UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv HPLC analýza léčiv IV. Diplomová práce

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv HPLC analýza léčiv IV. Diplomová práce Hradec Králové 2012 Lucia Štichová

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Tato práce nebyla použita k získání jiného či stejného titulu Lucia Štichová Diplomová práce vznikla za podpory projektu SVV 265 001

Ďakujem doc. RNDr. Jaroslavovi Sochorovi, CSc. za cenné rady a odborné pripomienky pri vypracovaní diplomovej práce.

ABSTRAKT HPLC analýza léčiv IV. Diplomová práce Lucia Štichová Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické chemie a kontroly léčiv, Heyrovského 1203, Hradec Králové V této diplomové práci byly optimalizovány podmínky vysokoúčinné kapalinové chromatografie pro kvantitatívní hodnocení ibuprofenu. Dále byly stanovené podmínky mikroextrakce tuhou fázi, kterou byl ibuprofen extrahován z plné krve. Při mikroextrakci bylo použito vlákno se sorbentem polydimetylsiloxan divinylbenzen s šířkou 60 µm. Vlákno bylo ponořeno ve vzorku. Vzorek krve měl upravenou hodnotu ph na 2,6. Čas sorpce byl stanoven na 30 minut a čas desorpce do methanolu byl 15 minut. Mobilní fázi tvořil methanol s vodou v poměru 8:2 a ph bylo upraveno na hodnotu 3. Průtok byl 1 ml/min a detekce probíhala při vlnové délce 222 nm. Pro kvantitatívní vyhodnocení se použil vnější standard ibuprofenu. Byl stanovený detekční limit 0,005 µg/ml a kvantifikační limit 0,017 µg/ml.

ABSTRACT HPLC analysis of drugs IV. Diploma Thesis Lucia Štichová Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Pharmaceutical Chemistry and Drug Control, Heyrovského 1203, Hradec Králové In this thesis, conditions were optimized for high-performance liquid chromatography for quantitative evaluation of ibuprofen. It was established solid phase microextraction conditions for which ibuprofen was extracted from whole blood. The fiber was coated with polydimethylsiloxane - divinylbenzene with a thickness of 60 µm. The fiber was immersed in the sample. The blood sample was adjusted to ph 2.6. Sorption time was set at 30 minutes and the methanol desorption time was 15 minutes. The mobile phase consisted of methanol with water in the ratio 8:2 and ph was adjusted to a value of 3. The flow rate was 1 ml / min and detection was carried out at a wavelength of 222 nm. For quantitative evaluation the external standard was used. The detection limit was 0.005 µg / ml and the quantification limit was 0.017 µg / ml.

OBSAH: 1.ÚVOD... 8 2. TEORETICKÁ ČASŤ... 9 2.1 VYSOKOÚČINNÁ KVAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIA (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY HPLC)... 9 2.1.1 TEÓRIA A HISTÓRIA... 9 2.1.2 ZLOŽENIE KVAPALINOVÉHO CHROMATOGRAFU... 11 2.1.3 VELIČINY... 14 2.2 MIKROEXTRAKCIA TUHOU FÁZOU (SOLID PHASE MICROEXTRACTION SPME)... 18 2.2.1 ÚVOD... 18 2.2.2 ZARIADENIE... 18 2.2.3 PRINCÍP... 19 2.2.4 ĎALŠIE EXTRAKČNÉ MÉTODY... 21 2.2.4.1 EXTRAKCIA TUHOU FÁZOU... 21 2.2.4.2 EXTRAKCIA ORGANICKÝMI ROZPÚŠŤADLAMI... 22 2.2.4.3 DEPROTEINÁCIA... 23 2.3 NESTEROIDNÉ ANTIFLOGISTIKÁ... 25 2.3.1 MECHANIZMUS ÚČINKU... 25 2.3.2 ROZDELENIE... 26 2.3.3 FARMAKOLOGICKÉ VLASTNOSTI... 26 2.3.4 LIEKOVÉ FORMY... 27 2.4 PROFENY... 28 2.5 IBUPROFÉN... 29 2.5.1 FYZIKÁLNO-CHEMICKÉ VLASTNOSTI... 29 2.5.2 HISTÓRIA IBUPROFÉNU... 29 2.5.3 FARMAKOLOGICKÉ VLASTNOSTI... 30 2.6 ANALÝZA IBUPROFÉNU METÓDOU MIKROEXTRAKCIE TUHOU FÁZOU... 32 3. CIEĽ PRÁCE... 35 4. PRAKTICKÁ ČASŤ... 36

4.1 CHROMATOGRAFICKÝ MATERIÁL, PRÍSTROJE, POMÔCKY, CHEMIKÁLIE, LIEČIVA, BIOLOGICKÝ MATERIÁL... 36 4.2 ANALÝZA IBUPROFÉNU VYSOKOÚČINNOU KVAPALINOVOU CHROMATOGRAFIOU... 38 4.3 IZOLÁCIA IBUPROFÉNU Z PLNEJ KRVI METÓDOU MIKROEXTRAKCIE TUHOU FÁZOU... 39 5. VÝSLEDKY A DISKUSIA... 40 5.1 OPTIMALIZÁCIA PODMIENOK HPLC PRI ANALÝZE IBUPROFÉNU... 40 5.2 PODMIENKY MIKROEXTRAKCIE TUHOU FÁZOU PRI EXTRAKCIÍ IBUPROFÉNU Z KRVI... 42 5.3 VÝBER VNÚTORNÉHO ŠTANDARDU... 46 5.4 KALIBRAČNÁ KRIVKA... 51 5.5 MODELOVÉ VZORKY... 54 5.6 DETEKČNÝ A KVANTITATÍVNY LIMIT... 56 6.ZÁVER... 59 7. LITERATÚRA... 60

1.ÚVOD Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia je separačná analytická metóda, ktorá umoţňuje analýzu látky alebo zmesi látok či uţ kvalitatívne alebo kvantitatívne. Uplatnenie tejto chromatografie je veľmi široké. Je to veľmi citlivá metóda, ktorá dokáţe zistiť aj prítomnosť veľmi malého mnoţstva liečiva v biologickej vzorke. Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia umoţňuje separovať liečivo od svojich metabolitov a následne určiť ich mnoţstvo v biologickej tekutine, v ktorej boli analyzované. Vyuţíva sa pri terapeutickom monitorovaní liekových hladín s cieľom zefektívniť liečbu a minimalizovať riziká spojené s podaním liečiva. Je dôleţité zisťovať plazmatickú koncentráciu liečiva hlavne u pacientov, pri ktorých sa dá predpokladať, ţe plazmatická koncentrácia bude u nich zníţená alebo zvýšená a to je hlavne u detí, starších ľudí, tehotných ţien a pacientov, ktorí trpia jedným alebo viacerými ochoreniami. Dávkovanie je individuálne a na jeho optimalizáciu sa môţe vyuţiť vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Pri monitorovaní ţivotného prostredia sa tieţ môţe vyuţiť vysokoúčinná kvapalinová chromatografia, napríklad často sa pouţíva pri určovaní znečistenia vôd. 8

2. TEORETICKÁ ČASŤ 2.1 VYSOKOÚČINNÁ KVAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIA (HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY HPLC) 2.1.1 TEÓRIA A HISTÓRIA Chromatografické metódy sú separačné metódy s moţnosťou kvantitatívneho a kvalitatívneho hodnotenia separovaných látok v zmesi. Princípom je delenie látok medzi dve fáze. Stacionárna fáza (sorbent) je nepohyblivá a nachádza sa v kolóne a mobilná fáza sa pohybuje. Počas chromatografického procesu sa veľakrát vytvára rovnováţny stav medzi analyzovaným vzorkom, stacionárnou a mobilnou fázou. Dochádza k vzájomným interakciám na základe rôznej afinity analyzovaných látok k fázam. Podľa charakteru mobilnej fáze sa rozdeľujú tieto metódy na plynovú a kvapalinovú chromatografiu. Pri plynovej chromatografií je mobilná fáza inertný plyn a kvapalinová chromatografia vyuţíva kvapalnú mobilnú fázu. Kvapalinová chromatografia je v plošnom usporiadaní tenkovrstvá chromatografia, papierová chromatografia alebo v kolonovom usporiadaní vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. [1] Podľa charakteru separácie sa chromatografie delia na: Adsorpčná chromatografia princípom je rozdielna adsorbovateľnosť delených látok na povrch adsorbentu. Rozdeľovacia chromatografia podstatou je pri kvapalinovej chromatografií rozdielna rozpustnosť delených látok v dvoch navzájom nemiešateľných kvapalinách. Pri plynovej chromatografií ide o rozdielnu rozpustnosť delených látok v kvapalnej stacionárnej fáze. 9

Iontovo výmenná chromatografia dá sa vyuţiť len v kvapalinovej chromatografií. Princíp je rozdielna afinita delených látok, ktoré sú v iontovej forme k stacionárnej fáze, ktorú tvoria iontomeniče (katexy a anexy). Gelová chromatografia ide o kvapalinovú chromatografiu, kedy su látky delené podľa veľkosti molekúl. Stacionárnu fázu tvorí pórovitý materiál, ktorý je naplnený rozpúšťadlom. Malé molekuly prenikajú do všetkých pórov, väčšie molekuly idú len do väčších pórov a veľké molekuly sa nezadrţiavajú na kolóne. [1] Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia našla veľmi široké uplatnenie v analýze liečiv. Vyvinula sa z klasickej kolónovej chromatografie, ktorá bola objavená v roku 1906. Klasická kolonová kvapalinová chromatografia je najstaršia zo všetkých chromatografií. Po dlhú dobu od jej objavenia boli uprednosťňované iné typy chromatografií, pretoţe práca s kvapalinovou chromatografiou bola pracná a dlhá. Účinnosť delenia bola veľmi nízka. Objavy v oblasti molekulárnej biológie a mikroelektroniky spôsobili rozvoj tejto metódy. [2] Zo zloţitejších biologických vzoriek sa môţe liečivo izolovať pomocou extrakčných metód. Tým je liečivo oddelené od časti balastných endogénnych látok, ktoré by mohli komplikovať analýzu na kolóne. Separácia liečiva a jeho metabolitov a niektorých balastných endogénnych látok prebieha na kolóne. Výhodou HPLC je rýchlosť analýzy, minimálne mnoţstvo vzorky, automatizácia. [1] 10

2.1.2 ZLOŽENIE KVAPALINOVÉHO CHROMATOGRAFU Obrázok 1. Schéma chromatografu Schéma chromatografu je zobrazená na obrázku 1. [3] Zásobníky mobilnej fáze obsahujú mobilnú fázu alebo rozpúšťadlá, ktoré sa zmiešavajú. Ak sa počas procesu mení zloţenie mobilnej fáze ide o gradientovú elúciu. Pri izokratickej elúcií je zloţenie mobilnej fáze rovnaké počas celej doby analýzy.[1] Pumpy zabezpečujú transport mobilnej fáze konštantným prietokom cez kolónu do detektoru. Je dôleţité aby sa tlak v čerpadle príliš nemenil. To sa dá zaistiť odplynením mobilnej faze ultrazvukom alebo je degaser súčasťou chromatografu. [1][2] Ďalšou súčasťou je dávkovací ventil, ktorý aplikuje vzorku na chromatografickú kolonu. [2]Umoţňujú dávkovať konštantný objem vzorky na kolonu. Autosamplery su automatické dávkovače spojené so zásobníkom vzorky. [4] Kolóny pouţívané v chromatografií sú trúbky alebo kapiláry naplnené sorbentom. Plášť kolóny je tvorený najčastejšie nehrdzavejúcou oceľou, plastom alebo sklom. Plášť 11

musí byť chemicky inertný a odolávať vysokým tlakom. Sorbenty, ktoré môţu byť v kolone môţeme rozdeliť na polárne a nepolárne. Medzi polárne adsorbenty patrí silikagel, oxid hlinitý a chemicky viazané polárne fáze aminopropyl, kyanopropyl, diol, pentafluorfenylpropyl. Povrch silikagelu je slabo kyslý preto viac zadrţuje bazické látky ako kyslé a neutrálne. Pri ph vyššom ako 8 sa silikagel rozpúšťa. Nepolárne sorbenty tvoria chemicky viazané nepolárne fázy. Ide o uhľovodíkové reťazce viazané na hydroxylové skupiny na povrchu silikagelu reverzné fázy. Pouţívajú sa aj monolitické kolóny, ktoré sú tvorené jedným kusom pórovitého materiálu. Ich veľkou výhodou sú ich hydrodynamické vlastnosti. Majú dva druhy pórov veľké póry(makropóry) zaisťujú rýchly tok mobilnej fázy a stredne veľké póry (mesopóry) majú dosť veľký povrch, ktorý zabezpečuje vysokú separačnú aktivitu. Tieto kolóny umoţňujú pouţitie pri vysokých rýchlostiach mobilnej fázy bez veľkého zvýšenia tlaku a bez straty separačnej účinnosti. Pouţívajú sa anorganické monolity (na bázi silikagelu), makropórové polymérne monolity a stlačiteľné monolity (komprimované gely) Aj oxid zirkoničitý môţe tvoriť sorbent kolóny. Takéto kolóny sú oproti silikagelu chemicky aj tepelne stabilné. Sú stabilné pri všetkých hodnotách ph, pri vyššom tlaku a do teploty 200 C. Môţu sa pouţiť za extrémnych podmienok napríklad pri čistení kolóny. [4]Princípom interakcie molekuly vzorku s uhľovodíkovým reťazcom je tvorba vodíkových mostíkov alebo pomocou Van der Waalsových síl. Charakter reťazca určuje pevnosť väzby pre lipofilné látky. [2] Ďalšou súčasťou chromatografu je detektor. Kvalitativne aj kvantitatívne monitoruje eluované látky. Detektory sa delia na: Spektrofotometrický detektor meria absorbanciu elektromagnetického ţiarenia určitej vlnovej dĺţky eluátom pretekajúcim detektorom. Pri liečivách sa najviac pouţíva detekcia v UV oblasti spektra. UV detektory môţeme ešte rozdeliť na UV detektor s fixnou vlnovou dĺţkou, UV VIS detektor s premenlivou vlnovou dĺţkou, scanning UV detektor, ktorý sníma absorpčné spektrum v maximu píku daného liečiva a diode array detektor, ktorý sníma absorpčné spektrum pri viacerých vlnových dĺţkach a porovnáva pomery absorbancií. 12

Fluorimetrický detektor výhodný pri liečivách, ktoré vykazujú fluorescenciu. Je citlivejší a selektívnejší ako UV detektor, ale menej univerzálny. Elektrochemický detektor dá sa pouţiť pri liečivách, kde prebieha elektrochemická reakcia na rozhraní elektróda eluovaná látka. Môţeme ich rozdeliť na voltametrický, amperometrický a polarografický detektor. Merajú veličinu, ktorá je závislá na koncentrácií liečiva. Refraktometrický detektor premeriava rozdielny index lomu medzi mobilnou fázou a eluátom, ktorý obsahuje liečivo. Je univerzálny, ale menej citlivý. HPLC môţe byť spojená s hmotnostným spektrometrom (MS). Toto spojenie má veľkú citlivosť a poskytuje veľa údajov, ktoré pomáhajú identifikovať štruktúru liečiva. Pri výstupe eluentu z kolóny je potrebné odstrániť mobilnú fázu a previesť liečivo do plynného stavu. Na to sa pouţívajú techniky ionizácie nárazmi elektrónov, termoionizácie, elektroionizácie. Takto nabité častice sú potom v magnetickom alebo vysokofrekvenčnom poli rozdeľované podľa pomeru hmotnosti a náboja. [1] Citlivosť detektoru je jedným z hlavných kritérií pouţitelnosti pre monitorovanie liečiv. Ďalším kritériom je detekovateľnosť, čo je minimálne mnoţstvo látky, ktoré je moţné ešte detekovať a odlíšit odozvu od šumu. Na vyhodnotenie signálu z detektoru či uţ kvalitatívne alebo kvantitatívne sa pouţívajú počítačové programy. Softvér kontroluje a riadi jednotlivé komponenty HPLC. Umoţňuje zvoliť prietokovú rýchlosť, riadi zmiešavanie rozpúšťadiel pri gradientovej elúcií, určuje poradie vzoriek, ktoré budú nastrekované na kolónu, objem, ktorý je nastreknutý na kolónu, vlnovú dĺţku pri ktorej budú látky detekované. [2] 13

2.1.3 VELIČINY Retencia je daná retenčným časom t R alebo retenčným objemom V R. Je to celkový čas (alebo celkový objem), za ktorý mobilná fáza pretečie kolonou od nástreku vzorky po eluciu koncentračného maxima píku analyzovanej látky. [5] (1) t R retenčný čas, vzdialenosť od bodu nástreku po kolmicu spustenú z maxima píku analyzovanej látky V R retenčný objem v prietoková rýchlosť mobilnej fáze Hmotnostný distribučný pomer D m vyjadruje pomer celkového mnoţstva analyzovanej látky v stacionárnej fázi k celkovému mnoţstvu látky v mobilnej fázy. (2) (3) V S - objem stacionárnej fáze V M - objem mobilnej fáze K C rovnováţny distribučný koeficient Z chromatogramu sa dá určiť hmotnostný distribučný pomer pomocou rovnice: (4) t R - retenčný čas 14

t M mŕtvy čas, je to vzdialenosť od bodu nástreku po kolmicu spustenú z vrcholu píku odpovedajúceho nezadrţanej látke Rozlíšenie R S kvantitatívne vyjadruje rozdelenie látok v kolóne. Hodnota väčšia ako 1,5 zodpovedá rozdeleniu dvoch píkov. (5) t R1, t R2 retenčné časy, vzdialenosti medzi bodom nástreku a kolmicami spustenými z vrcholov dvoch susediacich píkov, t R2 t R1 w h1,w h2 šírky píkov v polovici ich výšky Účinnosť kolony sa môţe vyjadriť ako počet teoretických poschodí N. ( ) (6) poschodia H. Na porovnanie účinnosti rôznych kolón sa pouţíva výškový ekvivalent teoretického (7) L- dĺţka kolony v metroch Faktor symetrie píku A S (faktor chvostovania píku) vyjadruje aký symetrický je pík. Ak je hodnota 1 pík je úplne symetrický. (8) w 0,05 šírka píku v jednej dvadsatine jeho výšky d vzdialenosť medzi kolmicou spustenou z vrcholu píku a vzostupnou časťou píku v jednej dvadsatine jehi výšky Pomer signal k šumu (S/N) ovplyvňuje presnosť stanovenie obsahu.[5] 15

(9) h rozpätie šumu [5] Účinnosť kolony je daná tieţ viskozitou mobilnej fázy, vlastnosťami analyzovanej látky, jej difúznym koeficientom v mobilnej fáze a prietokovou rýchlosťou. V prúdiacej zóne mobilnej fázy prebiehajú kinetické procesy, ktoré určujú účinnosť kolony. Ide o turbulentnú difúziu, molekulárnu difúzu a odpor. Závislosť výšky teoretického poschodia H na prietokovej rýchlosti U vyjadruje Van Deemeterova rovnica: (10) A - turbulentná difúzia, je určená rozdielnými rýchlosťami prúdenia vnútri tečúcej mobilnej fáze B - molekulárna difúzia, ktorá je určená časom, charakterom náplne kolony a difuzibilitou mobilnej fáze C - prispevok odporu voči prevodu hmoty k výškovému ekvivalentu teoretického poschodia, charakterizuje mobilnú aj stacionárnu fázu Aby bola separácia účinná, musí byť H 0,01 1,00 mm. Optimálna prietoková rýchlosť s minimálnou hodnotou H je pre sorbenty s veľkosťou častíc 10 μm 2 ml/min a pre veľkosť častíc 5 μm je to 1,5 ml/min. Mimokolonový mŕtvy objem tieţ ovplyvňuje výšku teoretického poschodia. Je daný dĺţkou a vnútorným priemerom prídatných zariadení. Mal by byť čo najmenší. Optimálny objem analyzovanej vzorky, ktorý môţe tieţ ovplyvniť výšku teoretického poschodia je 10-100 μl. Selektivitu môţeme vyjadriť ako reletívnu retenciu. (11) 16

t M, t R1, t R2 - retenčný čas mobilnej fázy, látky 1 a 2 K 1, K 2 - kapacitné pomery látok Rozlíšenie sa dá tieţ popísať rovnicou: ( ) ( ) (12) I II III I, II, III - účinnosť, selektivita, kapacita Účinnosť, selektivitu a kapacitu moţno ovplyvniť zmenou zloţenia mobilnej fázy, ph mobilnej fázy, náplne kolony a zmenou teploty kolóny. Rozlíšenie dvoch píkov určujú tri faktory: účinnosť, selektivita a kapacita. Pre analýzu liečiv na reverznej fáze sa pouţívajú mobilné fázy zloţené z vody a organického rozpúšťadla. Ak upravíme ph mobilnej fázy, látky vo vzorke sa vyskytnú v ionizovanej alebo neionizovanej forme. Pri zvýšení teploty dôjde ku zvýšeniu interakcií medzi vzorkou a sorbentom. Tým sa zníţi kapacitný pomer medzi sorbentom a chromatografovanou látkou. Dobré separačné hodnoty predstavujú kompromis medzi rozlišením, kapacitou a rýchlosťou. [2] Na kvalitatívne vyhodnotenie sa pouţíva retenčný čas t R a kvantitatívne sa látka vyhodnocuje pomocou plochy píku alebo výšky píku. Pre kvantitatívne vyhodnotenie sa porovnávajú plochy alebo výšky píkov štandardu a analyzovaného liečiva alebo ich pomer. Môţe sa pouţiť metóda vonkajšieho a vnútorného štandardu. Vnútorný štandard sa pridá do vzorku v známom mnoţstve a je to látka, ktorá je odlišná od skúmanej látky, má iný retenčný čas a nereaguje so vzorkou. Vonkajší štandard je na kolónu nastreknutý samostatne a je to látka rovnaká ako je analyzovaná látka. [6] 17

2.2 MIKROEXTRAKCIA TUHOU FÁZOU (SOLID PHASE MICROEXTRACTION SPME) 2.2.1 ÚVOD Mikroextrakcia tuhou fázou bola vyvinutá v Kanade na Univerzite Waterloo Januszom Pawliszynom v roku 1990. [7] Je to jednoduchá a účinná metóda zakoncentrovania analyzovanej látky. Veľkou výhodou tejto techniky je, ţe netreba pouţívať veľké mnoţstvo rozpúštadla a nepotrebuje komplikované aparatúry. Je pouţiteľná v kombinácií s plynovou aj s kvapalinovou chromatografiou. Pouţíva sa na extrakciu liečiv v biologických tekutinách, na analýzu organických látok, ktoré znečisťujú ţivotné prostredie. [8] Na extrakciu látky zo vzorky sa pouţívajú okrem mikroextrakcie aj extrakcia tuhou fázou (SPE solid - phase extraction), extrakcia organickými rozpúšťadlami (LLE liquid liguid extraction), deproteinácia. [2] 2.2.2 ZARIADENIE Kremenné vlákno je pokryté polymerom v dĺţke 1 alebo 2 cm. Analyzovaná látka sa sorbuje do polymeru. Najčastejšie sa pouţíva polydimethylsiloxan, polyakrylát a divinylbenzen. Vlákno je v dutej oceľovej ihle, ktorá ho chráni pred mechanickým poškodením a je spojené s oceľovým piestom. Podľa polarity skúmanej látky sa určuje aký typ polymeru má mať vlákno. Nepolárne polymery sa pouţívajú pri extrakcií nepolárných látok a polárne pri extrakcií polárnych látok. Ţivotnosť vlákna závisí na vlastnostiach vzoriek, ktoré boli ním analyzované a na starostlivosti o vlákno. 18

2.2.3 PRINCÍP Kremenné vlákno s polymérom sa vysunie do priestoru nad hladinou vzorky (headspace) alebo sa ponorí do vzorky. Extrahovaná látka sa sorbuje do vrstvy, ktorá pokrýva vlákno. Po dosiahnutí rovnováhy, ktorá nastáva obvykle do 30 minút sa vlákno zasunie naspäť do ihly. Rovnováţny stav je závislý na koncentrácií látky vo vzorke a na type a hrúbke polymeru, ktorý pokrýva vlákno. Pri spojení s HPLC sa analyt potom desorbuje do rozpúštadla. Takto zakoncentrovaná vzorka sa ďalej analyzuje na kvapalinovom chromatografe. Pri plynovej chromatografií je desorpcia tepelná. Mnoţstvo látky, ktoré sa sorbuje do polymeru závisí na jeho hrúbke a na distribučnej konštante. Tekavé látky potrebujú hrubšiu vrstvu polymeru. Mnoţstvo extrahovanej látky na vlákne je priamo úmerné jej koncentrácií vo vzorke. n K K fs fs V V f f C V 0 s V s (13) n- mnoţstvo sorbovanej látky K fs - rozdelovací koeficient pre analyt (polymer vzorka) V f - objem pokrytia C 0 - koncentrácia látky vo vzorke na začiatku V s - objem vzorky Hodnota rozdeľovacieho koeficientu K fs by mala byť čo najvyššia, aby vlákno malo vysokú sorpčnú schopnosť. Väčšinou však nie je dosť vysoká na to aby sa látka extrahovala úplne, preto je táto metóda rovnováţna. Ak je objem vzorky dosť veľký, mnoţstvo látky sorbovanej na vlákno nezávisí od objemu. [8] Rovnica č.13 sa zmení na [7]: 19

n K fs V f C 0 (14) Mikroextrakcia tuhou fázou sa pouţíva v teréne pri odbere vzorky vody v jazere, rieke alebo v studni a aj pri odbere vzorky vzduchu. Pri tejto technike sa kombinuje vzorkovanie, extrakcia, zakoncentrovanie a dávkovanie v jednom kroku. Na dosiahnutie čo najvyššej presnosti pri vzorkovaní touto technikou je potrebné zachovať rovnakú dĺţku doby vzorkovania, rovnaký objem vzorky a hĺbku ponoru vlákna. Nie je nutné dosiahnúť úplnu rovnováhu, ale zachovať zhodné parametre pri kaţdej extrakcií. Na sorbciu malých tekavých molekúl a molekúl plynu je okrem hrúbky polymeru na vlákne dôleţitá aj porozita. Vlákna so syntetickým poróznym materiálom obsahujú karboxénové častice v polydimetylsiloxane alebo divinylbenzen. Miešanie vzorky počas extrakcie vedie k zlepšeniu sorbcie a ku zkráteniu času. Nepravidelné miešanie môţe zníţiť presnosť analýzy. Sorbcia môţe byť zvýšená pri pouţití ultrazvuku, zároveň však vedie k zahrievaniu vzorky, ktorá sa môţe odpariť. Tím sa zlepšuje extrakcia headspace. Netekavé látky sa extrahujú ponorením vlákna do vzorky. Do vzorky sa môţe pridať chlorid sodný v mnoţstve 25-30% hmotnosti vzorku. Zvýši sa iontová sila roztoku, zníţi sa rozpustnosť analytu a tím sa zvyšuje účinnosť extrakcie pre veľa látok, hlavne polárnych a tekavých. Pri analýze vysokomolekulárnych látkach sa nedoporučuje zvyšovať iontovú silu pretoţe môţu vznikať interferujúce píky. Úpravou ph sa tieţ zvyšuje iontová sila roztoku a tieţ sa mení rozpustnosť. Kyslé látky sú lepšie extrahované v kyslom prostredí a bazické látky v bazickom prostredí. V plynnej fáze sa molekuly pohybujú rýchlejšie ako v kvapalnej, preto sa rovnováha pri headspace dosiahne skôr ako pri ponorení vlákna do vzorky. Pri nízkej koncentrácií tekavej látky zmena objemu neovplyvní výsledok, ale pri vyššej koncentrácií je zmena objemu významná pre odozvu. Pri veľkom objeme vzorky (nad 5 ml) s vyššou koncentráciou mnoţstvo sorbovanej látky zo vzorky neodpovedá 20

lineárne zmene koncentrácie. Lineárna závislosť platí pre niţšie koncentrácie. Optimálne je pouţívať objemy vzoriek 1 5 ml. Pri ponorení vlákna do vzorky sa doporučuje čo najviac zmenšiť headspace priestor vo vialke. [8] 2.2.4 ĎALŠIE EXTRAKČNÉ MÉTODY 2.2.4.1 EXTRAKCIA TUHOU FÁZOU Je to metóda separácie analyzovanej látky z biologického materiálu. Cieľom extrakcie tuhou fázou je kvantitatívne presunúť analyzovanú látku z roztoku do vhodného rozpúšťadla. Princípom sú interakcie medzi roztokom vzorky a sorbentom. Interakcie majú charakter Van der Waalsových síl, vodíkových väzieb, interakcií dipól dipól. Sorbenty musia mať schopnosť viazať na svoj povrch rôzne chemické zlúčeniny. Nesmú byť rozpustné v pouţívaných rozpúšťadlách, nesmú s nimi reagovať, musia byť inertné k analyzovanej látke a musia mať veľkú sorpčnú kapacitu. Pouţívajú sa látky s pórovitou štruktúrou. Sorbent, ktorý sa pouţíva pri SPE býva v troch formách disky, kartridţe a injekčné striekačky naplnené sorbentom. Pouţívajú sa sorbenty podobné tým, ktoré vyuţíva kvapalinová chromatografia. Ide o silikagel, na ktorý je naviazaný uhlovodíkový reťazec C 18, C 8. Pouţívajú sa na separáciu hydrofóbnych látok z vodných roztokov. Ďalšie sorbenty sú na silikagel viazané aminopropylová, kyanopropylová alebo hydroxy skupina. Separujú sa touto fázou analyty z vodných alebo organických roztokov. Oxid kremičitý a silikagel sa pouţívajú na separáciu nízkych alebo stredne polárnych látok z nevodných roztokov. Prvým krokom tejto extrakcie je zmáčanie sorbentu rozpúšťadlom a solvatovanie funkčných skupin sorbentu. Väčšinou sa v tejto fázi pre nepolárne sorbenty pouţíva metanol a následne voda. Druhým krokom je aplikácia vzorku na sorbent. Analyzovaná látka je zachytená v sorbente, zachytiť sa môţu aj ďalšie látky. V ďalšom kroku sa kolónka 21

premýva tak, aby analyzovaná látka ostala v sorbente a ostatné látky, ktoré sa zachytili boli vymyté z kolónky. Posledným krokom je elúcia analyzovanej látky zo sorbentu. Treba na to vhodné rozpúšťadlo, ktoré poruší väzby medzi analytom a sorbentom. Výsledkom je vyčistený analyt, ktorý je koncentrovaný vo vhodnom rozpúšťadle. Podľa potreby sa rozpúšťadlo môţe zahustiť do sucha a odparok s analytom rozpustiť v malom objeme mobilnej fáze. Výhodami tejto metódy sú moţnosť automatizácie, výsledkom je vyčistený extrakt, niţšia spotreba rozpúšťadla, reprodukovateľnosť, dobrá výťaţnosť. [2][9] 2.2.4.2 EXTRAKCIA ORGANICKÝMI ROZPÚŠŤADLAMI Je to metóda kedy sa extrahovaná látka rozdelí medzi dve nemiešateľné kvapaliny v pomere, ktorý vyjadruje Nernstov zákon: K D c c 0 aq (15) K D - distribučná konštanta c 0 - koncentrácia analytu v organickej fáze c aq - koncentrácia analytu vo vodnej fáze [10] Čím bude pomer väčší, tým bude extrahovaná látka viac prechádzať z vodnej do organickej fáze. Pouţité rozpúšťadlá sa nesmú vzájomne rozpúšťať, fáze sa musia líšiť špecifickou hmotnosťou, nesmú byť príliš viskózne aby rýchlo nesedimentovali a nesmú mať sklon k tvorbe emulzií. [2] Látky, ktoré majú viac hydrofóbnych skupín budú viac rozpustné v rozpúšťadlách s niţšou dielektrickou konštantou a látky s prevahou hydrofilných skupín sa viac rozpúšťajú v rozpúšťadlách s vyššou dielektrickou konštantou. 22

Tabuľka 1: Zoznam rozpúšťadiel a ich dielektrických konštant ROZPÚŠŤADLÁ DIELEKTRICKÁ KONŠTANTA n-pentan 1,84 n-hexan 1,88 n-heptan 1,92 benzen 2,24 toluen 2,3 dietyleter 4,33 chloroform 4,8 n-propanol 21,8 etanol 25,8 metanol 33,6 voda 80,4 Úpravou ph puframi, ktoré sú minimálne rozpustné v organickom rozpúšťadle dosiahneme vyššiu selektivitu. Ak sa zníţi ph vodnej fázy budú kyslé látky viac prechádzať do organického rozpúšťadla. Bazické látky sa budú viac nachádzať v organickom rozpúšťadle pri zvýšení ph vodnej fázy. Účinnosť extrakcie sa môţe zvýšiť prídavkom anorganickej soli (NaCl, Na 2 SO 4 ). Organické rozpúšťadlo s extrahovaným analytom je moţné zahustiť do sucha a odparok s analytom rozpustiť v malom objeme rozpúšťadla čím dôjde k zakoncentrovaniu analytu. Nevýhodou tejto extrakce je moţnosť tvorby emulzií, veľká spotreba organických rozpúšťadiel a je to metóda náročná na čas. 2.2.4.3 DEPROTEINÁCIA Je to metóda kedy sa z biologickej vzorky precipitujú proteiny aby sa nedostali na chromatografickú kolonu, pretoţe by ju mohli znehodnotiť. Pouţívajú sa na to organické rozpúšťadlá miešateľné s vodou metanol, etanol, aceton. Tieţ sa môţu pouţiť silné kyseliny trifluoroctová, trichloroctová, chloristá, soli ťaţkých kovov Na 2 WO 4. 2H 2 O, ZnSO 4. 7H 2 O a ich kombinácie. 23

Proteiny sa z biologickej vzorky môţu separovať aj ultrafiltráciou cez semipermeabilnú membránu. Výhodou tejto metódy je, ţe nedochádza ku zmene koncentrácie zriedením. Je to výhodné u látok, ktoré nie sú viazané na proteiny. Pri výbere deproteinačnej techniky je treba zohľadniť chemickú štruktúru látky, jej stabilitu, väzbu na proteiny, filtračné membrány a výťaţnosť po deproteinácií. Je to jednoduchá a rýchla metóda, ale v niektorých prípadoch môţu vznikať mikropartikule, ktoré sa nedajú odstrániť centrifugáciou. Nevýhodou je tieţ prítomnosť endogénnych látok vo vzorke. [2] 24

2.3 NESTEROIDNÉ ANTIFLOGISTIKÁ 2.3.1 MECHANIZMUS ÚČINKU Sú to inhibítory enzýmu cyklooxygenáza, ktorý pri porušení bunečnej membrány mení kyselinu arachidonovú na prostaglandíny, tromboxán a prostacyklín.[11] Najväčší význam pre vznik zápalu majú prostaglandíny PGE 2. Zvyšujú vaskulárnu permeabilitu a citlivosť periférnych nociceptorov na bradykinín a histamín, tým vzniká bolesť a zápal. Reakciou na podráţdenie periférnych nociceptorov je aj zvýšená tvorba PGE 2 v CNS. Pôsobia periferne aj centrálne. Nenasýtená mastná kyselina arachidonová, ktorá je súčasťou bunečnej membrány sa pôsobením enzýmov postupne mení na prostaglandíny a leukotrieny. Účinkom fosfolipázy A alebo C, PGH syntetázy, čo je komplex obsahujúci cyklooxygenázu aj peroxidázu, vznikajú nestabilné cyklické endoperoxidy PGG 2 a PGH 2. Prostaglandín syntetázami z nich vznikajú prostaglandíny PGF 2, PGD, PGE 2, PG 2, TXA 2. Leukotrieny vznikajú pôsobením 5 lipooxygenázy na kyselinu arachidonovú. Sú to mediátory u astmy. [12] Existujú dve izoformy cyklooxygenázy: COX-1 a COX-2. Izoenzým COX-1 je potrebný na tvorbu prostaglandínov, ktoré pomáhajú udrţiavať zdravú ţaludočnú sliznicu, podieľajú sa na regulácií perfúzie obličiek a na procesoch agregácie trombocytov. Nachádza sa takmer vo všetkých bunkách.[11] Expresia COX-2 sa v makrofágoch, monocytoch, synoviocytoch, chondrocytoch, fibroblastoch a v endoteliálnych bunkách asi 20 krát zvýši počas zápalu. [12] Väčšinou majú nesteroidné antiflogistiká kyslý charakter, pretoţe obsahujú karboxylovú skupinu. [13] 25

2.3.2 ROZDELENIE Tieto látky sa rozdeľujú na základe chemickej štruktúry alebo selektivity k určitej izoforme enzýmu. [14] Podľa chemickej štruktúry sa delia na: Salicyláty kyselina acetylsalicylová Pyrazolidindiony fenylbutazon, kebuzon Deriváty arylalkanových kyselín:- fenaky diklofenak, indometacín - profeny ibuprofén, naproxén Oxikamy piroxikam, lornoxikam, meloxikam Fenamáty kyselina tolfenámová Ostatné nimesulid[13] Delenie podľa selektivity: Selektívne inhibítory COX-1 kyselina acetylosalicylová v dávke do 300mg denne Neselektívne inhibítory majú rôznu afinitu ku COX-1 a COX-2 Preferenčné inhibítory COX-2 - nimesulid Selektívne inhibítory COX-2 koxiby[12] 2.3.3 FARMAKOLOGICKÉ VLASTNOSTI Majú antiflogistické, antipyretické a analgetické účinky. Pouţívajú sa na zmiernenie bolesti a zkrátenie ztuhlosti kĺbov u reumatoidnej artritídy a ďalších zápalových 26

reumatických ochorení. Pôsobia proti bolesti hlavy, dysmenorey a aj pooperačnej bolesti. V ekvipotentných dávkach majú podobné účinky, no líšia sa v znášanlivosti. Kompletne sa vstrebávajú v gastrointestinálnom trakte. Potrava môţe spomaliť toto vstrebávanie. Viaţu sa na plazmatické bielkoviny, hlavne na albumín. Niektoré ochorenia ako napríklad ochorenie obličiek alebo pečene môţu zníţiť túto väzbu. Metabolizácia sa uskutočňuje hlavne v pečeni. Ich neaktívne metabolity sa vylučujú močom. Najčastejšie neţiadúce učinky sú gastrointestinálne problémy. Pri dlhodobom uţívaní môţe vzniknúť vred, jeho komplikácie sú krvácanie, perforácia a obštrukcia. Môţe sa vyvinúť dyspepsia alebo epigastrická bolesť. Pri selektívnych COX-2 inhibítoroch je vznik vredov rekukovaný o 50 80 %. Nesteroidné antiflogistika sú toxické pre obličky. Môţu spôsobiť retenciu sodíku, hyperkalémiu, pokles glomerulárnej filtrácie, intersticiálnu nefritídu alebo papilárnu nekrózu. To sa prejaví ako opuch, hypertenzia, dysrytmia, proteinuria, oliguria alebo infekcia močových ciest. [12] 2.3.4 LIEKOVÉ FORMY Najčastejšou liekovou formou je perorálna vo forme tabliet alebo kapslí. Niektoré sa môţu tieţ aplikovať parenterálne intramuskulárne alebo intravenózne. V prípadoch, kde nesteroidné antiflogistika spôsobujú gastropatie, je vhodná lieková forma čapíky. Síce takto nepôsobia toxicky priamo na sliznicu gastroduodena, ale zníţená tvorba prostaglandínov šetriacich sliznicu ostáva. Takţe tieto liekové formy nie sú výrazne šetrnejšie k sliznici GIT. Kontraindikácia pre čapíky s nesteroidnými antiflogistikami sú hemoroidy. Dosť rozšírená aplikační forma je lokálna maste, gely, spreje, náplaste. Biologická dostupnosť je 5 20%. [12] 27

2.4 PROFENY Do tejto skupiny nesteroidných antiflogistik sa zaraďuje ibuprofén, dexibuprofén, naproxén, kyselinu tiaprofénovú, flurbiprofén, ketoprofén a jeho pravotočivý optický enantiomer dexketoprofén. Majú dobré antiflogistické, antipyretické a analgetické vlastnosti. Sú celkom dobre znášané a majú relativne menšie neţiadúce účinky. Ich eliminačný polčas okrem naproxénu je krátky, preto sa podávajú viackrát denne. Dexibuprofén je pravotočivý optický enantiomer ibuprofénu, jeho účinok nastupuje rýchlejšie. Má lepšie antiflogistické účinky a dlhšie pôsobí analgeticky oproti ibuprofénu. traktu. Naproxén má stredne dlhý biologický polčas. Je relatívne šetrný k tráviacemu Kyselina tiaprofenová inhibuje enzymi, ktoré sa zúčastňujú degradácie chrupavky. Dobre preniká do synoviálnej tekutiny. [12] 28

2.5 IBUPROFÉN 2.5.1 FYZIKÁLNO-CHEMICKÉ VLASTNOSTI Ibuprofén patrí do skupiny nesteroidných antiflogistík. [15] Ibuprofén vznikol výmenou metylovej skupiny za vodík v molekuje ibufenaku, ktorý sa uţ nepouţíva, čím sa zníţila hepatotoxicita. [13] Chemicky je to (2RS)-2-(4-izobutylfenyl) propánová kyselina. Je to biely kryštalický prášok, nerozpustný vo vode. Je rozpustný v acetone, metanole a dichlormethane. Molekulová hmotnosť je 206,28. [5] Pouţíva sa jeho racemická zmes alebo S(+)enantiomer. Štruktúrny vzorec je na obrázku 2. [16] Obrázok 2. Štruktúrny vzorec ibuprofénu [16] 2.5.2 HISTÓRIA IBUPROFÉNU Ibuprofén patrí do skupiny derivátov kyseliny propiónovej a bol patentovaný v roku 1961. [17] Objavil ho Dr. Steward Adams a jeho kolegovia vo Veľkej Británií. [18] Na trh bol uvedený na liečbu reumatoidnej artritídy vo Veľkej Británií v roku 1969 a v USA v roku 1974. [17] V roku 1987 dostala skupina farmaceutov Boots Group, ktorej členmi sú aj Dr. Steward Adams a jeho kolegovia cenu Queen s Award for Technical Achievements za objav ibuprofénu. [18] Boots group mala patent do roku 1986. Na trhu bol ibuprofen pod obchodným názvom Advil a Nuprin. Od roku 1986 sú na trhu aj generické prípravky.[17] 29

2.5.3 FARMAKOLOGICKÉ VLASTNOSTI Ibuprofén sa zaraďuje medzi najpouţívanejšie nesteroidné antiflogistiká. [13] Mechanizmom účinku je reverzibilná inhibícia cyklooxygenázy. Má analgetický, antiflogistický a antipyretický účinok. [19]Pouţíva sa na zmiernenie bolesti, citlivosti a opuchu spôsobenej osteoartritídov a reumatoidnou artritídov. Pôsobí na slabú aţ mierne silnú bolesť, zniţuje zvýšenú teplotu. Tieţ sa môţe pouţívať na liečbu ankyloznej spondylitidy, dnovej artritídy a psoriatickej artritídy. [15] Vstrebáva sa v tenkom čreve. Jeho biologická dostupnosť je 80 100 %. Metabolizuje sa v pečeni a jeho neaktívne metabolity sú vylučované prevaţne obličkami. [19] Nástup účinku na lačno je do 45 minút, po najedení je to 60 180 minút. Biologický polčas ibuprofenu sú 2 hodiny. [12] Úplne sa vylúči z tela za 24 hodín. [13] Na trhu existujú prípravky so silou 200 800 mg. [16] Maximálna denná dávka je 1,2 2,4 g. Ako analgetikum-antipyretikum je doporučené dávkovanie 3 4 x 200 400 mg/den. [21] U detí je to 20 40 mg /kg na deň v 3 4 dávkach. [16] Antiflogistické účinky sú dosiahnuté pri vyšších dávkach ako analgetické účinky. [12] V prípravkoch sa ibuprofén môţe nachádzať sám alebo v kombinácií s inými liečivými látkami. [20] Medzi najčastejšie neţiaduce účinky patria gastrointestinálne problémy, najčastejšie nevoľnosť, zvracanie, recidíva ţaludočných vredov, niekedy hnačka, inokedy zápcha. Môţe vyvolať alergickú reakciu. V dôsledku blokády cyklooxygenázy sa zniţuje tvorba tromboxanu, a tím sa predlţuje doba krvácania a zniţuje sa agregačná aktivita trombocytov. [19] Medzi kontraindikácie patrí precitlivelosť na ibuprofén, kyselinu acetylsalicylovú alebo inú liečivú látku patriacu do skupiny nesteroidných antiflogistík. V treťom trimestri gravidity a aj počas kojenia by sa nemal uţívať ibuprofén. [20] Kontraindikovaný je tieţ pri závaţnom zlyhávaní srdca, poruchách hemokoagulácie a hemopoézy. [22] 30

Súčasné podávanie ibuprofénu s antikoagulanciami vedie k zvýšeniu rizika krvácania. Ibuprofén zvyšuje plazmatické koncentrácie lítia, digoxínu, fenytoinu a zvyšuje toxicitu pri metotrexáte a bakloféne. Môţe zníţiť účinok antihypertenzív a diuretík. Zvyšuje riziko krvácania do gastrointestinálneho traktu pri súčasnom podávaní s kortikoidmi,antiagregačnými látkami, SSRI a inými nesteroidnými antiflogistikami. Pri predávkovaní tj.dávka nad 400mg/kg telesnej hmotnosti hrozia CNS poruchy kŕče, závraty, bolesti hlavy aţ bezvedomie, bolesti brucha, nevoľnosť, zvracanie, hypotenzia, acidóza, zastavenie dychu. Liečba je symptomatická a podporná, jej súčasťou je aj výplach ţalúdka a podanie aktívneho uhlia. Ibuprofén sa nachádza v mnohých liečivých prípravkoch. Vo forme tabliet alebo kapsúl je napríklad v: Ibalgin 24x200 mg Nurofen 24x400 mg Ibalgin 30x600 mg Brufen retard 10x800 mg Môţe byť vo forme lyzínovej soli ibuprofénu, ktorá má rýchlejší nástup účinku. Na trhu sa nachádza v prípravku Ibalgin fast. Predáva sa aj vo forme sirupov, čapíkov, krémov, gelov a vo forme šumivého granulátu. [22] 31

2.6 ANALÝZA IBUPROFÉNU METÓDOU MIKROEXTRAKCIE TUHOU FÁZOU Kyslé a zásadité látky boli súčasne extrahované zo zbytkových vôd metódou mikroextrakcie tuhou fázou. Boli skúmané liečiva ibuprofén, fenoprofén, diklofenak, diazepam a loratadín. Počas extrakcie sa pouţívali dve odlišné ph. Na začiatku sa pouţívala ph 2,5. Po 30 minútach bola hodnota ph zmenené na 7,0 pridaním hydrogenfosforečnanu disodného. Po 20 minútach bola extrakcia ukončená. Pri zmene ph nedošlo k prerušeniu extrakcie. Ďalšia analýza bola na plynovej chromatografií spojenej s hmotnostným spektrometrom. Zmena ph počas extrakcie sa ukázala ako veľmi výhodná pre súčasnú sorpciu všetkých, či uţ kyslých alebo bazických zloţiek. [23] Ibuprofén bol extrahovaný z odpadných vôd spolu s N-butylbenzensulfonamidom. Pouţila sa na to metóda mikroextrakcie tuhou fázou spojená s plynovou chromatografiou a hmotnostným spektrometrom. Bolo pouţité vlákno pokryté polyakrylátom s hrúbkou 85µm. Sorpcia prebiehala 30 minút a desorpcia pri teplote 270 C 5 minút. Chromatografia prebehla bez predchádzajúcej derivatizácie karboxylovej skupiny ibuprofénu. ph vzorku muselo byť upravené na hodnotu 2. [24] Stanovovali sa podmienky pre enantioselektívnu analýzu ibuprofénu metódou SPME spojenou s HPLC. Analýza prebiehala vo vzorku moči. Vlákno pre SPME bolo potiahnuté polydimetylsiloxan divinylbenzenom a bolo ponorené vo vzorku. Po extrakcií bol ibuprofén nastreknutý na Chiralpac AD-RH kolónu a nasledovala UV- detekcia. Mobilná fáza bola zloţená z metanolu a kyseliny fosforečnej v pomere 75 : 25. ph bolo stanovené na hodnotu 3 a prietok bol 0,45 ml/min. Výťaţnosť (R) ibuprofénu bola 19,8% a (S) ibuprofénu 19,1%. Pri overení klesla výťaţnosť pod 15%. [25] V ďalšej štúdií boli metódou SPME extrahované z vody biologicky aktívne látky ibuprofén, paracetamol, fenazon, karbamazepin a nonylfenoly známe ako xenoestrogény. Ďalšia analýza prebehla pomocou plynovej chromatografie a hmotnostného spektrometra. Extrakcia bola vyskúšaná s viacerými vláknami. Najvýhodnejšie bolo pouţitie polyakrylátu 32

a Carbowax divinylbenzénu. Optimálny čas celej extrakcie bol určený na 30 minút. Jednou z hlavných látok, ktorá kontaminuje podzemnú vodu a vodu v riekach bol zistený ibuprofén. [26] Metóda mikroextrakcie tuhou fázou bola pouţitá pri zisťovaní kontaminácie povrchovej vody. Bola zisťovaná prítomnosť ibuprofénu, naproxénu, diklofenaku, karbamazepínu, gemfibrozilu, bisfenolu a atrazinu aj v rybách ţijúcich v povrchových vodách. Bez obetovania týchto zvierat táto metóda umoţňuje moţnosť skúmania, hodnotenia a monitorovania rizík na ţivotné prostredie. [27] Sedem nesteroidných antiflogistík bolo extrahovaných z kravského mlieka. Pouţitá bola mikroextrakcia tuhou fázou spojená s plynovou chromatografiou a hmostnostným spektrometrom. Analyzovaný bol ibuprofén, naproxén,diklofenak, flufenámová kyselina, tolfenámová kyselina, ketoprofén a meklofenámová kyselina. Boli pouţité tri druhy vlákna vlákno potiahnuté polyakrylátom, polydimetylsiloxanom a polydimetylsiloxan divinylbenzenom. Najvýhodnejšie sa ukázalo vlákno potiahnuté polydimetylsiloxanom. [28] Ibuprofén spolu s naproxénom, ketoprofénom, bezafibrátom, karbamazepinom a fenazónom bol hodnotený vo vodných vzokách povrchová voda, odpadová voda a morská voda. Pouţila sa na to metóda SPME s následnou micelárnou desorpciou. Čas sorpcie bol 60 minút a ph vzorky bolo upravené na hodnotu 2,5. Bolo pouţité vlákno s polymérom PDMS/DVB s hrúbkou 65 µm. Do desorpčného média boli pridané surfaktanty. Následne prebehla HPLC analýza s pouţitím diode array detektoru. Pouţitie surfaktantov má určité výhody niţšia toxicita a niţšia cena v porovnaní s organickými rozpúšťadlami pouţitými pri SPME. [29] Metódou mikroextrakcie tuhou fázou boli extrahované z povrchovej a odpadovej vody nesteroidné antiflogistiká ibuprofén, diklofenak, tolfenámová kyselina, naproxén a ketoprofén. Po sorpcií látok na vlákno s polyakrylátom bolo toto vlákno umiestnené do vialky, ktorá obsahovala 50 µl N-metyl-N-(terc-butyldimetylsilyl)-trifluoracetamidu. Po 33

silylácií kyslých zloţiek bola prevedená plynová chromatografia spojená s hmotnostným spektrometrom. [30] Metódou SPME boli hodnotené liečiva ibuprofén, warfarin, verapamil, propranolol a kofein v plazme. Následne prebehla HPLC analýzy spojená s hmotnostným spektrometrom. [31] 34

3. CIEĽ PRÁCE Cieľom mojej diplomovej práce bolo vybrať vhodné podmienky pre analýzu ibuprofénu kvapalinovou chromatografiou vo vzorke krvi. Ibuprofén bol izolovaný z králičej krvi metódou mikroextrakcie tuhou fázou a boli stanovené podmienky aby táto metóda bola čo najefektívnejšia. Ďaľšou úlohou bolo zostrojiť kalibračnú krivku pre kvantitatívne hodnotenie ibuprofénu v krvi. 35

4. PRAKTICKÁ ČASŤ 4.1 CHROMATOGRAFICKÝ MATERIÁL, PRÍSTROJE, POMÔCKY, CHEMIKÁLIE, LIEČIVA, BIOLOGICKÝ MATERIÁL Chromatografický materiál: Analytická kolóna Separon SGX C 18, 7 µm, 150x4 mm I.D., Tessek Ltd., Praha, ČR Prístroje: HPLC: Čerpadlo P1000, Thermo Separation Products, USA Autosampler AS1000, Thermo Separaton Products, USA Detektor UV3000HR, Thermo Separation Products, USA Počítačový program ChromQuest 4.2.34, Thermo Elektron 2003, USA Ultrazvuk K10, Kraintek, Nové Zámky, SR ph metr acidimetr 333 Druopta, Praha, ČR Pomôcky: Drţiak vlákna pre SPME, Supelco, Bellefonte, USA Vlákno pre SPME, sorbent na vlákne 60 µm, polydimetylsiloxane/divinylbenzen, Supelco, Bellefonte, USA 36

Chemikálie a liečiva: Ibuprofén, Sigma, St.Louis, USA Indometacín, Zentiva, Praha, Česká Republika Kyselina meklofenámová, Sigma, St.Louis, USA Kyselina niflumová, Sigma, St.Louis, USA Kyselina flufenámová, Sigma, St.Louis, USA Metanol HPLC-grade, Merck, Darmstadt, NSR Kyselina fosforečná 85% p.a., Lachema, Brno, ČR Biologický materiál: Králičia krv, Eldoret s.r.o, Praha, ČR 37

4.2 ANALÝZA IBUPROFÉNU VYSOKOÚČINNOU KVAPALINOVOU CHROMATOGRAFIOU Ibuprofén extrahovaný z plnej krvi mikroextrakciou tuhou fázou bol analyzovaný na kvapalinovom chromatografe s UV detektorom. Mobilná fáza bola tvorená metanolom s vodou a ph bolo upravené pomocou kyseliny fosforečnej na hodnotu 3. Kyselina fosforečná mala 85%, na úpravu ph bola zriedená vodou na 8,5%. Pomer metanolu a vody bol 8:2. Mobilná fáza bola odvzdušnená 15 minút ultrazvukom. Bola pouţitá analytická kolóna s reverznou fázou C18 s rozmermi 4x150 mm a s priemerom častíc 7 µm. Na kolónu bol nastrekovaný objem 20 µl. Prietoková rýchlosť bola zvolená na 1 ml/min. Pri tomto prietoku bol retenčný čas ibuprofénu 3,6 minúty. Doba analýzy bola stanovená na 7 minút. Detekcia prebiehala pri 222 nm. Pri analýze bol pouţitý vonkajší štandard ibuprofénu. 38

4.3 IZOLÁCIA IBUPROFÉNU Z PLNEJ KRVI METÓDOU MIKROEXTRAKCIE TUHOU FÁZOU Ibuprofén bol izolovaný z králičej krvi mikroextrakciou tuhou fázou, ktorá bola tvorená polydimethylsiloxan/divinylbenzenom (PDMS/DVB) s hrúbkou 60µm. Vzorka bola pripravená tak, ţe metanolický roztok štandardu ibuprofénu bol pridaný k 1 ml krvi a premiešaný. Potom bolo pridaných 9 ml destilovanej vody a ph vzorky bolo upravené kyselinou fosforečnou na 2,6. Kyselina fosforečná 85% bola zriedená destilovanou vodou na 8,5%. Z tohto vzorku bolo odobratých 5 ml a z takto upraveného vzorku za stáleho miešania prebiehala mikroextrakcia tuhou fázou. Vlákno s polymérom PDMS/DVB bolo vysunuté z dutej oceľovej ihly a bolo ponorené do vzorku. Sorpcia prebiehala 30 minút za stáleho miešania. Potom bolo vlákno s polymérom vsunuté spať do ihly a následne vysunuté a ponorené do 250 µl metanolu na dobu 15 minút. Po 15 minútach bolo vlákno znovu vsunuté do ihly. Z 250 µl metanolu kde prebiehala desorpcia bol nastrekovaný na kolónu C18 objem 20 µl. Po desorpcií bolo vlákno s polymérom ponorené do 5 ml metanolu na 15 minút a následne vsunuté do ihly. Tým bolo vymyté a pripravené k následnej mikroextrakcií. 39

5. VÝSLEDKY A DISKUSIA 5.1 OPTIMALIZÁCIA PODMIENOK HPLC PRI ANALÝZE IBUPROFÉNU Za mobilnú fázu bol zvolený roztok metanolu s vodou v pomere 8:2. [32] Kyselinou fosforečnou zriedenou destilovanou vodou na 8,5% bolo ph upravené na hodnotu 3. Mobilná fáza bola odvzdušnená 15 minút ultrazvukom. Pomer metanolu a vody bol vyskúšaný aj 7:3, ale optimálnejší pre analýzu ibuprofénu bol pomer 8:2. Prietok bol určený na 1 ml/min. Pri prietoku 1,2 ml/min bola spotreba mobilnej fáze vyššia a retenčný čas ibuprofénu sa veľmi neskrátil (3,1 min), preto bola výhodnejšia prietoková rýchlosť 1 ml/min. Retenčný čas ibuprofénu pri tejto prietokovej rýchlosti bol 3,6 minúty. Nebolo potrebné voliť niţší prietok aby retenčný čas ibuprofénu bol väčší, pretoţe v čase 3,6 minúty pík ibuprofénu neinterferoval s ničím. Dĺţka celej analýzy bola určená na 7 minút. Štandardy ibuprofénu s koncentráciami 0,1 mg/ml, 0,01 mg/ml a 0,001 mg/ml boli merané pri rôznych vlnových dĺţkach. Boli vyskúšané vlnové dĺţky 222 nm, 225 nm, 230 nm, 232 nm a 235 nm. Merania boli urobené dva krát a priemery plôch píkov štandardu ibuprofénu pri rôznych vlnových dĺţkach a v rôznych koncentráciách sú uvedené v tabuľke 2. Tabuľka 2. Plochy píkov štandardu ibuprofénu Koncentrácia ibuprofénu 222nm 225nm 230nm 232nm 235nm (mg/ml) 0,1 5 171 120 - - - - 0,01 626 150 561 120 325 085 241 815 140 087 0,001 71 255 62 544 42 759 34 488 19 564 40

Vzhľadom k tomu, ţe veľkosti plôch píkov pri vlnovej dĺţke 222 nm boli najväčšie, bola táto vlnová dĺţka zvolená pre ďalšie merania. Na obrázku 3 je chromatogram štandardu ibuprofénu s koncentráciou 0,01 mg/ml analyzovaného pri vybratých podmienkach. Obrázok 3. HPLC chromatogram: metanolický štandard ibuprofénu (1) s koncentráciou 0,01 mg/ml. Podmienky HPLC stanovené v kapitole 4.2. 41

5.2 PODMIENKY MIKROEXTRAKCIE TUHOU FÁZOU PRI EXTRAKCIÍ IBUPROFÉNU Z KRVI Pri úprave vzorky krvi pre mikroextrakciu tuhou fázou boli vyskúšané rôzne hodnoty ph vzorku. Na úpravu hodnoty ph bola pouţitá kyselina fosforečná 85%, ktorá bola zriedená vodou na 8,5%. Vzorka bola pripravená tak, ţe k 1 ml krvi bolo pridaných 0,1 ml metanolického roztoku štandardu ibuprofénu s koncentráciou 1 mg/ml. Po premiešaní bolo pridaných 9 ml destilovanej vody. ph bolo upravované kyselinou fosforečnou 8,5% na hodnoty 2,6, 3, 3,5, 4, 5 a 7. Zo vzorky bolo odobratých 5 ml. Vlákno s PDMS/DVB bolo ponorené do 5 ml vzorky. Za stáleho miešania prebiehala sorpcia, ktorá trvala 30 minút. Potom bolo vlákno vytiahnuté zo vzorky a ponorené do 250 µl metanolu na 15 minút. Nasledovala HPLC analýza pri podmienkach určených v kapitole 4.2. V tabuľke 3 je uvedená percentuálna výťaţnosť mikroextrakcie tuhou fázou pri rôznych hodnotách ph vzorku. Tabuľka 3. Výťaţnosť mikroextrakcie tuhou fázou - vplyv ph vzorky. ph vzorku Výťaţnosť (%) 2,6 11,3 3 9,5 3,5 6,3 4 5,4 5 4,7 7 - Z tabuľky 3 vyplýva, ţe výťaţnosť SPME sa zvyšuje pri klesajúcej hodnote ph. Pri ph 7 sa ibuprofén na polymér PDMS/DVB nesorboval. Najväčšia výťaţnosť bola pri hodnote ph 2,6 a preto bola pre ďalšie merania upravovaná ph na hodnotu 2,6. Pre optimalizáciu SPME podmienok pre extrakciu ibuprofénu z plnej krvi boli vyskúšané zmeny časov sorpcie a desorpcie. Vzorka bola pripravená tak, ţe sa k 1 ml krvi pridalo 0,1 ml metanolického roztoku štandardu ibuprofénu s koncentráciou 1 mg/ml a po 42

premiešaní sa pridalo 9 ml destilovanej vody. Následne bola upravená hodnota ph na 2,6. Pouţila sa na to kyselina fosforečná 8,5%. Zo vzorky bolo odobratých 5 ml. Potom bolo vlákno s polymérom PDMS/DVB ponorené do 5 ml vzorky na dobu 5 minút. Desorpcia prebiehala do 250 µl metanolu 15 minút. Následná HPLC analýza prebehla pri podmienkach uvedených v kapitole 4.2. Ďalšie vzorky boli pripravené rovnako, len s tým rozdielom, ţe vlákno s polymérom bolo vo vzorke ponorené 10, 20, 30 a 65 minút. Pri ďalšich vzorkách bola krv upravená rovnako a vlákno s polymérom PDMS/DVB bolo ponorené do 5 ml vzorky na dobu 20 minút. Časy desorpcie do 250 µl metanolu boli vyskúšané 5, 10, 15, 20 a 30 minút. HPLC analýza bola prevedená za podmienok stanovených v kapitole 4.2. V tabuľke 4 je uvedená výťaţnosť mikroextrakcie tuhou fázou pri rôznych časoch sorpcie a desorpcie. Tabuľka 4. Výťaţnosť mikroextrakce tuhou fázou vplyv doby sorpcie a desorpcie. Dĺţka sorpcie(min) Dĺţka desorpcie(min) Výťaţnosť(%) 5 15 3,2 10 15 7,5 20 15 12,5 30 15 18,2 65 15 27,4 20 5 15,1 20 10 10,9 20 15 13,2 20 20 12,3 20 30 13,9 Pri predlţovaní času sorpcie sa výťaţnosť SPME zvyšovala. Z tabuľky 4 vyplýva, ţe najvyššia výťaţnosť SPME je pri trvaní sorpcie 65 minút a desorpcie 15 minút. Vzhľadom k časovej náročnosti bol vybratý kratší čas sorpcie, pri ktorom bola dosiahnutá druhá najvyššia výťaţnosť a to je čas 30 minút. Pri predlţovaní času desorpcie do metanolu sa výťaţnosť SPME nezvyšovala. Za optimálnu dĺţku desorpcie bol zvolený čas 15 minút. Pre prípravu ďalších vzoriek bola vybratá dĺţka sorpcie 30 minút a desorpcie 15 minút. Na obrázku 4 je chromatogram vzorky s časom sorpcie 30 minút a časom desorpcie 15 minút. 43

Na overenie či desorpcia 15 minút je úplna bolo vlákno s polymérom po prevedenej desorpcií ešte vsunuté do 250 µl metanolu na 15 minút. Nasledovala HPLC analýza pri chromatografických podmienkach uvedených v kapitole 4.2. Na chromatograme sa neobjavil v čase 3,6 minúty ţiadny pík. Tento chromatogram je na obrázku 5. Obrázok 4. HPLC chromatogram: vzorka krvi s prídavkom ibuprofénu (1) (10 µg/ml). Mikroextrakcia prebehla podľa podmienok stanovených v kapitole 4.3 a podmienky HPLC sú uvedené v kapitole 4.2. 44

Obrázok 5. HPLC chromatogram: metanol (desorpčné médium) pri opakovanej desorpcií vlákna. Podmienky HPLC stanovené v kapitole 4.2. 45