PREŽÍVATEĽNOSŤ EMBRYÍ HOVÄDZIEHO DOBYTKA PO KRYOKONZERVÁCII Makarevič A.V. 1, Kubovičová E. 1, Chrenek P. 1,2, F. Louda 3 1 Národne poľnohospodárske a potravinárske centrum (NPPC) Nitra, Lužianky; 2 Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Nitra, Slovenská republika; 3 Výzkumný ústav pro chov skotu Rapotín, s.r.o., Výzkumníku 267, 78813 Vikýřovice, Česká republika
Dlhodobé uchovanie embryí: - komerčné šľachtiteľské programy - uchovávanie živočíšnych genetických zdrojov - tvorba génovej banky morphologické a biochemické zmeny Kryokonzervácia Strata viability a rastovej schopnosti, a/alebo bunková smrť Fyzikálne a chemické poškodenia Toxické účinky kryoprotektív
Kryokonzervácia embryí Strata životaschopnosti - faktory: Typ a koncentrácia kryoprotektív; Procedúra zmrazovania; Druh, plemeno, genotyp; Vývojové štádium embrya; Dĺžka uchovania v tekutom dusíku;
IVF embryá (v podmienkach laboratória) sú viac citlivé na vonkajšie faktory ako embryá in vivo (od superovulovaných donoriek) zlepšenie prežívateľnosti embryí po rozmrazení a efektivity embryotransferu cestou modifikácie kultivačných podmienok
Inzulínu podobný rastový faktor I (IGF-I) Polypeptid molekulovej hmotnosti 7,5 kda, známy stimulátor proliferácie a metabolizmu Pozitívne vplyvy na embryonálny vývoj (blastocysty, počet buniek, apoptóza) Potenciálny prvok pre zlepšenie preživateľnosti embryí po rozmrazení
-Testovanie vplyvu dlhodobého uskladnenia (vyše 20 rokov) embryí hovädzieho dobytka (HD) v tekutom dusíku na ich prežívateľnosť a kvalitu; -Testovanie vplyvu IGF-I na zlepšenie prežívateľnosti a kvality embryí HD po rozmrazení
In vivo získavanie embryí skotu Embryá (morula/kompaktná morula) výplach rohov maternice s Dulbecco PBS od superovulovaných dojníc (Czech Fleckvieh); Iba embryá dobrej morfológie boli vyselektované pre kryokonzerváciu
Zmrazovanie embryí Ekvilibrácia embryí (10 15 min) v médiu H-MEMD s 10% glycerolu; Pejety s embryami - zmrazené programovateľným zmrazovačom na 33 C; Umiestnenie do tekutého dusíka (LN 2 ) a dlhodobé uskladnenie (cca 20 rokov)
Rozmrazovanie na 1 min vodný kúpeľ (35 C) Skupiny po rozmrazení: 1: bez kultivácie (Kontrola; 0 h); 2: po 48 h kultivácie (bez prídavkov); 3: po 48 h kultivácie s IGF-I - 10 ng/ml; 4: po 48 h kultivácie s IGF-I - 100 ng/ml; Embryá skupín 2, 3 a 4 boli kultivované v 35-μl kvapkách média SOF (synthetic oviduct fluid) pri 5% CO 2 a 39 C počas 48 hod.
Analýza počtu buniek a výskytu apoptóz Blastocysta kravy ofarbená metódou TUNEL v kombinácie s farbivom DAPI TUNEL index: spočítaný ako pomer TUNELpozitívnych buniek k celkovému počtu buniek zafarbených DAPI
Analýza cytoskeletu embryí Značenie filamentov Aktinu reagentom Phalloidine TRITC I. trieda (najlepšia kvalita): ostro vyznačené filamenty aktínu sieťového tvaru II. trieda (dobrá kvalita): menej výraznejšie filamenty aktínu bez ostrých hraníc na membránach III. trieda (zlá kvalita): veľké oblasti bez označenia aktínu
Tab. 1. Efekt IGF-I na vývoj rozmrazených embryí po 48 hod. kultivácii Celkovo Z nich: Expand. Celkovo: Degene- Skupiny embryí, n Moruly Blastocysty blastocysty blastocysty rované n / % n / % n / % n / % n / % IGF-I 0 ng/ml 51 12 / 23.53 12 / 23.53 9 / 17.65 21 / 41.18 18 / 35.29 IGF-I 10 ng/ml*** 62 0 / 0 3 / 4.84 39 / 62.9 42 / 67.74 20 / 32.26 IGF-I 100 ng/ml*** 58 0 / 0 20 / 34.48 28 / 48.28 48 / 82.76 10 / 17.24 *** Preukazné rozdiely pri p< 0.001 v porovnaní s kontrolou (Chi-square test)
Tab. 2. Efekt 48h kultivácie a IGF-I na počet buniek a výskyt apoptózy u rozmrazených embryí (mean ± S.E.M.) Skupiny Počet embryí Parametre kvality embryí TUNEL-index, Bunkový počet, n # % # Bez kultivácie (0 hod.) 50 22.22 ± 0.59 a 66.8 ± 7.96 a,b Po 48 hod. kultivácie s IGF-I: IGF-I 0 ng/ml 50 17.7 ± 1.59 b 92.5 ± 12.76 a,c IGF-10 ng/ml 60 7.56 ± 1.91 c 105.8 ± 15.03 c,d IGF-I 100 ng/ml 58 6.92 ± 1.03 c,d 112.6 ± 3.25 d a-d Hodnoty v kolónkach s odlišnými písmenkami sú preukazne odlišné (one-way ANOVA a Tukey-test, p<0.05)
Tab. 3. Distribúcia embryí do tried kvality aktinového cytoskeletu (n/%) Skupiny Počet embryí Triedy kvality aktínu I II III Bez kultivácie (0 hod.) 50 0 6/12.00 44/88.00 Po 48 hod. kultivácii s IGF-I: IGF-I 0 ng/ml b 50 0 28/56.0 22/44.00 IGF-10 ng/ml c 60 5/8.33 35/58.33 20/33.33 IGF-I 100 ng/ml c 58 4/6.90 36/62.07 18/31.03 a vs b vs c rozdiely medzi skupinami sú preukazné pri p< 0.05(Mann-Whitney U test)
-Výsledky našej štúdie naznačujú, že dlhodobé (cca 20 rokov) uskladnenie embryí pri ultranízkej teplote v tekutom dusíku môže zhoršovať viabilitu a kvalitu embryí po rozmrazení. Vonkajšie faktory zhoršovania kvality embryí: -zníženie hladiny tekutého dusíka pod odporúčanú úroveň; - časté a nadbytočné manipulácie s valcami kde sú umiestnené embryá; - transport a manipulácia s embryami;
Rastový faktor IGF-I môže zlepšovať kvalitu zmrazených embryí hovädzieho dobytka, keď je pridávaný do kultivačného média po rozmrazení embryí. Praktická aplikácia výsledkov: - Tieto poznatky treba brať do úvahy pri tvorbe a udržiavaní živočíšnej génovej banky
Ďakujem za Vašu pozornosť