Snímka 1

Prepis

1 VPLYV VÝLUHU LISTOV ANNONA MURICATA V DMEM NA KINETIKU PROLIFERÁCIE BUNKOVEJ LÍNIE HT-29 Iveta Gašparová 1, Zuzana Varchulová Nováková 1, Lenka Oravcová 1, Ľuboš Danišovič 1, Daniel Böhmer 1 1 Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LFUK a UNB, Sasinkova 4, Bratislava, Slovenská republika ivetagasparova@gmail.com

2 ÚVOD Úspešnosť liečby onkologických ochorení ostáva napriek pokrokom v medicíne a množstvu novo vyvinutých chemoterapeutík neuspokojivá. Je preto dôležité hľadať nové spôsoby terapie a skúmať látky s možným využitím v terapii onkologických ochorení. Viacero rôznych látok s antiproliferatívnym účinkom na rakovinové bunky už bolo objavených v rastlinách používaných v alternatívnej medicíne a fytoterapii. Napr. antikancerogénne účinky viacerých čínskych liečivých rastlín in vitro 2,3 antiproliferačný a proapoptotický účinok extraktu z listov Olea europaea na líniu buniek rakoviny hrubého čreva 4 protinádorový efekt germakrónu, bioaktívnej látky extrahovanej z Rhizoma curcuma na bunky ľudského hepatómu 5 Obr. 1

3 Annona muricata (anona mäkkoostnatá, graviola, soursop) rastlina z čeľade anonovité rastie v Ázii, Oceánii, Strednej a Južnej Amerike, Afrike listy a semená sú tradičnom liečiteľstve používané ako prostriedky proti parazitom, vysokému krvnému tlaku a rakovine Obr. 2 Annonacenové acetogeníny látky extrahované zo semien a listov Annona muricata antiproliferačné účinky na vybrané rakovinové bunkové línie. 6,7

4 CIELE EXPERIMENTU študovať vplyv výluhu listov Annona muricata v DMEM (štandardné kultivačné médium) na bunkovú líniu adenokarcinómu hrubého čreva (HT-29) po aplikácii rôznych koncentrácií výluhu sledovať zmeny proliferácie buniek indukciu apoptózy Materiál a metódy Usušené listy Annona muricata sme rozdrvili a lúhovali v DMEM pri teplote 80 C počas 20 minút. Zriedením s DMEM sme z výluhu vytvorili 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% a 1,5625% roztoky. Roztoky sme nechali pôsobiť počas 72 hodín na bunkovú líniu HT-29. Obr. 3 Pomocou testov cytotoxicity MTT a WST-1 (kolorimetrické testy založené na princípe rozloženia pridaného farbiva mitochondriálnymi enzýmami živých buniek) a testu apoptózy Muse Annexin V and Dead Cell Assay (fluorescenčná detekcia fosfatidylserínu na povrchu apoptotických buniek v prietokovom cytometri) sme zmerali hodnoty proliferácie a apoptózy buniek.

5 % buniek Proliferácia (%) VÝSLEDKY MTT HT-29 72h WST-1 HT-29 72h K Koncentrácia (%) HT ,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 K Koncentrácia (%) HT- 29 Zmeny proliferácie buniek HT-29 vystavených pôsobeniu rôznych koncentrácií výluhu listov Annona muricata v DMEM počas 72 hodín merané pomocou MTT Cell Proliferation Assay Zmeny proliferácie buniek HT-29 vystavených pôsobeniu rôznych koncentrácií výluhu listov Annona muricata v DMEM počas 72 hodín merané pomocou Cell Proliferation Reagent WST Apoptóza HT-29 72h Živé Skorá apoptóza Neskorá apoptóza Celková apoptóza Zmeny apoptózy buniek HT-29 vystavených pôsobeniu rôznych koncentrácií výluhu listov Annona muricata v DMEM počas 72 hodín merané pomocou Muse Annexin V and Dead Cell Assay Koncentrácia (%)

6 ZÁVER Roztok vytvorený vyluhovaním listov rastliny Annona muricata v DMEM pri 80 C počas 20 minút mal značný vplyv na proliferáciu a indukciu apoptózy v bunkovej línii HT-29. Čím menšie riedenie výluhu bolo použité, tým väčší vplyv na proliferáciu buniek sme pozorovali. Z výsledkov usudzujeme, že látky prítomné v listoch tejto rastliny indukujú apoptózu a znižujú proliferáciu v použitej bunkovej línii. Do budúcnosti navrhujeme zopakovať experiment s použitím metanolového extraktu. Taktiež plánujeme uskutočniť chemickú analýzu použitého extraktu. Listy tejto rastliny majú podľa našich meraní antiproliferatívne účinky na bunky adenokarcinómu hrubého čreva a mohli by byť použité pri vývoji nových chemoterapeutík. Zoznam použitej literatúry: 1. Shoemaker, M., Hamilton, B., Dairkee, S. H., Cohen, I. and Campbell, M. J. (2005), In vitro anticancer activity of twelve Chinese medicinal herbs. Phytotherapy Research, 19: doi: /ptr Lee, S. M. Y., Li, M. L. Y., Tse, Y. C., Leung, S. C. L., Lee, M. M. S., Tsui, S. K. W.,... & Waye, M. M. Y. (2002). < i> Paeoniae Radix</i>, a Chinese herbal extract, inhibit hepatoma cells growth by inducing apoptosis in a p53 independent pathway. Life sciences, 71(19), Reyes F, Centelles J, Lupianez J, Cascante M (2006), (2a, 3b)-2, 3-Dihydroxyolean-12-en-28-oic acid, a new natural triterpene from Olea europea, induces caspase dependent apoptosis selectively in colon adenocarcinoma cells. FEBS Lett 580: Liu Y., Wang W., Fang B., Ma F., Zheng Q., Deng P., Zhao S., Chen M., Yang G., He G. (2013). Anti-tumor effect of germacrone on human hepatoma cell lines through inducing G2/M cell cycle arrest and promoting apoptosis. European Journal of Pharmacology 698(1-3), George, V. C., Kumar, D. N., Rajkumar, V., Suresh, P. K., & Ashok, R. (2012). Quantitative assessment of the relative antineoplastic potential of the n-butanolic leaf extract of Annona muricata Linn. in normal and immortalized human cell lines. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 13(2), Wu, F. E., Gu, Z. M., Zeng, L., Zhao, G. X., Zhang, Y., McLaughlin, J. L., & Sastrodihardjo, S. (1995). Two New Cytotoxic Monotetrahydrofuran Annonaceous Acetogenins, Annomuricins A and B, from the Leaves of Annona muricata. Journal of Natural Products, 58 (6), Obrázky: Obr. 1 HT-29 In: [online]. [cit ]. Dostupné z: Obr. 2 Annona muricata leaves In: [online]. [cit ]. Dostupné z: Obr. 3 Blanco F M (1880). Flora de Filipinas. Gran edicion. [Atlas I]