázou. Výsledok derivatizácie sme pozorovali pomocou UV lampy. V oboch prípadoch sme dosiahli zhodnú fluorescenciu. Získaný pozitívny výsledok sme zreprodukovali už s kontrolovaným automatickým dávkovaním roztoku STE a klasickú TLC dosku s chemicky viazanou fázou NH 2 sme vymenili za HPTLC dosku. Chemicky viazaná fáza NH 2 bola na silikagéli s kontrolovanou 64

65 VI Výsledky a diskusie vekosou sférických mikroastíc deponovaná na skle. Testovali sme rôzne asy (3 až 30 minút) a teploty (80 až 200 o C) termickej modifikácie a získané optimum bolo 15 minút pri 150 o C. A B Obrázok 16. Fotografia HPTLC dosiek po UV lampou so sterigmatocystínom. Identické koncentrácie sterigmatocystínu na oboch doskách. A NH 2 chemicky viazaná fáza po termickej úprave B silikagél, sprejované s AlCl 3 a následná termická úprava Pri použití derivatizácie bez reakného inidla (HPTLC doska s NH 2 chemicky viazanou fázou a termická úprava) sme boli schopní rozozna voným okom pod UV lampou (vlnová džka 360 nm) koncentráciu STE 20 µg/kg. V prípade AlCl 3 (aj tu HPTLC) je hladina vizuálnej identifikácie posunutá výrazne vyššie až k hranici 40 µg/kg. Eluná mobilná fáza bola zložená zo zmesi toluén : acetón 95 : 5 (v/v). Bola identická pre NH 2 chemicky viazanú fázu ako aj pre silikagél. Vplyv termicky indukovanej fluorescencie je dokumentovaný aj na Obrázku

66 VI Výsledky a diskusie Obrázok 17. Absorbancia a fluorescencia sterigmatocystínu. Krivka A absorbancia sterigmatocystínu pred termickou úpravou Krivka B absorbancia sterigmatocystínu po termickej úprave Krivka C fluorescencia sterigmatocystínu po termickej úprave Evidentná je aj zmena UV absorbancie, o môže by spôsobené tým, že v roztoku je zdanlivo väšia koncentrácia STE, ako vo škvrne (na povrchu sorbenta) po termickej úprave. Termická úprava spôsobuje posun absorbancie smerom k vyšším vlnovým džkam - krivka B na Obrázku 17. Príinou posunu môže by tvorba väzby medzi karbonylovou skupinou v STE a NH 2 skupinou v chemicky viazanej fáze. Reakcia môže prebehnú vaka termickému opracovaniu a odpareniu rozpúšadla. Prítomnos rozpúšadla môže ma negatívny dopad na priebeh reakcie medzi karbonylovou skupinou konjugovaného systému a NH 2 skupinou v chemicky viazanej fáze na pevnom povrchu silikagélu. Dôkaz tejto úvahy je úloha pre budúce výskumné experimentálne projekty. Fluorescenciu sme mohli pozorova len po termickej úprave (krivka C). Z vyššie testovaných derivatizaných inidiel najlepšie výsledky sme získali derivatizáciou bez reakného inidla. Nevyhnutnosou je použi na separáciu HPTLC techniku s NH 2 chemicky viazanou fázou s následnou termickou úpravou. HPTLC má výhodu v malej spotrebe rozpúšadiel. Druhou možnosou je použitie sprejovania tenkovrstvovej dosky s roztokom bu AlCl 3 alebo s iónmi Zr +4. Opísaný postup je dos prácny a je potrebné dáva väší pozor na ochranu personálu. Nepodarilo sa nám nájs derivatizané inidlo, ktoré by sa dalo použi na predkolónovú derivatizáciu STE. Zamerali sme sa na separáciu extraktov pomocou HPTLC. 66

67 VI Výsledky a diskusie 0, )('%'2(-;7'(% 2(*+8%-- %&!$+(# Jediná metóda, pomocou ktorej je možné stanovi obsah STE na hladine µg/kg (alebo blízko nej), je postup opísaný v [189]. V procese spracovania vzorky touto metódou je nevyhnutné používa chlórované rozpúšadlá. Vzhadom na negatívny vplyv týchto rozpúšadiel na životné prostredie je dôležité ich nahradi inými postupmi. o sa týka zakoncentrovania a istenia extraktov pre stanovenie STE nemôžeme využi princíp imunoafinitných interakcií, nakoko vhodné imunoafinitné materiály nie sú komerne dostupné. Preto bude nevyhnutné použi iné možnosti istenia vzoriek. Na spracovanie extraktov STE sme použili extrakciu na pevnej fáze. STE radíme ku kontaminantom, ktorý môže by prítomný v cereáliách a ryži. Cereálne produkty (chipsy na cereálnom základe) a ryžu sme použili ako základné matrice, pre ktoré sme navrhli metódu na stanovenie STE. Metódu sme optimalizovali na cereáliách (rôzne cereálne lupienky) a následne sme postup použili aj pre ryžu. Pri aplikácií navrhnutého postupu na ryžu nebolo potrebné robi žiadne modifikácie alebo dodatonú optimalizáciu v celom extraknom procese. Zásadný problém všetkých analytických metód je dostupnos blank vzorky. Daný pojem oznauje vzorku matricu, pre ktorú navrhujeme analytický postup ktorá neobsahuje (z pohadu hodnoty požadovaného detekného limitu) analyt. Blank vzorka môže obsahova sledovaný analyt, ale jeho obsah musí by nižší, ako je cielená hodnota požadovaného detekného limitu metódy. Pre analytické merania sme pripravili zásobnú vzorku: 1. Zmiešali sme cereálne produkty na celkovú hmotnos 1 kg 2. Pridali sme extrakný roztok 4 l 3. Homogenizácia celej zmesi (Ultraturax) 4. Extrakcia s ultrazvukom - 20 minút 5. Filtrácia zmesi 6. Uskladnenie filtrátu v sklených fašiach pri teplote 4 o C Získaný filtrát sme analyzovali navrhnutým postupom na prítomnos STE 6 opakovaní. Do 50 ml filtrátu sme pridali roztok STE tak, že výsledná koncentrácia bola 10 µg/l 6 opakovaní. Z celkového množstva extraktu sme získali 70 dávok po 50 ml. Extrakný roztok sme pripravili zmiešaním acetonitrilu a vody 96 : 4 (v/v). Extrakt s prídavkom STE sme premyli cez bezvodý síran sodný a rozpúšadlo odparili dosucha. Zvyšok sme rozpustil v 0,5 ml (4krát) metanolu a získali sme celkový objem zmesi 2 ml. Zmes sme preniesli do vialky a pomocou jemného prúdu dusíka sme odparili metanol. 67

68 VI Výsledky a diskusie Zvyšok sme opätovne rozpustili v 200 µl metanolu a naniesli na kondicionovanú kolónku pre extrakciu na pevnej fáze (SPE). Použili sme dva druhy kolóniek. Jedna s C18 chemicky viazanou fázou a alšia bola s fenyl chemicky viazanou fázou. Pred použitím sme kolónky kondicionovali s 3 ml metanolu a následne s 10 ml vody. Kondicionovanie je identické pre oba druhy kolóniek pre extrakciu na pevnej fáze. Použitých 200 µl extraktu sme naniesli na povrch pevného materiálu SPE kolónky. Po vsiaknutí roztoku do pórovitého materiálu kolónky sme aplikovali zmes na premytie (metanol : voda 40 : 60 (v/v)). Následne sme STE eluovali zmesou metanol : voda 60 : 40 (v/v). Zachytený extrakt sme vysušili premytím cez bezvodý síran sodný a odparili dosucha. Zvyšok sme rozpustili v metanole a preniesli do menšej banky. Po odparení metanolu s jemným prúdom dusíka sme rozpustili zvyšok v acetonitrile 200 µl a naniesli na HPTLC dosku. V prípade použitia C18 chemicky viazanej fázy v SPE kolónkach po spracovaní HPTLC dosiek sme nezistili prítomnos STE. Pri použití fenyl chemicky viazaných fáz v SPE kolónkach sme už bez problémov identifikovali fluorescenné škvrny zodpovedajúce STE vo všetkých šiestich opakovaniach. Na zakoncentrovanie a preistenie extraktu STE je potrebné použi fenyl chemicky viazanú fázu pre SPE. Po príprave extrakného postupu s použitím zásobného roztoku blank extraktu sme analyzovali samotné vzorky cereálií. Zo zásobnej vzorky cereálnych produktov sme odvážili po 25 g do sklených fliaš. Do 6 vzoriek sme pridali roztok STE tak aby výsledný obsah bol 10 µg/kg. Vzorky s prídavkom STE sme nechali stá pri laboratórnej teplote cez noc. Spracovanie vzoriek cereálií (25 g) sme zaali s prídavkom 100 ml extraknej zmesi acetonitril : voda 96 : 4 (v/v), zhomogenizovali Ultraturaxom a prefiltrovali. Z filtrátu sme odobrali alikvótnu as 50 ml. alej sme aplikovali identické kroky ako boli opísané vyššie. Uvedený postup sme použili aj pre analýzu ryže s prídavkom STE. Týmto postupom sme získali faktor zakoncentrovania !'%'2(-;7'(% 2(*+ Experimentálne výsledky opísané v predchádzajúcich kapitolách jasne definujú výber závereného kroku pri stanovení STE HPTLC separácia na NH 2 chemicky viazanej fáze. Dôležitý je výber vhodnej fázy na vývoj a separáciu STE od sprievodných koextraktov. Dá sa oakáva, že vzhadom na to, že sme museli použi len SPE na fenyl chemicky viazanej fáze, množstvo koextraktov bude zrejme vyššie, ako je to v prípade stanovenia OTA alebo 68

69 VI Výsledky a diskusie fumonizínov, ke sme použili imunoafinitné extrakné kolónky. Naviac navrhnuté vyvíjacie zmesné systémy by mali vyhovova pre obe vybrané komodity cereálie a ryžu. Elúciu vzoriek sme robili zmesou toluén : acetón, 95 : 5 (v/v), ktorá poskytovala vhodnú elúciu STE pri predchádzajúcich experimentoch a získali sme s ou aj reprodukovatené výsledky pri testoch navrhnutých extrakných postupov. 03 #'(:%'2(-;7'(% 2(*+ Na zostrojenie kalibranej iary pre STE sme použili 6 rôznych úrovní obsahu STE v 3 opakovaniach. Pre každú koncentráciu sme nanášali 10 µl. Získané výsledky sú na Obrázku y = 2,4135x + 10,946 R 2 = 0,9817 Fluorescencia Opakovanie1 Opakovanie 2 Opakovanie koncentrácia ug/kg Obrázok 18. Kalibraná iara pre sterigmatocystín. Pri HPTLC meraniach je nevyhnutné ma k dispozícii kalibranú iaru rovnako ako pre prípad HPLC. Rozdielne HPTLC dosky je potrebné vníma ako rozdielne kolóny v prípade kvapalinovej chromatografie. Preto, ak meníme kolónu v HPLC, tak musíme znova zopakova kalibráciu pre analyt, ktorý chceme s ou stanovi. Z toho dôvodu je nevyhnutné na každej HPTLC doske ma nanesené aj najmenej tri rôzne koncentrácie štandardu STE. Porovnáva môžeme len škvrny získané na jednej HPTLC doske. Nie je možné porovnáva škvrny z dvoch rôznych HPTLC dosiek. Potrebujeme zostroji kalibranú iaru pre každú HPTLC dosku a sledova, do akej miery si zachováva požadovanú linearitu. Ak zistíme problém s linearitou získaných bodov, tak musíme použi novú HPTLC dosku. 69

70 VI Výsledky a diskusie Opakovatenos meraní sme overili pomocou prídavku štandardu STE do vzoriek cereálií a ryže na hladine 10 µg/kg. Na stanovenie STE sme použili vyššie opísaný extrakný postup. Pripravili sme 10 vzoriek s prídavkom STE. Výsledky meraní sú v Tabuke 12. Tabuka 12. Vybrané metrologické parametre stanovenia sterigmatocystínu. íslo Prídavok Sterigmatocystínu [µg/kg] Nameraný obsah Nameraný obsah Cereálie [µg/kg] Ryža [µg/kg] Priemerná hodnota [µg/kg] Výažnos % Štandardná odchylka s x [µg/kg] 0, Limit detekcie [µg/kg] Limit stanovenia [µg/kg] Navrhnutá metóda stanovenia STE v cereáliách a v ryži poskytuje porovnatené detekné limity, ako v prípade metódy s použitím detekcie na základe hmotnostnej spektroskopie. HPTLC dosky umožujú redukciu použitých rozpúšadiel. Naviac v proces spracovania vzorky extrakcia a istenie extraktu pomocou fenyl chemicky viazanej fázy umožuje elimináciu chlórovaných rozpúšadiel. Ilustraný chromatografický záznam získaný pomocou HPTLC vzorky cereálií s prídavkom STE na hladine 10 µg/kg je na Obrázku

71 VI Výsledky a diskusie Obrázok 19. Ilustraný záznam HPTLC chromatogramu. F fluorescencia. A vzorka cereálií s prídavkom sterigmatocystínu (10 µg/kg) B vzorka cereálií bez sterigmatocystínu (blank) Metóda na stanovenie STE je v Prílohe. 4. ' Vybrané sorbenty (kapitola V 5) sme rozdelili do 4 základných skupín na základe ich chemickej stavby. a.) sorbenty na báze minerálnych látok a minerálnych polymérov b.) sorbenty na báze organických polymérov c.) sorbenty so špecifickými aktívnymi centrami naviazanými na povrch d.) sorbenty používané v pivovaroch Sorbenty používané v pivovaroch z chemického hadiska môžeme prileni k silikagélom. Za poskytnuté vzorky patrí naša vaka pivovaru Stein v Bratislave. Pre štúdium interakcií vybraných mykotoxínov s pevnými materiálmi je potrebné zaa s jednotlivými modelovými roztokmi OTA a fumonizínov. Z toho dôvodu sme sa rozhodli o najviac zjednoduši testovaný systém. Pre posúdenie len interakcií mykotoxínov (fumonizíny a OTA) s pevnými materiálmi potrebujeme eliminova potenciálne konkurenné zlúeniny, ktoré sa zrejme môžu vyskytova v samotnej testovanej matrici piva. Na zaiatku sme chceli posúdi dominantné interakcie len medzi mykotoxínmi a pevnými povrchmi. Základnými majoritnými zložkami piva sú voda a etanol. Ostatné chemické zlúeniny sú v minoritnom 71

72 VI Výsledky a diskusie zastúpení i ke zo senzorického hadiska práve tieto majú urujúci vplyv na kvalitu a chu piva. Vzhadom na vlastnosti piva a vybraných mykotoxínov sme za rozpúšadlo mykotoxínov zvolili zmes voda : etanol (95 : 5, v/v ) v pomere charakteristickom pre pivo. Koncentráciu mykotoxínov sme zvolili na hladine: fumonizín B 1 0,628 mg/l; fumonizín B 2 0,628 mg/l; ochratoxín A 0,5 mg/l. Pred samotným meraním so sorbentami sme zistili, aká je sorpcia mykotoxínov na samotnom pomocnom materiáli plastovom tele kolóniek a plastových fritách. Plastové asti vôbec neovplyvovali sorpciu mykotoxínov, o sme potvrdili ich nezmenenou koncentráciou v použitom roztoku. Zvolený modelový systém bol zložený z plastových striekaiek, plastových fritiek, sorbentu a roztoku mykotoxínov v zmesi voda/etanol. Presne odvážené množstvo sorbentu sme nasypali do prázdnych plastových kolóniek. Objem roztoku mykotoxínov bol v každom prípade 3 ml. Robili sme merania aj s kondicionovaným sorbentom. Na kondicionovanie sorbentu sme použili zmes voda/etanol v pomere 95/5 v/v. Vzhadom na meniaci sa stupe napuania eventuálne solvatácie sorbentu - nebolo možné použi tento postup. Týmto spôsobom sme získali skreslené výsledky. Vzájomné porovnanie sorbentov nakoniec nebolo možné objektívne posúdi. V technologickom procese výroby piva sa sorbenty pridávajú do závereného istiaceho procesu na írenie piva. Našim cieom bolo simulova tento proces a preto sme použili opísané technické riešenie. Výhodou bola aj jednoduchá realizácia experimentov zameraných na testovanie vplyvu magnetického poa na interakcie mykotoxínov s pevným materiálom. Cievka bez jadra bola vhodným zdrojom homogénneho magnetického poa. Priemer vnútorného otvoru cievky sme volili tak, aby bol vhodný práve pre telo striekaky, v ktorom bol sorbent. Merania sa vždy viacnásobne opakovali, aby sme sa presvedili o reprodukovatenosti získaných výsledkov. Experimentálne práce sme vykonávali vždy za rovnakých podmienok. Cieom bolo maximálne eliminova zdroje chýb a pomocou opakovatenosti získa celkový obraz o náhodných chybách. Pripravili sme zásobný roztok mykotoxínov. Vždy sme pracovali s roztokom len jedného mykotoxínu. Celkový objem sme odhadli tak, aby sme s týmto roztokom vykonali všetky opakované experimenty na vybranej skupine sorbentov: - bez magnetického poa - s homogénnym asovo premenným magnetickým poom - s homogénnym asovo stabilným magnetickým poom Experimentálne sme stanovili obsah mykotoxínu v modelovom základnom roztoku, ako aj v roztoku, ktorý sme zachytili po premytí sorbentu. Z rozdielov v koncentráciách sme stanovili množstvo zachyteného mykotoxínu na gram použitého sorbentu. V prípade úplnej 72

73 VI Výsledky a diskusie eliminácie mykotoxínu (obsah mykotoxínu v roztoku, ktorý sme získali po premytí sorbentu bol pod detekným limitom) sme oznaili kapacitu sorbentu hodnotou 5 µg/g sorbentu. V literatúre je táto hodnota udávaná pre sorbenty s vysokou efektivitou záchytu. Stanovi reálnu maximálnu hodnotu pre sledované mykotoxíny sme nepokladali ešte za potrebné vzhadom na rozhodujúce experimenty s pivom, ktoré sme vykonali následne. Experiment sme zvolili tak, aby sme sa o najviac priblížili k podmienkam, ktoré sa používajú v technologickom procese výroby piva. V procese írenia piva sa používajú sorbenty zaradené do štvrtej skupiny sorbentov, ktoré sme opísali na strane 84. Roztok mykotoxínov prechádza vrstvou sorbenta. Hnacou silou bola gravitácia eventuálne vákuum vytvorené pomocou zariadenia pre SPE. V obmedzenom rozsahu sme spravili aj statický experiment. V tomto prípade sme v sklenej vialke pripravili zmes roztoku mykotoxínu v zmesi voda/etanol v pomere 95/5 (v/v) a dôkladne ju pretrepali. V definovaných asových intervaloch (Obrázok 20) sme odoberali malé množstvá roztoku a stanovili sme v om obsah mykotoxínu. Uvedený postup sme robili s cieom overi si možnos maximálnej redukcie obsahu mykotoxínov pomocou sorbentu (eliminácia hydrodynamiky, predženie asu kontaktu sorbentu s roztokom mykotoxínu). Stacionárne podmienky sme volili len vo výrazne obmedzenom množstve, nakoko nepredpokladáme možnos zaradenia takéhoto kroku do technologického procesu výroby piva. Podstatne väšiu pravdepodobnos predstavuje využitie sorbentov v dynamickom procese, ako sa používa pri výrobe piva. V prípade statických experimentov nie je možné použi externé magnetické pole. Výsledky merania modelových statických experimentov sme robili pre OTA a sú na Obrázku

74 VI Výsledky a diskusie C (µg/ml) as (minúta) Obrázok 20. Sorpcia OTA na silikagél. Príklad výsledku stacionárneho experimentu sorpcie OTA na sorbente poukazuje na relatívne dlhý as (cca 5 minút), kým obsah mykotoxínu výrazne klesne. Poiatoná koncentrácia OTA bola pri statickom experimente 7,5 µg/ml. Hnacou silou bude pravdepodobne rozdiel chemických potenciálov na povrchu sorbentu a v roztoku OTA. Dynamicky postavený experiment prietok cez vrstvu sorbentu zabezpeí lepší kontakt molekúl OTA z roztoku s pevným povrchom. Preto prídavok sorbentu ureného na elimináciu mykotoxínov je potrebné robi v hydrodynamickom kroku írenia piva a nie pridaním sorbentu do celkovej hmoty piva pri jeho zretí alebo státí v tankoch. 3 $2!%'87$-#4%&87-2* )/ (!!+%++ +' "-%"4 4 %5 %" Modelové merania sme robili na vybraných sorbentoch: 1. AL 2 O 3 - Alumina neutrálna 2. AL 2 O 3 - Alumina zásaditá 3. AL 2 O 3 - Alumina kyslá 4. Ambesorb (uhlík) 74

75 VI Výsledky a diskusie 5. Florisil Standard (silikagél) 6. Silikagél Merck 7. Silikagél Davisil Rozhodli sme sa nepouži žiaden zeolit. V literatúre sú opísané experimenty zamerané na hodnotenie interakcií ochratoxínu A so zeolitmi. Nedosiahli sa priaznivé výsledky. Zeolity boli úspešne použité len v prípade aflatoxínov. V prípade ochratoxínu sa ako efektívny sorbent preukázal uhlík. Z uvedeného dôvodu sme tento sorbent zaradili aj do testovanej skupiny materiálov. Výsledky testovania prvej skupiny sorbentov sú na obrázkoch Sledovali sme každý mykotoxín oddelene. 6 Sorpná kapacita ug/g bez MP MP -sp MP - jp 0 oxid hlinitý, zásaditý oxid hlinitý, neut. oxid hlinitý,kys. florisil silikagél Sorbenty silikagél, Davisil MTO- Ambesorb Obrázok 21. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 1 bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli 75

76 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita µg/g bez MP MP -sp MP - jp 0 oxid hlinitý, zásaditý oxid hlinitý, neut. oxid hlinitý,kys. florisil silikagél Sorbenty silikagél, Davisil MTO- Ambesorb Obrázok 22. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 2 bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli Z obrázkov 21 a 22 je zrejmé, že najefektívnejším sorbentom pre fumonizíny je AL 2 O 3 - alumina neutrálna a kyslá. Príinou môže by interakcia NH 2 skupiny s kyslým a neutrálnym povrchom AL 2 O 3 aluminy. Dusík v primárnom amíne v dôsledku prítomnosti voného elektrónového páru má tendenciu vytvára väzby s protónmi. Zásaditá AL 2 O 3 alumina má vemi nízku sorpnú kapacitu v porovnaní s neutrálnou a kyslou. Pozorovaný jav môže by dôsledkom tvorby solí fumonizínov so zásaditou AL 2 O 3 aluminou. Fumonizíny v ionizovanej forme sme mohli ahko vymy zo stpca zásaditej AL 2 O 3 aluminy. Ionizácia karboxylových skupín je vysoko pravdepodobná pri interakcii v zásaditom prostredí indukovaným zásaditou AL 2 O 3 - aluminou. Z pohadu sorpcie na pevnom povrchu na druhom mieste je uhlík. V prípade AL 2 O 3 - aluminy je vplyv magnetického poa zanedbatený. Uritý efekt je možné pozorova v prípade Ambesorbu, sorbentu na báze uhlíka. Výrazný vplyv má magnetické pole v prípade použitia florisilu. Predovšetkým homogénne magnetické pole zvyšuje sorpciu fumonizínu B 2 na viac ako dvojnásobok. V prípade silikagélu od firmy Merck je tento efekt ešte výraznejší. Treba si však všimnú malý až negatívny vplyv magnetického poa na sorpciu fumonizínu B 1. Dôležité je zistenie, že oba fumonizíny sa efektívne sorbujú AL 2 O 3 - aluminou neutrálnou a kyslou a vcelku zaujímavá je sorpná kapacita sorbentu na báze uhlíka. 76

77 VI Výsledky a diskusie Molekulová štruktúra ochratoxínu A je diametrálne odlišná od fumonizínov. Nie sú v nej prítomné 4 karboxylové skupiny, ale je tam prítomný sekundárny amín. Správanie sa sekundárneho amínu bude do znanej miery podobné efektu primárneho amínu u fumonizínov. Znanú sorpciu OTA v AL 2 O 3 alumine neutrálnej a kyslej môžeme vysvetli rovnako ako u fumonizínov. Aj preto z danej skupiny sorbentov je opä najefektívnejšia AL 2 O 3 - alumina neutrálna a kyslá, alším zaujímavým sorbentom je aj uhlík obrázok 23. V prípade uhlíka získaný výsledok potvrdzuje už v literatúre publikované údaje vzhadom na ochratoxín A. 6 Sorpná kapacita µg/g bez MP MP -sp MP - jp Oxid hlinitý, zásaditý Oxid hlinitý, neutral. Oxid hlinitý, kyslý Florisil Silikagél Sorbenty Silikagél, Davisil MTO- Ambesorb Obrázok 23. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre ochratoxín A bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli Všetky tri obrázky jednoznane dokumentujú vplyv magnetického poa na sorpciu fumonizínov a ochratoxínu A. V prípade silikagélov od firmy Merck a silikagélu Davisil dochádza k uritej nezanedbatenej sorpcii OTA len vaka použitiu magnetického poa. Evidentný pozitívny vplyv je zrejmý aj v prípade uhlíkového sorbentu Ambesorb. Tu dochádza k zvýšenej sorpcii od 2,92 µg/g bez použitia magnetického poa, k hodnote 3,32 µg/g s použitím asovo premenlivého homogénneho magnetického poa a až po hodnotu 3,56 µg/g v prípade homogénneho asovo stabilného magnetického poa. Aplikáciou 77

78 VI Výsledky a diskusie homogénneho asovo stabilného magnetického poa dochádza k zvýšeniu sorpcie o takmer 22 % v porovnaní s experimentmi bez magnetického poa. )/ (!!+%5' "-%"4 4 %5% " Za reprezentané modelové materiály sme vybrali nasledovné sorbenty: 1. Dovex Optipore - styrén divinylbenzén 2. Amberlite XAD -4 - styrén divinylbenzén 3. Supelco Sepabeads - styrén divinylbenzén 4. Supelco Combigel - polystyrén 5. Lipofílný Sephadex zosietený dextrán 6. Cell 1- Celulóza 1 7. Cell 2 - Celulóza 2 Celulóza 1 je sorbent vyrobený poda AO Sorbent je zložený z celulózových guôok s dutinou vo vnútri. Celulóza 2 je sorbent na báze celulózy pripravený poda AO Sú to celulózové guôky pripravené z xantogenátu celulózy regeneráciou pomocou peroxidu vodíka. Pre oba celulózové materiály je charakteristickým znakom pomerne vysoký obsah peroxidových skupín naviazaných na polysacharidický reazec. Pri experimentálnych meraniach sme postupovali tak, ako v prípade uvedenom vyššie. Pre fumonizíny B 1 a B 2 sme získali výsledky uvedené na obrázkoch íslo 24 a

79 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita µg/g bez MP MP -sp MP - jp 0 dovex Optipore amberlite XAD - 4 Supelco -sepabeads Supelco -combigel lippholic Sephadex Sorbenty cell 1 cell 2 Obrázok 24. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 1 bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli 79

80 VI Výsledky a diskusie 6 Sorpná kapacita µg/g bez MP MP -sp MP - jp dovex Optipore amberlite XAD - 4 Supelco -sepabeads Supelco -combigel lippholic Sephadex Sorbenty cell 1 cell 2 Obrázok 25. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 2 bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli Pre oba fumonizíny je najefektívnejším sorbentom celulóza Cell 1. Porovnatenú sorpnú kapacitu má aj Supelco Combigel v prípade využitia homogénneho asovo stabilného magnetického poa. Evidentný výrazne pozitívny je vplyv magnetického poa v prípade použitia lipofílneho Sephadexu ako aj Dovexu Optipore. Zaujímavý výrazne negatívny je vplyv magnetického poa v prípade použitia materiálu Cell 2, t.j. guôkovej celulózy s naviazanými peroxidovými skupinami ako pri Cell 1, ale bez dutiny. Pri použití magnetického poa dochádza k viac ako 60 % zníženiu sorpcie predovšetkým v prípade homogénneho asovo premenlivého magnetického poa. Na Obrázku 26 sú výsledky sorpcie OTA pre tú istú skupinu sorbentov. 80

81 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita µg/g bez MP MP -sp MP - jp Dovex Optipore Amberlite XAD - 4 Supelco-Sephabeads Supelco-Combigel Lipophilic Sephadex Sorbenty Cell 1 Cell 2 Obrázok 26. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre ochratoxín A bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli V prípade ochratoxínu A je tiež najefektívnejším sorbentom Cell 1. Tento sorbent sa však prejavuje ako úplne nevhodný pri použití homogénneho asovo stabilného magnetického poa. V prípade ostatných sorbentov má homogénne magnetické pole, i už asovo stabilné alebo asovo premenlivé, skôr negatívny úinok, t.j. znižuje sa sorpná kapacita testovaných materiálov. V zásade sa dá konštatova, že pre vybranú skupinu organických polymérov je najvhodnejší systém bez pôsobenia magnetického poa. )/ ( 6-55 " %5 "-%"4 4 %5% " Túto skupinu sorbentov reprezentujú nasledovné materiály: 1. Oktyl - silikagél 2. Oktadecyl - silikagél 3. 3-chloropropyl silikagél 4. Separon SGX CN (silikagél s naviazanými kyanidovými skupinami) 81

82 VI Výsledky a diskusie 5. 3-aminopropyl silikagél Vo všetkých piatich prípadoch bol základným materiálom silikagél, ktorého povrch je modifikovaný rôznymi skupinami. V prípade fumonizínov sa dalo predpoklada, že vemi efektívne by boli sorbované na silne anión výmenné skupiny. Úmyselne sme nepoužili takýto typ sorbentov, nakoko tento materiál viaže aj iné anióny, ktoré sú významné pre senzorickú hodnotu piva. Silné aniónvýmenné sorbenty iastone blokujú aj sacharidy. Preto takýto druh materiálu by bol nepoužitený pre minimalizáciu mykotoxínov v pive. Z literatúry je známe, že pred obdobím komernej dostupnosti imunoafinitných kolóniek na spracovanie vzoriek sa silné anión výmenné iónexy využívali práve pri stanovení obsahu fumonizínov. Získané výsledky pre fumonizíny sú zdokumentované na obrázkoch 27 a Sorpná kapacita µg/g bez MP MP -sp MP - jp Octyl - silica octadecyl - silica 3 - chloropropyl-silica separon SGX - CN Sorbenty Obrázok 27. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 1 bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli 82

83 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita ug/g bez MP MP - sp MP - jp Octyl - silica octadecyl - silica 3 - chloropropyl-silica separon SGX - CN Sorbent Obrázok 28. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 2 bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli V týchto experimentoch sme nemohli použi sorbent s naviazanými amíno-propylovými skupinami, nakoko poas kontaktu našej testovacej zmesi s povrchom sorbentu dochádzalo k iastonej hydrolýze amino-propylových skupín, o sa prejavilo v problémoch pri stanovení obsahu fumonizínov. Bolo by nevyhnutné použi imunoafinitné kolónky na preistenie získaného extraktu. Uvedený postup sme použili až v prípade experimentov s pivom. Získané výsledky poukazujú na fakt, že najvýhodnejší je silikagél s naviazanými okdadecylovými skupinami na povrchu sorbenta. Podobný efekt sme získali aj v prípade použitia oktylových skupín naviazaných na povrch alebo aj kyanidových skupín. V posledných dvoch prípadoch je výhodné využi aj asovo stabilné homogénne magnetické pole. Tým sa dostane sorpná kapacita na limitnú hodnotu alebo môžeme poveda, že v zmesi, ktorá prešla cez vrstvu týchto sorbentov, nebolo možné detegova fumonizíny. Výsledky získané pre ochratoxín A sú uvedené na obrázku

84 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita pre OTA Sorpná kapacita µg/g Octyl - silica Octadecyl - silica 3 - chloropropyl-silica Separon SGX - CN Sorbenty 3 - aminopropyl-silica bez MP MP -sp MP - jp Obrázok 29. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre ochratoxín A bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli V prípade ochratoxínu A slabá sorpcia je zrejmá len pre sorbent s oktylovou skupinou naviazanou na povrchu silikagélu. Druhý prípad zníženej sorpcie je zrejmý pri pôsobení homogénneho asovo stabilného magnetického poa. Tento negatívny efekt je spoloný pre celú skupinu vybraných sorbentov. Na druhej strane homogénne asovo premenlivé magnetické pole sa v tomto prípade prejavovalo pozitívne. Pre všetky sledované mykotoxíny ako efektívny sorbent sa javí silikagél s naviazanými oktadecylovými skupinami a kyanidovými skupinami. Efekt je možné posilni pôsobením asovo premenlivého homogénneho magnetického poa. )// "! Z pivovaru Stein sme získali nasledovnú skupinu sorbentov, ktoré sa v súasnosti v najväšej miere používajú v technologickom procese výroby piva: 1. Perlit Horbolit 2. Celit Filter cel 3. Standard C Supercel 4. Celit Hyflosupercel 84

85 VI Výsledky a diskusie Vo všetkých prípadoch ide o modifikovaný silikagél. Sorpná kapacita týchto sorbentov pre fumonizíny je dokumentovaná na obrázkoch 30 a 31. 3,5 Sorpná kapacita ug/g 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 bez MP MP - sp MP - jp Perlite harbolite Celite filter - cel Standard C super - cel Sorbenty Celite hyflo super - cel Obrázok 30. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 1 bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli Pre fumonizín B 1 sme pozorovali výraznejšiu sorpnú kapacitu len vaka použitiu homogénneho magnetického poa v prípade sorbentov Perlit a Celit. Len sorbent Standard C mal sorpnú kapacitu relatívne nezávislú od použitia magnetického poa. V porovnaní s modelovými sorbentami na báze silikagélu (Obrázok 21-23) bol evidentný rozdiel predovšetkým v prípade použitia magnetického poa. U jednotlivých pivovarníckych sorbentov magnetické pole malo výrazný vplyv na sorpnú kapacitu týchto materiálov voi fumonizínu B 1. 85

86 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita ug/g bez MP MP - sp MP - jp Perlite harbolite Celite filter - cel Standard C super - cel Sorbenty Celite hyflo super - cel Obrázok 31. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 2 bez magnetického poa a v magnetickom poli. Bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli Pre fumonizín B 2 sme dosiahli výsledky porovnatené s výsledkami pre fumonizín B 1. Aj v tomto prípade bolo dôležité použitie magnetického poa. Bez neho bola sorpná kapacita pivovarníckych sorbentov zanedbatená. Na Obrázku 32 sú prezentované výsledky získané pre OTA. 86

87 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita ug/g 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Perlite harbolite Celite filter - cel Standard C super - cel Sorbenty Celite hyflo super - cel bez MP MP - sp MP - jp Obrázok 32. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre ochratoxín A bez magnetického poa a v magnetickom poli. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli V prípade ochratoxínu A malo pôsobenie magnetického poa práve opaný efekt, ako bolo tomu pri fumonizínoch. Magnetické pole znižovalo sorpnú kapacitu pivovarníckych sorbentov voi ochratoxínu A. Vplyv homogénneho asovo stabilného magnetického poa výraznejšie znižoval sorpnú kapacitu v porovnaní s použitím homogénneho magnetického poa, ktoré je asovo premenlivé. Jednoznane vysvetli vplyv magnetického poa by si vyžadovalo alšie štúdium. Pri aplikácii externého fyzikálneho poa sme mali za cie obmedzi niektoré možné konformané tvary molekúl mykotoxínov a tým zvýši (eventuálne zníži) sorpnú kapacitu sledovaných modelových sorbentov alebo pivovarníckych sorbentov. K tomuto efektu došlo a je evidentne výraznejší v prípade molekúl fumonizínov, ako pri ochratoxíne A. Predpokladáme, že molekuly fumonizínov môžu ma väšie množstvo konformaných foriem v sledovanom modelovom systéme voda/etanol, 95/5, (v/v). Pôsobením externého fyzikálneho poa dochádzalo pravdepodobne k eliminácii niektorých konformaných stavov, o sa výrazne prejavilo na sorpnej kapacite týchto látok. Efekt bol skutone pozoruhodný a preto v budúcnosti je potrebné získa poznatky pre teoretické vysvetlenie tohto javu. Dôležité bude 87

88 VI Výsledky a diskusie rozšíri množstvo experimentálnych údajov o výsledky získané pre rôzne hodnoty indukcie magnetického poa. Z testovaných sorbentov vemi dobré výsledky poskytli nasledovné materiály: 1. Alumina neutrálna 2. Alumina kyslá 3. Uhlík (MBO Ambesorb) 4. Celulóza Cell 1 (celulózové guôky s dutinou) 5. Silikagél s chemicky viazanou fázou oktadecylové alkylové skupiny 6. Silikagél s chemicky viazanou fázou kyanidové skupiny V pokraovaní riešenia predloženej práce sme sa pri testovaní reálnych vzoriek piva zamerali predovšetkým na tieto sorbenty. Získané experimentálne výsledky v modelových systémoch naznaujú reálnu šancu eliminácie sledovaných mykotoxínov z piva pod hodnotu detekných limitov navrhnutých metód. 3, )('%':+78*#'%&'()*+8#8-!#' V spolupráci so ŠVPS sme získali vzorky piva od domácich výrobcov a zistili sme v nich obsah fumonizínov a OTA. Pre experimentálne merania zamerané na posúdenie vhodnosti použitia vybraných sorbentov na elimináciu fumonizínov a OTA z piva sme použili vzorku piva s nedetekovatenou hladinou sledovaných mykotoxínov. Túto vzorku piva sme fortifikovali na hladinu 20 ppb s fumonizínmi a aj OTA. Na meranie sme použili sorbenty vybrané na základe posúdenia možnosti absorpcie z modelového roztoku mykotoxínov. K šiestim sorbentom, ktoré preukázali najlepšie výsledky sme pridali ešte aj sorbent na báze silikagélu - 3-chloropropyl silikagél. Tento sorbent sme pribrali vzhadom na pozitívne výsledky, ktoré sme dosiahli s použitím chemicky viazanými kyanidovými skupinami. S 3-chloropropyl silikagélom sme dosiahli dobré výsledky pre sorpciu OTA. Získané výsledky sú prezentované v nasledovných obrázkoch: 88

89 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita ug/g 2,5 2 1,5 1 0,5 0 bez MP/ZB/ s MP - sp/zb/ s MP - jp/zb/ oxid hlinitý, neut. MTO- Ambesorb oxid hlinitý,kys. octadecyl - silica 3 - chloropropyl-silica Sorbent separon SGX - CN Celulóza 1 Obrázok 33. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 1 bez magnetického poa a v magnetickom poli. Extrakcia zo vzoriek piva. bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli 89

90 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita ug/g 2,5 2 1,5 1 0,5 0 oxid hlinitý, neut. MTO- Ambesorb oxid hlinitý,kys. octadecyl - silica 3 - chloropropyl-silica Sorbent separon SGX - CN Celulóza 1 bez MP/ZB/ s MP - sp/zb/ s MP - jp/zb/ Obrázok 34. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre fumonizín B 2 bez magnetického poa a v magnetickom poli. Extrakcia zo vzoriek piva. Bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli 90

91 VI Výsledky a diskusie Sorpná kapacita ug/g 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 bez MP s MP -sp s MP - jp oxid hlinitý, neutral. Ambersorb oxid hlinitý, kyslý octadecyl - silica 3-chloropropyl-silica Sorbent Separon SGX-CN Cell 1 Obrázok 35. Sorpná kapacita vybraných sorbentov pre ochratoxín A bez magnetického poa a v magnetickom poli. Extrakcia zo vzoriek piva. Bez MP bez magnetického poa s MP sp v homogénnom, asovo premenlivom magnetickom poli s MP jp v homogénnom, asovo stabilnom magnetickom poli V modelových zmesiach (trojzložková zmes voda, etanol a mykotoxín) sorpná schopnos testovaných sorbentov bola iná, ako v prípade reálnej vzorky piva s prídavkom mykotoxínov. Tento efekt bol výrazný v prípade väšiny sorbentov. Tabuka 13 umožuje rýchle porovnanie efektivity záchytu jednotlivých mykotoxínov na vybraných sorbentoch. 91

92 VI Výsledky a diskusie Tabuka 13. Porovnanie efektivity eliminácie mykotoxínov z modelovej zmesi a piva. Sorbent Mykotoxín Model [%] Pivo [%] Bez MP MP sp MP jp Bez MP MP -sp MP - jp Al 2 O 3 -Alumina neutrálna OTA ,5 0,5 0 Fumonizín B ,5 Fumonizín B ,5 12,5 Al 2 O 3 -Alumina kyslá OTA ,5 2,5 0 Fumonizín B , Fumonizín B ,5 Ambesorb OTA 58,4 66,4 71,2 48,5 12,5 0 Fumonizín B 1 69,6 78,6 72,4 22,5 7,5 7 Fumonizín B 2 71,8 83,4 84,6 28, ODS Silica OTA , Fumonizín B , ,5 0,2 0 Fumonizín B ,5 9,5 7 3-chloropropyl Silica OTA ,6 40,5 45,5 0 Fumonizín B ,8 10, Fumonizín B Separon SGX CN OTA Fumonizín B Fumonizín B , Celulóza 1 OTA , Fumonizín B Fumonizín B ,5 9 Z výsledkov prezentovaných v Tabuke 13 je evidentný výrazný pokles sorpcie mykotoxínov u sorbentov bez špecifických ligandov naviazaných na ich povrchu. V modelovej zmesi bola AL 2 O 3 - alumina neutrálna a kyslá vemi efektívna voi všetkým trom mykotoxínom. V prípade piva ako základnej matrice je evidentná dramatická zmena v efektivite záchytu mykotoxínov. Bez efektu magnetického poa sorpcia klesla na hodnoty 15 a menej percent. Pre kyslú aluminu striedavé a hlavne stabilné magnetické pole malo za následok menší prepad v efektivite sorpcie v prípade fumonizínov, bol zistený prepad na 65 až 57 % v prípade asovo stabilného magnetického poa. Premenlivé magnetické pole malo pozitívny efekt na sorpciu FB 1 zvýšenie na 58 %, ale prakticky žiaden pozitívny vplyv pre FB 2 pokles na 20 %. Pri tom použitie magnetického poa malo skôr negatívny vplyv na sorpciu OTA z piva, ke bez magnetického poa sorpcia bola na hladine 15,5 až 8,5 % pre neutrálnu a kyslú aluminu. Po použití magnetického poa táto už slabá efektivita sorpcie klesla na 0,5 až 2,5 % pre neutrálnu a kyslú AL 2 O 3 - aluminu. Podobne je pozorovaný výrazný pokles sorpcie všetkých troch mykotoxínov v magnetickom poli po použití uhlíka (Ambesorb). Pokles sorpnej efektivity pod 50 % (OTA) a až na úrove 92

93 VI Výsledky a diskusie okolo 20 % (oba fumonizíny) bol pozorovaný v prípade bez pôsobenia magnetického poa. V prípade uhlíka nemalo magnetické pole pozitívny vplyv na sorpciu žiadneho zo sledovaných mykotoxínov ale práve opane, znižovalo ich sorpciu. Uhlíkový sorbent má podobné vlastnosti ako oba druhy AL 2 O 3 - aluminy. Po nahradení modelovej zmesi fumonizínov a OTA pivom s prídavkom mykotoxínov je evidentný vemi slabý záchyt mykotoxínov. Celulóza 1 a ODS Silica sa prejavovala presne identicky ako uhlík a AL 2 O 3 - alumina. Výrazný bol prepad záchytu mykotoxínov po zámene modelovej zmesi za pivo s prídavkom mykotoxínov. Prítomnos alších konkurenných látok pri premytí cez nešpecifické sorbenty (AL 2 O 3 - alumina kyslá a neutrálna, uhlík, celulóza) sa prejavilo zablokovaním aktívnych centier a pórov týchto sorbentov inými zlúeninami. Je to dané výhodnejšou energetickou hodnotou interakcie medzi nešpecifikovanými zlúeninami v pive a pevným povrchom sorbentov v porovnaní s vybranými mykotoxínmi. Uvedené pozorovanie len potvrdzuje publikované výsledky s použitím podobných sorbentov s nešpecifickými aktívnymi centrami na povrchu v prípade eliminácie OTA z rôznych matríc (61). Naznauje to, že efektívnu elimináciu mykotoxínov z piva sme mohli dosiahnu len prítomnosou vhodných aktívnych centier naviazaných na povrchu sorbenta. ODS Silica k takýmto aktívnym centrám (ligandom) nepatrí, lebo prítomnos iných zlúením v pive vytvára energetický výhodnejšie väzby s týmito ligandami ako s OTA alebo fumonizíny. Šanca na efektívnu sorpciu mykotoxínov z piva je len pre 3-chloropropyl ligandy a kyanidové skupiny naviazané na povrch sorbentov. Efektivita 3-chloropropyl ligandov pre oba fumonizíny stúpla po zámene modelovej vzorky za pivo s prídavkom mykotoxínov z 36 a 58 % na 100 % bez externého magnetického poa. Použitie magnetického poa malo invariantný efekt na FB 1, ale v prípade FB 2 klesla sorpcia pri použití asovo stabilného a asovo premenlivého magnetického poa k hodnotám 65 % v oboch prípadoch. V modelovej zmesi sme u oboch mykotoxínov pozorovali zníženie efektivity sorpcie po použití externého magnetického poa. Pre OTA sa znížila efektivita záchytu v porovnaní s modelovou zmesou zo 100 % na 40 % pri matrici pivo. V prípade aplikácie asovo premenlivého magnetického poa sa sorpcia OTA mierne zvýšila na 45 % v porovnaní so sorpciou bez externého magnetického poa. Použitie asovo stabilného externého magnetického poa má pre OTA negatívny dopad až po hodnotu 0 % záchytu. asovo stabilné externé magnetické pole malo negatívny dopad aj na efektivitu záchytu OTA z modelovej zmesi pri poklese na 62,6 %. Záchyt OTA z modelovej zmesi bez použitia externého magnetického poa a s použitím asovo premenlivého externého magnetického 93

94 VI Výsledky a diskusie poa dosahoval 100 %. Pre modelovú zmes a pivo s prídavkom mykotoxínov malo použitie asovo stabilného magnetického poa negatívny dopad. Kyanidové skupiny nemenia svoju efektivitu záchytu pri zmene modelovej zmesi za pivo s prídavkom mykotoxínov pre FB 1. V oboch prípadoch to bolo 100 %. Pre FB 2 bol evidentný pozitívny efekt externého magnetického poa i už asovo stabilného alebo asovo premenlivého záchyt 100 % z piva s prídavkom mykotoxínov. Kyanidové skupiny boli menej efektívne pre OTA. V tomto prípade z efektivity 100 % v prípade modelovej zmesi klesol na 41 % pri použití piva s prídavkom mykotoxínov bez použitia externého magnetického poa. Efektivitu záchytu OTA z piva sme zvýšili na hodnotu 52 % ak sme použili externé asovo premenlivé magnetické pole. Pri použití asovo stabilného magnetického poa záchyt OTA klesol na 0 %. Na základe získaných výsledkov merania sa dalo konštatova, že použitie sorbentov bez špecifických adsorpných centier (naviazaných ligandov) nemalo pozitívny efekt na znižovanie obsahu mykotoxínov v pive. V takomto prípade sa iné zložky preferenne sorbovali na povrchu takýchto sorbentov, i už v mikropóroch alebo pomocou absorpných síl na pevnom povrchu. Efektívny záchyt OTA a fumonizínov z piva sme dosiahli len pomocou sorbentov so špecifickými aktívnymi centrami (naviazanými ligandami na povrchu pevného sorbenta). Pre sledované mykotoxíny boli najviac vhodné aktívne centrá, ktorými sú ligandy 3-chloropropyl a kyanidové skupiny. Z týchto dvoch ligandov výhodnejšie boli kyanidové skupiny. Ich efekt eliminácie vybraných mykotoxínov bolo možné zvýši aplikáciou asovo premenlivého homogénneho magnetického poa. Za uvedených podmienok sme dokázali z piva eliminova 52 % OTA a 100 % fumonizínov B 1 a B 2. asová premenlivos magnetického poa mala obzvláš pozitívny efekt pre OTA. Použitie asovo stabilného magnetického poa malo dokonca negatívny efekt vedúci k nulovému záchytu tohto mykotoxínu. Je zrejmé že dynamické zmeny magnetického poa mali výraznejší vplyv na vymedzenie možných konformácií molekúl OTA v pive. Dôsledok tohto efektu sa prejavil v zvýšenej sorpcii OTA na sorbentoch s naviazanými kyanidovými skupinami. 94

95 VII Záver D> Mykotoxíny, sekundárne metabolity húb, predstavujú skupinu približne 5000 rôznych štrukturálne odlišných chemických zlúenín. Niektoré z nich sú využitené pre humánnu medicínu (antibiotiká penicilín) iné predstavujú opaný pól a sú zaradené k potvrdeným chemickým karcinogénom (aflatoxín B 1 ). Spolu s hubami, ktoré sú ich producentom sú neodstránitenou súasou nášho prostredia. as mykotoxínov, ktorých patogénne úinky na organizmus sú známe, sú predmetom aj potravinárskej legislatívy. Za uplatovanie potravinárskej legislatívy v rámci EU sú zodpovedné jednotlivé lenské krajiny prostredníctvom ínštitúcií na to založených. Nie je výnimkou, že aj veké obchodné reazce robia samotné kontroly obsahu mykotoxínov vo vybraných potravinárskych komoditách, ktoré distribuujú svojim zákazníkom. Pri vyhodnocovaní výsledkov meraní môžu postupova prísnejšie ako to vyplýva z potravinárskej legislatívy. Tak sa stalo producentovi piva slovenskej výroby, že sa musel stiahnu z trhu v inej krajine, nakoko produkty z iných pivovarov boli bez detegovanej prítomnosti ochratoxínu A. Uvedený fakt nás viedol k tomu, aby sme sa pokúsili preveri možnos minimalizácie obsahu ochratoxínu A a fumonizínov v pive. Náš plán sme rozdelili do šiestich krokov. 1. V prvom kroku sme sa zamerali na vypracovanie metódy na stanovenie ochratoxínu A dostatone pod hladinou prípustného legislatívneho limitu. Limit stanovenia ochratoxínu A našou navrhnutou metódou je 0,0025 µg/l o je výrazne nižšie ako je maximálny prípustný limit urený potravinovou legislatívou 10,0 µg/kg. Výrazne nižšie hodnoty stanovenia ochratoxínu A sme dosiahli vaka dôkladnému preisteniu extraktu a zakoncentrovaniu ochratoxínu A s využitím imunoafinitných interakcií. Použitie navrhnutej metódy sme overili na vzorkách pív domácej výroby. 2. Pri stanovení fumonizínov bolo našim cieom dosiahnu o najnižší detekný limit pre ich stanovenie v pive. Meranie fluorescencie umožuje posun detekcie k o najnižším hodnotám. Fumonizíny nefluoreskujú a preto sme sa venovali najskôr výberu vhodných derivatizaných inidiel. Testovali sme 4 derivatizané systémy. 3. Po vyhodnotení vlastností derivatizovaných molekúl fumonizínov sme vybrali ako najvhodnejšiu kombináciu reagentov pre možnos ich stanovenia na hladine 2,4 µg/l pre FB 1 respektívne 2,2 µg/l pre FB 2. To je výrazne nižšie ako je legislatívny limit 500,0 µg/kg. Pri stanovení fumonizínov sme nastavili separané podmienky tak, že v retennom ase fumonizínov v prípade ich nedetegovatenej hladiny nie je prítomný žiaden pík. Prítomnos malého píku v retennom ase fumonizínov v prípade blank vzoriek bol dlhodobý problém pri stanovení týchto látok. Zistili sme pravdepodobný dôvod štiepenia píkov derivatizovaných molekúl fumonizínov a následnou zmenou podmienok eliminovali tento jav. Spracovali sme 95

96 VII Záver celú metódu na stanovenie fumonizínov s akceptovatenými hodnotami pre požadované metrologické parametre. Navrhnutá analytická metóda poskytuje spoahlivé informácie o obsahu fumonizínov v pive a derivatizaný postup spolu s podmienkami separácie je možné úspešne použi aj na iné matrice. Tento fakt sme si overili v spolupráci s EU EC JRC, IRMM, Belgicko. 4. V asti našej predloženej práci zameranej na vývoj analytických metód so zameraním na o najnižší limit detekcie vybraných mykotoxínov sme sa venovali aj problematike stanovenia sterigmatocystínu. Slovensko a eská republika sú jediné dve krajiny, v ktorých je legislatívne definovaný maximálny reziduálny limit pre sterigmatocystín. Tento toxín sa ale nesleduje v rámci programu potravinového dozoru na Slovensku. Dôvodom môže by aj komplikovaný postup detekcie tohto toxínu úspešne sa využíva post kolónová derivatizácia s roztokom chloridu hlinitého, alebo aplikácia detektora na princípe hmotnostnej spektroskopie. Pri extrakcii sterigmatocystínu je potrebné použi chloroform, o je v súasnosti problém v dôsledku jeho zaradenia do skupiny látok rozkladajúcich ozónovú vrstvu našej Zeme. Rozhodli sme sa vypracova alternatívnu metódu na stanovenie sterigmatocystínu na hladine µg/kg. Požadovanú koncentranú hladinu je možné dosiahnu len s využitím fluorescencie. Sterigmatocystín má vemi nízku fluorescenciu, ktorú sme sa pokúsili zlepši derivatizáciou. Vyskúšali sme rôzne anorganické soli ako aj organické zlúeniny úspešne používané na derivatizáciu pri alkoholoch alebo karbonyloch. Tiež sme sa pokúsili o generovanie fluorescencie bez použitia reagenného inidla. Práve postup bez využitia reagenného inidla sa ukazuje ako vemi efektívny nástroj pre fluorescennú detekciu sterigmatocystínu. Vaka nešpecifickým interakciám s použitím NH 2 chemicky viazanej fázy na silikagéli v spojení s termickou úpravou sme dosiahli požadovanú fluorescenciu v molekulách sterigmatocystínu. Nie je jasné i dochádza aj k degradácii alebo len k zafixovaniu planárnej štruktúry sterigmatocystínu prostredníctvom komplexných iónov a tým k fluorescencii. Uvedený jav bude potrebné vysvetli následným štúdiom. Ideálnym zdrojom NH 2 chemicky viazanej fázy sú HPTLC dosky s uvedeným druhom sorbenta. Využili sme separanú schopnos HPTLC dosiek, ako aj následne po jednoduchej úprave generáciu fluorescencie u sterigmatocystínu. Použitie HPTLC má vekú výhodu v znížení spotreby rozpúšadiel. Pri spracovaní vzoriek na stanovenie sterigmatocystínu sme v procese extrakcie dokázali eliminova chloroform a nahradi ho extrakciou na pevnej fáze s použitím fenyl chemicky viazaných fáz. Navrhnutou metódou je možné stanovi sterigmatocystín na hladine 3,4 µg/kg (cereálie) a 1,6 µg/kg (ryža) o dáva vekú šancu pre úspešnú aplikáciu tejto metódy pri kontrole potravín. Parametre uvedenej metódy dávajú možnos zaradi sterigmatocystín do plánu kontroly potravín, vzhadom na to, že je predmetom potravinovej legislatívy na Slovensku. 96

97 VII Záver 5. V záverenej asti predloženej práce sme overovali možnos eliminácie ochratoxínu A a fumonizínov z piva. Vybrali sme skupiny sorbentov: a.) sorbenty na báze minerálnych látok a a minerálnych polymérov b.) sorbenty na báze organických polymérov c.) sorbenty so špecifickými aktívnymi centrami naviazanými na povrch d.) sorbenty používané v pivovaroch Po testoch s modelovými zmesami sme overili možnos eliminácie ochratoxínu A a fumonizínov zo vzoriek piva s prídavkom spomenutých toxínov. Pri použití modelovej zmesi sme dosiahli vemi dobré výsledky so sorbentami bez špecifických aktívnych skupín naviazaných na ich povrchu. Zaujímavé bolo použitie vzoriek piva s prídavkom mykotoxínov. V tomto prípade sa sorbenty bez nešpecifických ligandov ukázali ako nevyhovujúce. K zlepšeniu efektivity sorpcie nepomohlo ani použitie externého fyzikálneho poa. Na druhej strane sme dosiahli dobré výsledky so sorbentami so špecifickými ligandami naviazanými na pevnom povrchu sorbenta - 3-chlórpropyl alebo kyanidové skupiny. Najvýhodnejší bol sorbent s naviazanými kyanidovými skupinami, kde sme dosiahli pri použití externého asovo premenlivého magnetického poa 100 % elimináciu fumonizínov a 52 % elimináciu ochratoxínu A. Sorbenty, ktoré používajú v súasnosti pivovary pri výrobe piva nie sú tak efektívne pre znižovanie obsahu mykotoxínov v pive ako navrhnutý postup. Získané výsledky sú predmetom patentovej ochrany. 97

98 VIII Závery pre prax a alšie štúdium D>EFGG@ 1. Navrhli sme metódu, ktorú môžeme použi na stanovenie ochratoxínu A v pive. Limit detekcie je 0,00075 µg/l a limit kvantifikácie je 0,0025 µg/l. Aplikáciou navrhnutej metódy získame možnos kvantifikácie ochratoxínu A v pive výrazne pod úrovou maximálneho reziduálneho limitu 10 µg/kg. 2. Druhou vyvinutou metódou môžeme stanovi fumonizíny na hladinách 2,4 µg/l pre fumonizín FB 1 a 2,2 µg/l pre fumonizín B 2. Limit detekcie je 0,72 µg/l pre fumonizín B 1 a 0,66 µg/l pre fumonizín B 2. Separaný postup garantuje elimináciu koextraktov v ase elúcie fumonizínov. Je vhodný aj pre iné matrice ako len pivo. 3. Legislatívne požiadavky na stanovenie sterigmatocystínu urujú maximálny reziduálny limit 5 µg/kg pre požívatiny. Navrhli sme metódu na stanovenie sterigmatocystínu v dvoch komoditách, u ktorých je najväšia pravdepodobnos kontaminácie týmto toxínom. Limit kvantifikácie pre cereálie je 3,4 µg/kg a ryžu 1,6 µg/kg. Metóda nevyžaduje aplikáciu chlórovaných rozpúšadiel ani žiadne derivatizané inidlo na generovanie fluorescencie v molekulách sterigmatocystínu. HPTLC s NH 2 chemicky viazanou fázou výrazne znižuje spotrebu chemických rozpúšadiel. Metóda je vhodná pre orgány potravinového dozoru zodpovedné za uplatovanie potravinárskej legislatívy. 4. Navrhli sme postup na významnú elimináciu fumonizínov a redukciu obsahu ochratoxínu A o 52 % v pive. Uvedené výsledky sme dosiahli aplikáciou vhodného sorbenta s chemicky naviazaným ligandom CN. Jeho použitie nemalo negatívny dopad na senzorické vlastnosti piva. Naviazaný ligand je stabilný na povrchu pevného sorbenta a nedochádza k jeho vymývaniu pri prietoku piva cez vrstvu sorbenta. Pre maximálny úinok eliminácie toxínov je potrebné použi externé homogénne asovo oscilujúce magnetické pole. Adaptácia navrhnutého postupu na elimináciu toxínov z piva je technologicky ahko zvládnutená bez vekých dodatoných nákladov v súasných technologických zariadeniach na výrobu piva. 5. Použitie externého homogénneho magnetického poa má evidentný dopad na efektivitu sorpcie polárnych látok na pevných povrchoch. Opísaný jav má pozitívny vplyv na zlepšenie zdravotnej bezpenosti požívatín vaka znižovaniu obsahu mykotoxínov. Vytvorenie teoretického modelu, ktorý by charakterizoval uvedený jav, by dalo možnos pre všeobecné využitie postupov s použitím externého fyzikálneho poa. 98

99 VIII Závery pre prax a alšie štúdium 6. Interakcie niektorých molekúl (sterigmatocystín, cukry) s chemicky viazanou NH 2 skupinou na povrchu silikagélu generujú v uvedených látkach fluorescenciu. Vaka fluorescencii sa dá stanovi ich obsah na hladinách µg/kg. Zatia nie je známy mechanizmus, ktorý je v pozadí tvorby fluorescencie bez derivatizaného inidla. Je potrebné charakterizova celý proces z chemického hadiska. 99

100 IX Summary Mycotoxins considered as secondary plants metabolites represent group of around 5000 compounds with various chemical structure. Some of them are beneficiary for human medicine (antibiotics) and on the other side some are suspicion carcinogens and even confirmed carcinogen (aflatoxin B 1 ). Together with fungi which are producing them are inseparable part of our environment. Mycotoxins with known pathogenic effect on human health are subject of food legislation. Enforcement of food legislation is responsibility of each EU member state via food market surveillance institutes. Big retail chains organize self control of mycotoxins content in selected products they offer to customers. In results evaluation they can adopt stronger measures as is required by food legislation. It happened to one beer producer in Slovakia that he was forced to withdraw from one retail chain because in his product was detected ochratoxin A while in other marketed beers it was not detected. This was the idea why we have tried to study possible ways of reducing content of ochratoxin A and fumonisins in beer. In our submitted theses we have identified six steps. 1. In the first step we have focused on development method for OTA determination at the level sufficiently under the required acceptable legal limit. Limit of determination of our suggested method is 0,0025 µg/l. This is sufficiently under the prescribed legal maximal acceptable level 10,0 µg/kg. Remarkably lower level of determination of OTA was achieved due to careful cleaning of extracted OTA and preconcentration with support of immunoaffinity interactions. Application of suggested method was tested on samples of beers of national provenience. 2. The aim in fumonisins determination was also focused on the lowest possible limit of detection in beers. Fluorescence measurement allows the shift of detection to the lowest levels available. Fumonisins molecules do not fluoresce that is why we have focused on selection of the best derivatisation reagents. Four derivatisation systems were tested. 3. Based on evaluation of properties of derivatised molecules of fumonisins the best combination of reagents was selected. The level of detection was ine 2,4 µg/l and 2,2 µg/l for FB 1 and FB 2, respectively. This is sufficiently under the required legil limit 500,0 µg/k. In fumonisins determination procedure the set of separation conditions was done such a way that in case of blank samples in retention time of fumonisins there was straight line. Presence of small peak in retention time of fumonisins in blank samples was long time problem. We have identified probable source of splitting peaks of fumonisns and this phenomenon was eliminated. The method was intra-laboratory validated with acceptable values of selected metrological parameters. Suggested method offers reliable information of fumonisins content in beers and derivatisation procedure together with separation conditions 100

101 IX Summary is possible to adopt for other matrices, too. This fact was evaluated in cooperation with EU EC JRC, IRMM, Belgium. 4. In the part of submitted dissertation dedicated to methods development focused on the lowest available detection limit of selected mycotoxins we have deled also with STE. Slovakia and Czech Republic are the only two countries where is defined maximal residual legal limit for STE. The toxin is not in the monitoring program within the interest of food market surveillance in Slovakia. The reason could be complicated procedure for detection post column derivatisation with solution of aluminium chloride or application of detection based on mass spectroscopy. In extraction procedure of STE chloroform has to be used. This is problem at present time because chloroform is known ozone disruptor. We have decided to develop alternative method for sterigmatocystin determination at level around µg/kg. Required level is possible to reach with fluorescence measurements only. STE has very low natural fluorescence so we have tried to derivatise it. Various inorganic salts as well as organic compounds successfully used for derivatisation of alcohols or carbonyl groups. We have tried to adopt the reagent-free derivatisation procedure. Reagent-free procedure seems to be effective tool for fluorescence detection of STE. Thanks to non specific interactions with NH 2 chemically bonded phases on silica gel in connection with thermal treatment required fluorescence in STE molecules was achieved. It is not known if there is some degradation or just fixing of planar structure of STE resulting in fluorescence. This phenomenon will have to be studied in detail. Ideal source of NH 2 chemically bonded phase are HPTLC plates with this type of sorbent. Separation power of HPTLC was used and after simple treatment fluorescence in STE was generated. Application of HPTLC has advantage in low consumption of solvents. In sample preparation procedure the necessity of chloroform was eliminated substituting with SPE with phenyl chemically bonded phases. Suggested method is suitable for determination of STE at level 3,4 µg/kg and 1,6 µg/kg for cereals and rice, respectively. Parameters of this method give chance to adopt STE to plans of food control. 5. In the last sections of this work we have tested possibility to eliminate ochratoxin A and fumonisins from beer. We have selected groups of sorbents: a.) sorbents based on mineral substances and mineral polymers b.) sorbents based on organic polymers c.) sorbents based on specific active centres bond to solid surfaces d.) sorbents applied in breweries After completing tests with model mixtures of mycotoxins the real samples of beer spiked with ochratoxin A and fumonisins were examined. Applying model mixtures good results 101

102 IX Summary were achieved with sorbents without specific active centres bounded to the solid surfaces. Interesting was application of samples of beer spiked with mycotoxins. In this case sorbents without specific active centres failed to sorb the mycotoxins. Improvement of sorption was not met also in the case application external magnetic field. On the other side good results were achieved with specific active centres bounded to the surface of sorbents. Good results were demonstrated with application of 3-chlorpropyl or cyanide groups bounded to the surface of sorbents. The best was sorbent with cyanide groups together with application of time-oscillating homogeneous magnetic field. In this case elimination of fumonisins was 100 % and 52 % for ochratoxin A. Sorbents, at present time used in breweries in beer production are not effective in relation to reduce content of mycotoxins in beer. Received results are subject of patent protection. 102

103 X. Literatúra E 1. J. Davídek, G. Janíek,. Pokorný: Chemie potravín. SNTL, Praha, Výnos MP Sr a MZ SR z 11 septembra /2006 SL, ktorým sa vydáva hlava PK SR upravujúca kontaminanty v potravinách v znení alších zmien. 3. V. Betina: Mykotoxíny chémia biológia ekológia. Alfa, Bratislava, Bu Lock, J. D. Intermediary Metabolism and Antibiotic Synthesis. Adv. Appl. Microbiol. 1961, 3, Bennett, R. N., Wallsgrove, R. M. Tansley Review No. 72. Secondary metabolites in plant defence mechanism. New Phytology. 1994, 127, Chu, F. S. Mode of action of mycotoxins and related compounds. Adv. Appl. Microbiol. 1977, 22, Hayes, A. W. Mycotoxins: a review of biological effects and their role in human diseases. Mycopathologia. 1978, 65, Ueno, Y.Trichothecenes - chemical, biological and toxicological aspects. CRC Critical Rev. Toxicol. 1985, 14, FAO Food and Nutrition Paper 74. Safety evaluation of certain mycotoxins in food. FAO, Rím, Saenz de Rodriguez, C. A. Engl. N. Environmental hormone contamination in Puoerto Rico. J. Med. 1984, 310, Centrum európskej normalizácie Pitt, J. I. Penicillium viridicatum, Penicillium verrucosum and production of ochratoxin A. Appl. Environ. Microbiol. 1987, 53, Malagutti, L., Zannotti, M., Scampini, A., Sciaraffia, M. Effects of ochratoxin A on heavy pigs production. Animal Research. 2005, 54, Mounjouenpou, P., Gueule, D., Fontana-Tachon, A., Guyot, B., Tondje, P. R., Guiraud, J-P. Filamentous fungi producing ochratoxin A during cocoa processing in Cameroon. International J. of Food Microbiology. 2008, 121, Patterson, D. S. P., Roberts, B. A., Small, B. J. Metabolism of ochratoxin A and B in the pig during early pregnancy and the accumulation in body tissue of ochratoxin A only. Food Cosmet. Toxicol. 1976, 14, Trucksess, M. W., Giler, J., Young, K., White, K. D., Page, S. W. Determination and survey of ochratoxin A in wheat, barley and coffee. J. AOAC Int. 1997, 82,

104 X. Literatúra 17. Tsubouchi, H., Yamamoto, K., Hisada, K., Sabake, Y. A survey of occurance of mycotoxins and toxicogenic fungi in imported green coffee beans. Proc. Jpn. Assoc. Mycotox. 1984, 19, Varga, J., Kevei, F., Rinyu, E., Teren, J., Kozakiewicz, Z. Ochratoxin production by Aspergillus species. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 60, Wiger, R., Stormer, F. C. Effect of ochratoxin A and B on prechondrogenic mesenchymal cells from chick embryo limb buds. Toxicol. Lett. 1990, 54, Wurgler, E. F., Friedrich, U., Schlatter, J. Lack of mutagenicity of ochratoxin A and B, chinin, patulin, and conestine in Salmonella typhimurium TA 102. Mutat. Res. 1991, 261, Xiao, H., Madhyastha, S., Marquardt, R. R., Li, S., Vodela, J. K., Frohlich, A. A., Kemppainen, B. W. Toxicity of ochratoxin A, its opened lactone form and several of its analogs: Structure-activity relationships. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1996, 137, Kane, A., Creppy, E. E., Roschenthaler, R., Dirheim, G. Changes in urinary and renal tubular enzymes caused by subchronic administration of ochratoxin a in rats. Toxicology. 1986, 42, Elling, F. Ochratoxin A induced mycotoxic porcine nephropathy: Alterations in enzyme activity in tubular cells. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1979, 87, Krogh, P., Gyrd Hansen, N., Hald, B., Larsen, S., Nielsen, J. P., Smith, M., Ivanoff, C., Meisner, H. Renal enzyme activities in experimental ochratoxin A induced porcine nephropathy: Diagnostic potential of phosphoenolpyruvate carboxykinase and gamma-glutamyl transpeptidase activity. J. Toxicol. Environ. Health. 1988, 23, Berndt, W. O., Hayes, A. W. In vivo and in vitro changes in renal function caused by ochratoxin A in the rat. Toxicology. 1979, 12, Munro, I. C., Moodie, C. A., Kuiper-Goodman, T., Scott, P. M., Grice, H. C. Toxicologic changes in rats fed graded dietary levels of ochratoxin A. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1974, 28, Krogh, P., Elling, F. Mycotoxic nephropathy. Vet. Sci. Commun. 1977, 1, Elling, F., Nielsen, J. P., Lillehoj, E. B., Thomassen, M. S., Stormer, F. C. Ochratoxin A induced porcine nephropathy: Enzyme and ultrastructure changes after short term exposure. Toxycology. 1985, 23,

105 X. Literatúra 29. Gibson, R., Bailey, C., Kuena, L., Huff, W., Harvey, R. Impact of L- phenylalanine supplementation on the performance of three-week-old broilers fed diets containing ochratoxin A. 1. Effects on body weight, feed conversion, relative organ weight and mortality. Poult. Sci. 1990, 69, Kanisawa, M., Suzuki, S. Induction of renal and hepatic tumors in mice by ochratoxin A. Gann. 1978, 69, Dorrenhaus, A., Flieger, A., Golka, K., Schulze, H., Albrecht, M., Degen, G. H., Follmann, W. Induction of unscheduled DNA synthesis in primary human urothelial cells by the mycotoxin ochratoxin A. Toxicol. Sci. 2000, 53, Stetina, R., Votava, M. Induction of DNA single-strand breaks and DNA synthesis inhibition by patulin, ochratoxin A, citrinin and aflatoxin B 1 in cell lines CHO and AWRF. Folia Biol. 1986, 32, Dorrenhaus, A., Follmann, W. Effects of ochratoxin A on DNA repair in cultures and rat hepatocytes and porcine urinary bladder epithelial cells. Arch. Toxicol. 1997, 71, De Groene, E. M., Hassing, I. G., Blonm, M. J., Seinen, W., Fink-Gremmels, J., Horbach, G. J. Development of human cytochrome P450 expressing cell lines: Application in mutagenicity testing of ochratoxin A. Cancer Res. 1996, 56, Gautier, J. C., Richoz, J., Welti, D. H., Markovic, J., Gremaud, E., Guengerich, F. P., Turesky, R. J. Metabolism of ochratoxin A: Absence of formation of genotoxic derivatives by human and rat enzymes. Chem. Res. Toxicol. 2001, 2, Bendele, A. M., Carlton, W. W. Incidence of obstructive uropathy in male B6C3F1 mice on a 24-month carcinogenicity study and its apparent prevention by ochratoxin A. Lab. Anim. Sci. 1986, 36, Bauer, J., Gareis, M. Ochratoxin A in the food chain. Z. Veterinärmed. 1987, 34, Hagelberg, S., Hult, K., Fuchs, R. Toxicokinetics of ochratoxin A in several species and its plasma binding properties. J. Appl. Toxicol. 1989, 9, Studer-Rohr, I., Dietrich, D. R., Schlatter, J., Schlatter, C. The occurance of ochratoxin A in coffee. Food Chem. Toxicol. 1995, 33, Stoyanov, I. S., Chernozemsky, I. N., Nikolov, I. G., Stoichev, I. I., Petkova- Bocharova, T. K. Epidemiological association between endemic nephropathy and urinary system tumours in endemic region. J. Chron. Dis. 1978, 31,

106 X. Literatúra 41. Ceovic, S., Hrabar, A., Saric, M. Epidemiology of Balkan endemic nephropathy. Food Chem. Toxicol. 1992, 30, Krogh, P. Role of ochratoxin A in desease causation. Food Chem. Toxicol. 1992, 30, Pavlovic, M., Plestina, R., Krogh, P. Ochratoxin A contamination of foodstuffs in an area with Balkan (endemic) nephropathy. Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1979, 87, Hult, K., Plestina, R., Habazin-Novak, V., Radic, B., Ceovic, S. Ochratoxin A in human blood and Balkan endemic nephropathy. Arch. Toxicol., 1982, 51, Wafa, E. W., Yahya, R. S., Sobh, M. A., Eraky, I., El-Baz, M., El-Gayar, H. A. M., Betbeder, A. M., Creppy, E. E. Human ochratoxicosis and nephopathy in Egypt: A preliminary study. Hum. Exp. Toxicol. 1998, 17, Zimmerli, B., Dick, R. Determination of ochratoxin A at the ppt level in human blood serum, milk and some foodstuffs by high performance liquid chromatography with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity column cleanuop: Methodology and Swiss data. J. Chromatog. 1995, 666, Breitholtz-Emanuelsson, A., Olsen, M., Oskarsson, A., Palminger, I., Hult, K. Ochratoxin A in cow s milk and in human milk with corresponding human blood samples. J. AOAC Int. 1993, 76, Fukal, L., Reisnerová, H. Monitoring of aflatoxins and ochratoxin A in Czechoslovak human sera by immunoassay. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1990, 44, Solti, L., Salamon, F., Barna-Vetro, I., Gyongyosi, A., Szabo, E., Wolffing, A. Ochratoxin A content in human sera determioned by sensitive ELISA. J. Analyt. Toxicol. 1997, 21, Peraica, M., Domijan, A. M., Fuchs, R., Lucic, A., Radic, B. The occurance of ochratoxin A in blood in general population of Croatia. Toxicol. Lett. 1999, 110, Scott, P. M, Kanhere, S. R., Lau, B. P. Y., Lewis, D. A., Hayward, S., Ryan, J. J., Kuiper-Goodman, T. Survey of Canadian human blood plasma for ochratoxin A. Food Addit. Contam. 1998, 15, Arbillaga, L., Azqueta, A., Ezpeleta, O., de Cerain, A. L. Oxidative DNA damage induced by ochratoxín A in HK 2 human kidney cell line: evidence of the relationship with cytotoxicity. Mutagenesis. 2007, 22,

107 X. Literatúra 53. Pittet, A., Tornare, D., Hugget, A., Viani, R. Liquid chromatographic determination of ochratoxin A in pure and adultered solubile coffee using an immunoaffinity column cleanup procedure. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, Stegen, G., Jorissen, U., Pittet, A., Saccon, M., Steiner, W., Vicenzi, M., Winkler, M., Zapp, J., Schlatter, C. Screening of european coffee final products for occurance of ochratoxin A. Food Addit. Contam. 1997, 14, Ueno, Y. Residue and risk of ochratoxin A in human plasma and beverages in Japan. Mycotoxins. 1998, 47, Leoni, L. A. B., Soares, L. M. V., Oleveira, P. L. C. Ochratoxin A in Brazilian roasted and instant coffees. Food Addit. Contam. 2000, 17, Jorgensen, K., Rasmussen, G., Thorup, I. Ochratoxin A in Danish cereals and daily intake by Danish population. Food Addit. Contam. 1996, 13, Scudamore, K. A., Patel, S. Survey for aflatoxins, ochratoxin A, zearalenone and fumonisins in maize imported into United Kingdom. Food Addit. Contam. 2000, 17, Jonsyn, F. E., Maxwell, S. M., Hendrickse, R. G. Ochratoxin A and aflatoxins in breast milk samples from Sierra Leone. Mycopathologia. 1995, 131, Scott, P. M. Mycotoxins transmitted into Beer from contaminated grains during brewing. J. AOAC Int. 1996, 79, Castellari, M., Versari, A., Fabiani, A., Parpinello, G. P., Galassi, S. Removal of Ochratoxin A in red wines by means of adsorption treatments with commercial fining agents. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, Jurcevic, Z., Solfrizzo, M., Cvjetjovic, B., Avantaggiato, G., Visconti, A. Ochratoxin A and fumonisins (B1 and B2) in maize from Balkan nephropathy endemic and non endemic areas of Croatia. Mycotoxin Res. 1999, 15, Boudra, H., Barnouln, J., Dragacci, S., Morgavi, D. P. Aflatoxín M 1 a ochratoxín A in raw bulk milk from French dairy herds. J. Dairy Science. 2007, 90, Bata, A., Lasztity, R. Detoxification of mycotoxin contaminated food and feed by microorganisms. Trends Food Sci. and Technol. 1999, 10, Park, D. L. Controling aflatoxin in food and feed. Food Technol. 1993, 47, Baxter, E. D., Slaiding, I. R., Kelly, B. Behaviour of ochratoxin A in brewing. J. Amer. Soc. Brewing Chem. 2001, 59,

108 X. Literatúra 67. Hocking, A. D., Faedo, M. Fungi causing thread mould spoilage of vacuum packaged cheddar cheese during maturation. Int. J. Food Microbiol. 1992, 16, Mycotoxin Prevention and Decontamination, Tretia spoloná FAO/WHO/UNEP medzinárodná konferencia o mykotoxínoch, Tunis, Tunisko, Marec, 1999; MYC- CONF/99/6c. 69. Ciegler, A., Lillehoj, B., Peterson, H., Hall, H. Microbial detoxification of aflatoxin. Appl. Microbiol. 1966, 14, Lillehoj, E. B, Ciegler, A., Hall, H. Aflatoxin B1 uptake by Flavobacterium Aurantiacum and resulting toxic effects. J. Bacteriology 1967, 93, Line, L. E., Bracket, R. E. Role of toxin concentration and second carbon source in microbial transformation of aflatoxin B1. J. Food Protect. 1995, 58, Sweeney, M. J. W., Dobson, A. D. J. Review: mycotoxin production by Aspergillus, Fusarium and Penicillium species. Int. J. Food Microbiol. 1998, 43, Arici, M. Degradation of mycotoxins by microorganisms. Ernahrung, 1999, 23, Casteel, S. W., Rottinghouse, G. E., Mycotoxicoses. Microbiol. 2000, 3, Karlovsky, P. Biological detoxification of fungal toxins and its use in plant breeding, feed and food production. Nat. Toxins, 1999, 7, Park, D. L. Perspectives on mycotoxin decontamination procedures. Food Addit. Contam., 1993, 10, Huwig, A., Freimund, S., Kappeli, O., Dutler, H. Mycotoxin detoxication af animal feed by different adsorbents. Toxicology Leters, 2001, 122, FAO : Sampling plans for aflatoxins analysis in peanuts and corn. Dokument. 55, Rím, 3-6 Máj, Odber vzoriek pre kontrolu aflatoxínov, Smernica. 98/53/EC z 16 júla Odber vzoriek pre kontrolu ochratoxínu A, Smernica. 2002/26/EC z 13 marca Odber vzoriek pre kontrolu patulínu, Smernica. 2003/78/EC z 11 augusta Odber vzoriek pre kontrolu fusariových toxínov, SANCO/0023/2004 rev Whitaker, T. EC wokshop on sampling for mycotoxins, zborník prednášok, Brusel, 8. júl,

109 X. Literatúra 84. Jones, M. EC wokshop on sampling for mycotoxins, zborník prednášok, Brusel, 8. júl, Rosner, H., Spanjer, M. EC wokshop on sampling for mycotoxins, zborník prednášok, Brusel, 8. júl, Larsson, K., Moeller, T. Liquid chromatographic determination of ochratoxin A in barley, wheat bran and rye by the AOAC/IUPAC/NMKL method: NMKL collaborative study. J. AOAC Int. 1996, 79, AOAC metóda , AOAC Int., AOAC metóda , AOAC Int., Entwisle, A. C., Williams, A. C., Mann, P. J., Slack, P. T., Gilbert, J. Immunoaffinity column clean-up with liquid chromatography for determination of ochratoxin A in barley: collaborative study. J. AOAC Int. 2000, 83, Visconti, A., Pascale, M., Centonze. G. Determination of ochratoxin A in wine and beer by immunoaffinity column clean-up and liquid chromatograpjic analysis with fluorometric detection: collaborative study. J. AOAC Int. 2001, 84, AOAC metóda , AOAC Int., Visconti, A., Pascale, M., Centonze, G. Determination of ochratoxin A in domestic and imported beers in Italy by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography. J. Chromatog. A 2000, 888, CEN metóda pren Abbas, H. K., Boyette, R. F., Hoagland, C. D., Krick, R. E. Production of fumonisins by Fusarium moniliforme cultures isolated from jimsonweed in Mississippi. J. Phytopathol. 1992, 136, Plattner, R. D., Weisleder, D., Poling, S. M. Analytical determination of fumonisins and other metabolites produced by Fusarium moniliforme and related species on corn. Adv. Exp. Med. Biol., 1996, 392, Seo, J. A., Lee, Y. W. Natural occurrence of the C series of fumonisins in moldy corn. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65, Voss, K. A., Chamberlain, W. J, Bacon, C. W., Herbert, R. A., Walters, D. B., Norred, W. P. Subchronic feeding study of the mycotoxin fumonisin B1 in B6C3F1 mice and Fischer 344 rats. Fund. Appl. Toxicol. 1995, 24, Bondy, G., Barker, M., Mueller, R., Fernie, S. M.,. Armstrong, C. L, Hierlihy, S. L., Savard, M. E., Barker, M. G. Fumonisin B1 toxicity in male Sprague Dawley rats. Adv. Exp. Med. Biol. 1996, 392, Bondy, G., Suzuki, C. A. M, Barker, M., Fernie, S. M., Armstrong, C. L, Hierlihy, S. L., Savard, M. E., Barker, M. G. Gavage administration of fungal toxin 109

110 X. Literatúra fumonisin B1 to female Sprague Dawley rats. J. Toxicol. Environ. Health 1998, 53, Gelderblom, W. C. A., Smuts, C. M., Abel, S., Snyman, S. D., Van der Westhuizen, L., Huber, W. W., Swanevelder, S. The effect of fumonisin B1 on the levels and fatty acid composition of selected lipids in rat liver in vivo. Food Chem. Toxicol. 1997, 35, Tolleson, W. H., Dooley, K. L., Sheldon, W. G., Thurman, J. D., Bucci, T. J., Howard, P. C. The mycotoxin fumonisin induces apoptosis in cultered human cells and in livers and kidneys of rats. Adv. Exp. Med. Biol. 1996, 392, Mehta, R., Lok, E., Rowsel, P., Miller, J., Suzuki, C., Bondy, G. Glutathione S transferase placental form expression and proliferation of hepatocytes in fumonisin B1 treated male and female Sprague Dawley rats. Cancer Lett. 1998, 128, Rheeder, J. P., Marasas, W. F. O., Farina, M. P. W., Thompson, G. R., Nelson, P. E. Soil fertility factors in relation to oesophageal cancer risk areas in Transkei, South Africa. J. Cancer Prev. 1994, 3, Rheeder, J. P., Marasas, W. F. O., Thiel, P. G., Sydenham, E. W., Shephard, G. S., van Schalkwyk, D. J. Fusarium moniliforme and fumonisins in corn in relation to human esophageal cancer in Transkei. Phytopathology 1992, 82, Knasmuller, S., Bresgenm, N., Fekadu, K., Mersch-Sundermann, V., Gelderblom, W., Zohrer, E., Eck, H. Genotoxic effects of three Fusarium mycotoxins, fumonisin B1, moniliformin and vomitoxin in bacteria and primary cultures of rat hepatocytes. Mutat. Res. 1997, 391, Sheu, C. W., Rodriguez, I., Eppley, R. M., Lee, J. K. Lack of transforming activity of fumonisin B1 in BALB/3T3 A mouse embryo cells. Food Chem. Toxicol. 1996, 34, Mobio, T. A., Anane, R., Baudrimont, I., Carratu, M. R., Shier, T. W., Sabourneau, D., Dano, S. D., Ueno, Y., Creppy, E. E. Epigenic properties of Fumonisin B1 : Cell cycle arrest and DNA base modification in C6 glioma cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2000, 164, Sahu, S. C., Eppley, R. M., Page, S. W., Gray, G. C., Barton, C. N., ODonnell, M. W. Peroxidation of membrane lipids and oxidative DNA damage by fumonisin B1 in isolated rat liver nuclei. Cancer Lett. 1998, 125,

111 X. Literatúra 109. Yin, J. J., Smith, M. J., Eppley, R. M., Page, S. W., Sphon, J. A. Effects of fumonisin B1 on lipid peroxidation in membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1998, 1371, Abado-Becongne, K., Mobio, T. A., Ennamany, R., Fleurat-Lassard, F., Shier, F., Badria, W. T., Creppy, E. E. Cytotoxicity of fumonisin B1: Implication of lipid peroxidation and inhibition of protein and DNA synthesis. Arch. Toxicol. 1998, 72, Pocsfalvi, G., Ritieni, A., Randazzo, G., Dobo, A., Malorni, A. Interaction of fusarium mycotoxins, fusaproliferin and fumonisin B1 with DNA studied by electrospray ionization mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, Norred, W. P., Plattner, R. D., Vesonder, R. F., Bacon, C. W., Voss, K. A. Effects of selected secondary metabolites of Fusarium moniliforme on unscheduled synthesis of DNA by rat primary hepatocytes. Food Chem. Toxicol. 1992, 30, Tardieu, D., Bailly, J-D., Skiba, F., Metayer, J-P., Grosjean, F., Guerre, P. Chronic toxicity in turkeys. Poultry Science. 2007, 86, Makaula, N.A., Marasas, W. F. O., Venter, F. S., Badenhorst, C. J., Bradshaw, D., Swanevelder, S. Oesophageal and other cancer patterns in four selected districts of ranskei, Southern Africa: Afr. J. Health Sci. 1996, 3, Yang, C. S. Research on esophageal cancer in China: A review. Cancer Res. 1980, 40, Franceschi, S., Bidoli, E., Baron, A. E., La Vecchia, C. Maize and risk of cancer of the oral cavity, pharynx and esophagus in northeastern Italy. J. Natl. Cancer Inst. 1990, 82, Gatei, D. G., Odhiambo, P. A., Orinda, D. A. O., Muruka, F. J., Wasunna, A. Retrospective study of carcinoma of the esophagus in Kenya. Cancer Res. 1978, 38, Bassett, M. T., Chokunonga, E., Mauchaza, B., Levy, L., Ferlay, J., Parkin, D. M. Cancer in the African population of Harare, Zimbabwe, Int. J. Cancer. 1995, 63, Van Rensburg, S. J., Benade, A. S., Rose, E. F., du Plessis, J. P. Nutritional status of African population predisposed to oesophageal cancer. Nutr. Cancer. 1983, 4, Ueno, Y., Nagata, S., Tsutsumi, T., Hasega, A., Watanabe, F., Park, H., Chen, G. C., Chen, G., Yu, S. Z. Detection of microsystins, a blue green algal 111

112 X. Literatúra hepatotoxin, in drinking water sampled in Haimen and Fusui, endemic areas of primary liver cancer in China, by highly sensitive ommunoassay. Carcinogenesis. 1996, 17, Ueno, Y., Iijima, K., Wang, S. D., Sugiura, Y., Sekijima, M., Tanaka, T., Chen, C., Yu, S. Z. Fumonisins as possible contributory risk factor for primary liver cancer: A 3 year study of corn harvested in Haimen, China by HPLC and ELISA. Food Chem. Toxicol. 1997, 35, Ali, N., Yamashita, A., Yoshizawa, T. Natural co-occurrence of aflatoxins and Fusarium mycotoxins (fumonisins, deoxynivalenol, nivalenol and zearalenone) in corn from Indonesia. Food Addit. Contam. 1998, 15, Castella, G., Bragulat, M. R., Cabanes, F. J. Surveillance of fumonisins in maize based feeds and cereals from Spain. J. Agr. Food Chem. 1999, 47, Rava, E. Mycotoxins in maize products of the 1994/95 marketing season. Mycotoxin Res. 1996, 12, Rice, L. G., Ross, P. F. Methods for detection and quantification of fumonisins in corn, cereal products and animal excreta. J. Food Prot. 1994, 57, Doko, M. B., Rapior, S., Visconti, A., Schjoth, J. E. Incidence and level of fumonisin contamination in maize genotypes grown in Europe and Africa. J. Agric. Food Chem. 1995, 43, Doko, M. B., Canet, C., Brown, N., Sydenham, E. W., Mpuchane, S., Siame, B. A. Natural occurrence of fumonisins and zearalenone in cereals and cerealbased foods from eastern and southern Africa. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, Hlywka, J. J., Bullerman, L. B. Occurrence of fumonisin B1 and B2 in beer. Food Addit. Contam. 1999, 16, Odhav, B., Naicker, V. Mycotoxins in South African traditionally brewed beers. Food Addit. Contam. 2002, 19, Scott, P. M., Jeung, J. M., Lawrence, G. A., Prelusky, D. B. Evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay for analysis of beer for fumonisins. Food Addit. Contam. 1997, 14, Scott, P. M. Mycotoxins transmitted into beer from contaminated grains during brewing. J. AOAC Int., 1996, 79, Scott, P. M., Lawrencve, G. A Analysis of beer for fumonisins. J. Food Prot. 1995, 58, Smith, J. S., Thakur, R. A. Occurrence and fate of fumonisins in beef. Adv. Exp. Med. Biol. 1996, 392,

113 X. Literatúra 134. Maragos, C. M.,. Richard, J. L. Quantitation and stability of fumonisins B1 and B2 in milk. J. AOAC Int. 1994, 77, Scott, P. M., Lawrence, G. A. Stability and problems in recovery of fumonisins added to corn-based foods. J. AOAC Int. 1994, 77, Prelusky, D. B., Trenholm, H. L., Savard, M. E. Pharmacokinetic fate of c14 labelled fumonisin B1 in swine. Nat. Toxins. 1994, 2, Patel, S., Hazel, C. M., Winterton, A. G. M., Gleadle, A. E. Surveillance of fumonisins in UK maize-based foods and other cereals. Food Addit. Contam. 1997, 14, DG Health and Consumer protection, SCOOP TASK , Brusel, Canela, R., Pujol, R., Sala, N., Sanchis, V. Fate of fumonisins B1 and B2 in steeped corn kernels. Food Adit. Contam. 1996, 13, Jackson, L. S., Katta, S. K., Fingerhut, D. D., de Vries, J. W., Bullerman, L. B. Effect of baking and frying on the fumonisin B1 content of corn-based foods. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, Piniero, M. S., Miller, J., Silva, G., Musser, S. Effect of commercial processing on fumonisin concentrations of maize-based foods. Mycotoxin Res. 1999, 15, Castelo, M. M., Sumner, S. S., Bullerman, L. B. Stability of fumonisins in thermally processed corn products. J. Food Prot. 1998, 61, Katta, S. K., Jackson, L. S., Sumner, S. S., Hanna, M. A., Bullerman, L. B. Effect of temperature and screw speed on stability of fumonisin B1 in extrusioncooked corn grits. Cereal Chem. 1999, 76, Bothast, R. J., Bennett, G. A., Vancauwenberge, J. E., Richard, J. L. Fate of fumonisin B1 in natural contaminated corn during ethanol fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 1992, 58, Doko, M. B., Rapior, S., Visconti, A., Schjoth, J. E. Incidence and level of fumonisin contamination in maize genotypes grown in Europe and Africa. J. Agric. Food Chem. 1995, 43, Shelby, R. S., White, D.G., Bauske, E. M. Differential fumonisin production in maize hybrids. Plant Dis. 1994, 78, Mogensen, J. M., Nielsen, K. F., Samson, R. A., Frisvad, J. C., Thrane, U. Effect of temperature and water activity on the production of fumonisins by Asperillus niger and different fusarium species.bmc Microbiology. 2009, 9, Sreenivasa, M. Y., Maheshwar, P. K., Sanjay, K. R., Diwakar, B. T., Naidu, K. A., Janardhana, G. R. Effect of gamma irradiation on the incidence of 113

114 X. Literatúra fumonisins production by Fusarium species occuring on maize and sorghum grains. J. Of Agricultural Technology. 2009, 5, Fluka fluorescence probes, Fluka, 2001, Sigma-Aldrich, Deisenhofen Tapuhi, Y., Schmidt, D. E., Lindner, W., Karger, B. L. Dansylation of amino acids for high-performance liquid chromatography analysis. Anal. Biochem. 1981, 115, Stroka, J., Capelletti, C., Papadopoulou-Bouraoui, A., Palaroni, L., Anklam, E. Investigation of alternative reagents to 2-mercaptoethanol for the pre-column derivatization of fumonisins with o-phthaldialdehyde for HPLC analysis. J. Liq. Chromatog. Rel. Technol. 2002, 25, Scott, P. M., Lawrence, G. A. Liquid chromatographic determination of fumonisins with 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan. J. AOAC Int. 1992, 75, Schneider, E., Usleber, E., Martlbauer, E. Rapid detection of fumonisin B1 in corn-based food by competitive direct enzyme immunoassay/enzyme-linked immunofiltration assay with integrated negative control reaction. J. Agric. Food Chem. 1995, 43, Shephard, G. S. Chromatographic determination of the fumonisin mycotoxins. J. Chromatog. A. 1998, 815, Preis, R. A., Vargas, E. A. A method for determination fumonisin B1 in corn using immunoaffinity column clean-up and thin layer chromatography/densitometry. Food Addit. Contam. 2000, 17, Thompson, V. S., Maragos, C. M. Fiber-optic immunosensor for the detection of fumonisin B1. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, Mullett, W., Lai, E. P. C., Yeung, J. M. Immunoassay of fumonisins by a surface plasmon reasonance biosensor. Anal. Biochem. 1998, 258, Sydenham, E. W., Shephard, G. S., Thiel, P. G., Bird, C., Miller, B. M. Determination of fumonisins in corn: Evaluation of competitive immunoassay and HPLC techniques. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, Pestka, J. J., Azcona-Olivera, J. I., Plattner, R. D., Minervini, F., Doko, M. B., Visconti, A. Comparative assessment of fumonisin in grain-based foods by ELISA, GC-MS and HPLC. J. Food Prot. 1994, 57, Shephard, G. S., Sydenham, E. W., Thiel, P. G., Gelderblom, W. C. A. Quantitative determination of fumonisins B1 and B2 by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection. J. Liq, Chromatog. 1990, 13, Thiel, P. G., Sydenham, E. W., Shephard, G. S., van Schalkwyk, D. J. Study of the reproducibility characteristics of a liquid chromatographic method for the 114

115 X. Literatúra determination of fumonisins B1 and B2 in corn: IUPAC collaborative study. J. AOAC Int. 1993, 76, Sydenham, E. W., Shephard, G. S., Thiel, P. G. Liquid chromatographic determination of fumonisin B1, B2 and B3 in foods and feeds. J. AOAC Int. 1992, 75, AOAC Official method , AOAC Int Bennett, G. A., Richard, J. L. Liquid chromatographic method for analysis of the naphthalene dicarboaldehyde derivative of fumonisins. J. AOAC Int. 1994, 77, Rice, L. G., Ross, P. F., Dejong, J., Plattner, R. D., Coats, J. R. Evaluation of the liquid chromatographic method for the determination of fumonisins in corn, poultry feed and Fusarium culture material. J. AOAC Int. 1995, 78, Ware, G. M., Umrigar, P. P., Carman, A. S., Kuan, S. S. Evaluation of Fumonitest immunoaffinity columns. Anal. Lett. 1994, 27, Duncan, K., Kruger, S., Zabe, N., Kohn, B., Prioli, R. Improved fluorometric and chromatographic methods for the quantification of fumonisins B1, B2 and B3. J. Chromatog. A. 1998, 815, Visconti, A., Boenke, A. Final report EUR EN, Visconti, A., Solfrizzo, M., De Girolamo, A. Project SMT4-CT , Veršilovskis, A., De Saeger, S. Review Sterigmatocystín: Occurrence in foodstuffs and analytical methods An overview. Mol. Nutr. Food Res. 2010, 54, Sweeney, M. J., Dobson, A. D. W. Mini Review Molecular biology of mycotoxin biosynthesis. FEMS Microbiology Letters. 1999, 175, Maggon, K. K., Gupta, S. K., Venkitasubramanian, T. A. Biosythesis of aflatoxins. Bacteriological Reviews. 1977, 41, Delgado-Virgen, F., Guzman-de-Pena, D., Mechanism of sterigmatocystin biosynthesis regulation by ph in Aspergillus Nidulas. Brazilian J. Of Microbiology. 2009, 40, Nielsen, K. F., Gravesen, S., Nielsen, P. A., Andersen, B., Thrane, U., Frisvad, J. C. Production of mycotoxins on artificially and naturally infested buiding materials. Mycopathologia. 1999, 145, Schmidt, R., Mondani, J., Ziegenhagen, E., Dose, K. High-performance liquid chromatography of the mycotoxin sterigmatocystin and its application to the analysis of mouldy rice for sterigmatocystin. J. Of Chromatog. 1981, 207,

116 X. Literatúra 176. Mahrous, K. F., Khalil, W. K. B., Mahmoud, M. A. Assessment of toxicity and clastogenicity of sterigmatocystin in Egyptian Nile tilapia. African J. Of Biotechnol. 2006, 5, Xie, T. X., Misumi, J., Aoki, K., Zhao, W. Y., Liu, S. Y. Absence of p53- mediated G1 arrest with induction of MDM2 in sterigmatocystin-treated cells. International J. Of Oncology. 2000, 17, Nielsen, L. L., Maneval, D. C. p53 tumor suppressor gene therapy for cancer. Cancer Gene Therapy. 1998, 5, Mendoza-Rodriguez, C. A., Cerbón, M. A. p53 tumor suppressor: Mechanisms of action in cell proliferation and death. Revista de Investigación Clinica. 2001, 53, Piecková, E., Jesenská, Z. Microscopic fungi in dwellings and their health implications in humans. Ann. Agric. Environ. Med. 1999, 6, Tuomi, T., Reijula, K., Johnsson, K., Hemminki, K., Hintikka, E. L., Lindros, O., Kalso, S., Koukila-Kahkola, P., Mussalo-Rauhamma, H., Haahtela, T. Mycotoxins in crude building materials from water-damaged buildings. Applied and Environmental Microbiology. 2000, 66, Carter, R. Survey of sterigmatocystin in cheese, cereals and maize-based retail products. MAFF. Food Standards Agency. 1998, No Bokhari, F. M., Aly, M. M. Evolution of traditional means of roasting and mycotoxins contaminated coffee beans in Saudi Arabia. Advances in Biological Research. 2009, 3, Veršilovskis, A., De Saeger, S., Mikelsone, V.... World Mycotoxins J. 2008, 1, Kingston, D. G. I., Chen, P. N., Vercellotti, J. R. High-performance liquid chromatography of sterigmatocystin and other metabolites of Aspergillus versicolor. J. of Chromatog. 1976, 118, Lepom, P. Determination of sterigmatocystin in feed by high-performance liquid chromatography with column switching. J. of Chromatog. 1986, 354, Orti, D. L., Grainger, J., Ashley, D. L., Hill, R. H. Chromatographic and spectroscopic properties of hemi-acetals of aflatoxins and sterigmatocystin metabolites. J. of Chromatog. 1989, 462, Neely, F. L., Emerson, C. S. Determination of sterigmatocystin in fermentation broths by reversed-phase high-performance liquid chromatography using postcolumn fluorescence enhancement. J. of Chromatog. 1990, 523,

117 X. Literatúra 189. Scudamore, K. A., Hetmanski, M. T., Clarke, P. A., Barnes, K. A., Startin, J. S. Analytical methods for the determination of sterigmatocystin in cheese, bread and corn products using HPLC with atmospheric pressure ionization mass spectrometric detection. Food Additives and Contaminants. 1996, 13, Veršilovskis, A., Bartkevis, V., Mikelsone, V. Analytical method for determination of sterigmatocystin in grains using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with electrospray positive ionization. J. of Chromatography A. 2007, 1157, AOAC Official Method , Sterigmatocystin in barley and wheat. Thin layer chromatographic method. AOAC Subchapter 7 Sterigmatocystin Sullivan, G., Maness, D. D., Yakatan, G. J., Scholler, J. Thin-layer chromatographic separation of sterigmatocystin, 5-methoxy-sterigmatocystin and o-methylsterigmatocystin. J. of Chromatog. 1976, 116, Francis, O. J., Ware, G. M., Carman, A. S., Kirschenheuter, G. P., Kuan, S. S. J. Assoc. Off. Anal. Chemists. 1987, 70, Klaus, R., Fischer, W., Hauck, H. E. Reagent-free detection of substances on amino-modified silica gel layers thin-layer chromatography separation and detection of fruit acids. LC GC International. 1995, 8, Klaus, R., Fischer, W., Hauck, H. E. Application of thermal in situ reaction for fluorimetric detection of carbohydrates on NH 2 -Layers. Chromatographia. 1990, 29, Klaus, R., Fischer, W., Hauck, H. E. Use of new adsorbent in the separation and detection of glucose and fructose by HPTLC. Chromatographia. 1989, 28, Klaus, R., Fischer, W., Hauck, H. E. Qualitative and quantitative analysis of uric acid, creatine, and creatinine, together with carbohydrates in biological material by HPTLC. Chromatographia. 1991, 32,

118 XI. Prílohy E H *+ ZDROJ MAGNETICKÉHO POA Na prípravu zariadenia pre generovanie homogénneho magnetického poa je nevyhnutné zhotovi cievku poda schémy na obrázkoch 1 a 2. Materiál, z ktorého sme zhotovili cievku je GUMOTEX. Použili sme dva druhy medeného drôtu. Na dolnú as sme navinuli 30 závitov medeného drôtu s priemerom 1,5 mm. Na druhú as tela cievky sme navinuli 200 závitov medeného drôtu s priemerom 0,5 mm. Rozmery tela cievky sú nasledovné: a 30 mm, b 10 mm, c 10.8 mm. Význam príslušných symbolov je zrejmý z obrázkov. 1 a 2. Samotná možnos využitia asovo premenlivého magnetického poa alebo asovo stabilného magnetického poa závisí od použitého zdroja (Obrázok. 3). Pri zapojení zariadenia na striedavý elektrický prúd, sme získali asovo premenlivé magnetické pole. Pri zapojení na jednosmerný elektrický prúd sme získali asovo stabilné magnetické pole. Ako spotrebi sme použili pre asovo premenlivé magnetické pole žiarovku s príkonom 60 W. Pre asovo stabilné magnetické pole sme ako zdroj použili žiarovku vhodnú na napätie 25 V. Obrázok. 1. Cievka pohad zhora 118

119 XI. Prílohy Obrázok. 2. Telo cievky Obrázok. 3. Bloková schéma zapojenia R regulátor napätia 119