RPR 100 72515 500 72516 SÚPRAVY PRE KVALITATÍVNU A SEMIKVANTITATÍVNU DETEKCIU NETREPONEMÁLNEJ PROTILÁTKY SÚVISIACEJ SO SYFILISOM - REAGINU, V ĽUDSKOM SÉRE ALEBO PLAZME S POUŽITÍM MAKROSKOPICKEJ AGLUTINÁCIE NA JEDNORAZOVÝCH TESTOVACÍCH KARTÁCH 883684-2014/12
OBSAH 1. PLÁNOVANÉ POUŽITIE... 3 2. ZHRNUTIE A VYSVETLENIE TESTU... 3 3. PRINCÍPY POSTUPU... 3 4. REAGENCIE... 4 5. VAROVANIA A PREVENTÍVNE OPATRENIA... 4 6. VZORKY... 6 7. POSTUP... 6 8. OBMEDZENIE TESTU... 8 9. FUNKČNÉ CHARAKTERISTIKY... 8 10. BIBLIOGRAFICKÉ ODKAZY.... 10 [SK] 2
1. PLÁNOVANÉ POUŽITIE Súpravy RPR sú určené na použitie pre kvalitatívnu a semikvantitatívnu detekciu netreponemálnej protilátky súvisiacej so syfilisom (reagínu) v ľudskom sére a plazme ako pomôcka pri diagnostike infekcie syfilisom. 2. ZHRNUTIE A VYSVETLENIE TESTU Syfilis je chronická infekcia, ktorá postupuje cez odlišné fázy infekcie: primárna, sekundárna, terciárna a kvartérna. Tieto fázy produkujú rozdielne klinické symptómy, produkujúc obvykle počiatočné tvrdé vredy a potom syfilitickú vyrážku nasledovanú dlhými obdobiami pokojového štádia. Neliečená infekcia môže mať prípadne za následok kardiovaskulárne problémy a neurosyfilis. Infekcia je spôsobená spirochétou Treponema pallidum a obvykle je získaná sexuálnym kontaktom, hoci choroba môže byť prenášaná aj transfúziou infikovanej krvi. Tiež sa vyskytuje vnútromaternicová infekcia. Bolo dokázané, že organizmus je prakticky nemožné kultivovať v umelom médiu a diagnóza infekcie obvykle závisí od demonštrácie protilátok v krvi, ktoré sa objavia čoskoro po počiatočnej infekcii a môžu pretrvávať mnoho rokov. Skúšky na syfilis spadajú do štyroch kategórií: priama mikroskopická prehliadka, testy treponemálnej protilátky, testy netreponemálnej protilátky a priame antigénové testy. RPR (Rapid Plasma Reagin) je netreponemálny test, ktorým sa zisťujú protilátky nešpecifické pre T pallidum, aj keď ich prítomnosť v sére alebo plazme pacienta je pevne spojená s infekciou organizmu. Tento typ testu meria protilátky (IgG a IgM) produkované v reakcii na lipidom podobný materiál uvoľňovaný z poškodených hostiteľských buniek, rovnako ako na lipoproteínu podobný materiál uvoľňovaný zo spirochét. Tieto protilátky sa zvyčajne po úspešnom vyliečení infekcie stratia. 3. PRINCÍPY POSTUPU Súpravy RPR využívajú uhlíkové častice potiahnuté zmesou lipidových antigénov, ktoré sa spoja s protilátkou reagín prítomnou v sére alebo plazme pacienta. Tieto častice sú suspendované v médiu, ktoré obsahuje komponenty pre elimináciu nešpecifických reakcií. Pozitívne reakcie sú znázornené makroskopickou aglutinácou (zhlukmi) častíc. Aj keď je súprava určená na použitie predovšetkým ako kvalitatívny test, hladiny protilátok môžu byť titrované dvojnásobným riedením. Vzory aglutinácie sa interpretujú okom. [SK] 3
4. REAGENCIE 4.1. Popis Identifikácia na označení R1 RPR Antigen R2 Positive control R3 Negative control Popis RPR Antigen Uhlíkové častice potiahnuté protilátkami proti kardiolipínu, lecitínu a cholesterolu vo fosfátovom tlmivom roztoku Positive control Ľudské sérum obsahujúce protilátky spojené s T.pallidum, negatívne na antigén HBs, anti- HIV1/2 a protilátky anti-hcv, zriedené vo fosfátovom tlmiacom roztoku Negative control Králičie sérum v fosfátovom tlmivom roztoku Dávkovacia fľaštička (opakovane použiteľná) Dávkovacia ihla (opakovane použiteľná) Balenie 72515 72516 100 testov 500 testov 1 ampulka 2 ml 1 ampulka 1 ml 1 ampulka 1 ml 1 ampulka 10 ml 1 ampulka 2 ml 1 ampulka 2 ml 1 1 1 1 Testovacie karty (10 krúžkov) 10 50 4.2. Požiadavky na skladovanie a zaobchádzanie Táto súprava by mala byť skladovaná pri +2 - +8 C. Fľaštičky skladujte v stojacej polohe. Nemrazte. Každá položka tejto súpravy skladovaná pri teplote +2-8 C môže byť použitá až do dátumu exspirácie uvedeného na obale. Po otvorení a pri absencii kontaminácie môžu byť reagencie R1, R2 a R3 uchovávané pri teplote +2-8 C použité až do dátumu exspirácie uvedeného na etikete. 5. VAROVANIA A PREVENTÍVNE OPATRENIA Určené na diagnostické použitie in vitro. Na profesionálne používanie zdravotníckej starostlivosti. 5.1. Zdravotné a bezpečnostné opatrenia: S touto testovacou súpravou by mal pracovať len kvalifikovaný personál vyškolený v laboratórnych postupoch a oboznámený s potenciálnymi rizikami. Noste vhodný ochranný odev, rukavice, ochranu očí/tváre a so súpravou manipulujte v súlade s požiadavkami správnej laboratórnej praxe. Dodávané kontrolné materiály sú pripravené z ľudského séra. Boli testované na úrovni darcov a bol potvrdený negatívny antigén HBs, anti-hiv-1/2 a protilátky anti- [SK] 4
HCV. Žiadna známa testovacia metóda nedokáže ponúknuť kompletné uistenie o tom, že nie sú prítomné infekčné agensy. Preto by sa malo so všetkými derivátmi ľudskej krvi, reagenciami a ľudskými vzorkami zaobchádzať tak, ako keby prenášali infekčnú chorobu, na základe odporúčaných univerzálnych bezpečnostných opatrení pre krvné patogény stanovených miestnymi, regionálnymi a národnými nariadeniami. Biologické rozliatia: Rozliaty materiál z ľudského zdroja by sa mal považovať za potenciálne infekčný. Rozliaty materiál, ktorý neobsahuje kyselinu, by sa mal ihneď dekontaminovať, vrátane oblasti rozliatia, materiálov a všetkých kontaminovaných povrchov alebo zariadení s vhodným chemickým dezinfekčným činidlom, ktoré je účinné na potenciálne bioriziká spojené s príslušnými vzorkami (bežné riedenie 1:10 s bielidlom z domácnosti, 70-80 % etanolom alebo izopropanolom, jodoforom (ako je 0,5 % Wescodyne Plus, atď.) a do sucha zotrieť. Rozliaty materiál, ktorý obsahuje kyselinu, by sa mal vhodne absorbovať (zotrieť) alebo neutralizovať, oblasť by sa mala opláchnuť vodou a utrieť dosucha; materiály použité na absorpciu rozliateho materiálu si môžu vyžadovať likvidáciu ako biologicky nebezpečný odpad. Potom by sa mala celá oblasť dekontaminovať niektorým chemickým dezinfekčným činidlom. POZNÁMKA: Nedávajte do autoklávu roztoky obsahujúce bielidlo! Zlikvidujte všetky vzorky a materiály použité na vykonávanie testu, pretože môžu obsahovať infekčné látky. Laboratórny, chemický alebo biologicky nebezpečný odpad musí byť manipulovaný a zlikvidovaný v súlade so všetkými lokálnymi, regionálnymi a národnými nariadeniami. Karta bezpečnostných údajov je dostupná na www.bio-rad.com. 5.2. Opatrenia vzťahujúce sa na postup 5.2.1. Príprava Spoľahlivosť výsledkov závisí od správnej implementácie nasledujúcich zásad správnej laboratórnej praxe: Nezmiešavajte alebo nezdružujte reagencie z rôznych dávok v rámci vykonávania testu. Nepoužívajte exspirované reagencie. Pred použitím počkajte 30 minút, kým sa reagencie stabilizujú pri teplote miestnosti (18-30 C). 5.2.2. Spracovávanie Nemeňte postup testu. Pre každú vzorku použite novú distribučnú špičku. Nedotýkajte sa reak ného povrchu aglutina ných kariet. [SK] 5
6. VZORKY Vzorky séra alebo plazmy (EDTA, citrát sodný, heparín sodný a ACD) by mali byť zbavené krvných buniek. Môžu byť skladované pri teplote +2-8 C po dobu až 7 dní pred testovaním. Vzorky, ktoré vyžadujú dlhšie skladovanie, musia byť zmrazené pri teplote -20 C alebo nižšej. Zmrazené vzorky by mali byť pred testovaním rozmrazené a dobre pomiešané. Neopakujte viac ako 5 cyklov zmrazenia/rozmrazenia. Zahrievanie vzoriek pri teplote 56 C počas 1 hodiny nemá vplyv na výsledky. Vzorky obsahujúce do 120 g/l albumínu, 200 mg/l bilirubínu, 33 g/l trioleínu alebo 2 g/l hemoglobínu a vzorky obsahujúce do 2 g/l hemoglobínu neovplyvnia výsledky. Avšak neodporúča sa používať hyperlipemické a hyperhemolyzované vzorky. Ak majú byť vzorky prepravované, musia byť zabalené v súlade s platnými nariadeniami týkajúcimi sa prepravy etiologických činidiel a uprednostňuje sa ich preprava v zmrazenom stave. 7. POSTUP 7.1. Požadované materiály 7.1.1. Dodávaný materiál Správne kalibrovaná jednorazová dávkovacia fľaštička a dávkovacia ihla pre dávkovanie uhlíkových častíc. 7.1.2. Požadovaný materiál, ktorý sa nedodáva Rotátor na otáčanie testovacích kariet pri rýchlosti 100 ot./min, v krúžku o priemere približne 1 cm. Správne kalibrovaná a udržiavaná pipeta a špičky na pipetovanie objemu 50 ul. 0,9 % soľný roztok (pre semi-kvantitatívny test) 7.2. Postup testu Pozitívna (R2) a negatívna (R3) kontrola súpravy musí byť vykonaná pri každom spustení testov. 7.2.1. Kvalitatívny test 1. Dajte 50 µl vzorky do krúžku na testovacej karte. 2. Vzorku a kontroly roztiahnite rovnomerne po oblasti testovacieho krúžku. 3. Fľaštičku s antigénom RPR dôkladne pretrepte tesne pred použitím, aby ste zabránili sedimentácii. 4. Na dávkovaciu fľaštičku pripojte dávkovaciu ihlu a saním naberte RPR antigén. 5. Dávkovač obráťte a jemne ho stlačte, aby ste vytlačili vzduch z ihly. 6. Pridržte dávkovaciu fľaštičku vo zvislej polohe nad testovacou vzorkou a dávkujte jedinú kvapku antigénu RPR. 7. Testovaciu kartu umiestnite do rotátora kariet a otáčajte po dobu 8 minút pri rýchlosti 100 ot./min. 8. Čítajte ihneď a v dobrom svetle vizuálne výsledky interpretujte. (pozrite si bod 7.4) [SK] 6
Poznámka: Ak nie je možné výsledky odčítať ihneď, musí byť karta udržiavaná v rotátore až po dobu 15 minút. 9. Nepoužitý antigén vráťte z dávkovacej fľaštičky späť do sklenenej ampule. 10. Dávkovaciu fľaštičku a ihlu vyčistite destilovanou vodou a pred opätovným použitím nechajte oschnúť. 7.2.2. Semikvantitatívny test 1. V soľnom roztoku 0,9 % urobte dvojité riedenia z neriedeného na 1:16. 2. Dajte 50 µl každého riedenia a kontrol do samostatného krúžku na testovacej karte. 3. Každé riedenie rovnomerne roztiahnite na testovací krúžok. 4. Pokračujte ak podľa kvalitatívneho testu v časti 3. Titer vzorky je vyjadrený ako recipročná hodnota najvyššieho riedenia, pri ktorej dochádza k aglutinácii uhlíkových častíc. V prípade, že najvyššie testované riedenie (1:16) je reaktívne, pokračujte s ďalšou sériou riedení pripravených dvojnásobným riedením vzorky od 1:32 do 1:512 za použitia 0,9 % soľného roztoku. Dobre premiešajte a pokračujte od kroku 2 v semikvantitatívnom teste. 7.3. Kontrola akosti Na overenie skúšky použite Positive Control (R2) a Negative Control (R3) pri každom teste. 7.4. Interpretácia výsledkov a kritériá overenia skúšky Silno reaktívne (SR): Veľké zhluky uhlíkových častíc s jasným pozadím. Reaktívne (R): Veľké zhluky uhlíkových častíc o niečo viac rozptýlené ako v prípade silnej reaktivity. Slabo reaktívne (WR): Malé zhluky uhlíkových častíc so svetlo sivým pozadím. [SK] 7
Stopy reaktivity (TR): Mierne zhlukovanie uhlíkových častíc zvyčajne viditeľné ako skupina agregovaných častíc v strede testovacieho krúžku alebo rozptýlené okolo okraja testovacieho krúžku. Nereaktívne (NR): Typicky hladký sivý vzor alebo skupina neagregovaných častíc uhlíka v strede testovacieho krúžku alebo veľký krúžok uhlíkových častíc bez zhlukovania vnútri. Reaktívne vzorky by mali byť zaznamenané ako pozitívne na protilátky a musia (s ohľadom na nešpecifickú povahu zistených protilátok) byť podrobené ďalším testom, aby sa zistila prítomnosť alebo neprítomnosť špecifických antitreponemálnych protilátok. Aby bola skúška platná, musí Positive Control dať silno reaktívny vzor a Negative Control musí dať jasne nereaktívny výsledok. 8. OBMEDZENIE TESTU Žiadny jednotlivý test alebo definitívny referenčný štandard nie je k dispozícii pre každú fázu choroby. Preto sa diagnóza syfilisu spolieha prevažne na sérologické testovanie vyžadujúce si výsledky netreponemálnych a treponemálnych metód. Falošne pozitívne výsledky môžu byť pozorované, ak čítanie neprebehne okamžite po otáčaní. Test uhlíkových častíc RPR nie je špecifický pre syfilis. Pre potvrdenie výsledkov musia byť všetky reaktívne vzorky opätovne testované pomocou treponemálnych metód, ako je TPHA. 9. FUNKČNÉ CHARAKTERISTIKY 9.1. Štúdia presnosti Panel vzoriek zostavený z jednej negatívnej vzorky, 1 nízko pozitívnej vzorky (titer 1:4) a 1 pozitívnej vzorky (titer 1:16) boli testované na opakovateľnosť v 8 replikách počas rovnakého testu. Pre účely štúdií medziľahlé presnosti a reprodukovateľnosti medzi dávkami boli testované vzorky vo 2 opakovaniach za deň po dobu 5 dní (čítanie dvoma rôznymi operátormi) a v dvoch rôznych dávkach. 9.1.1. Opakovateľnosť Všetky negatívne vzorky pri opakovaní dali negatívne výsledky a všetky pozitívne vzorky pri opakovaní dali pozitívne výsledky. 9.1.2. Medziľahlá presnosť/reprodukovateľnosť medzi dávkami Bez ohľadu na podmienky všetky negatívne vzorky pri opakovaní dali negatívne výsledky a všetky pozitívne vzorky pri opakovaní dali pozitívne výsledky. [SK] 8
9.2. Klinický výkon 9.2.1. Špecifickosť Štúdia špecifickosti bola retrospektívna štúdia vykonaná na 102 zmrazených vzorkách séra z rutiny laboratória Centra pre pohlavne prenosné choroby vo Francúzsku. Výsledky z testu RPR na syfilis boli porovnané s testom RPR/VDRL s označením CE. Celkový počet vzoriek 102 Počiatočne reaktívny (IR) 2 (nejednoznačné) Opakovane reaktívny (RR) 0 Špecifickosť RR (%) 100% 102/102 CI 95 % [96,4 % - 100,0 %] Zo 102 vzoriek boli 2 vzorky nejednoznačné. Po opakovanom testovaní boli všetky vzorky negatívne. Diagnostická špecifickosť na retrospektívnych vzorkách sa rovnala 102/102 = 100 % s intervalom spoľahlivosti na 95 % z [96,4 % - 100,0 %]. 9.2.2. Citlivosť Štúdia citlivosti bola retrospektívna štúdia vykonaná na 101 zmrazených vzorkách séra z rutiny laboratória Centra pre pohlavne prenosné choroby vo Francúzsku. Výsledky z testu RPR na syfilis boli porovnané s testom RPR/VDRL s označením CE. Celkový počet vzoriek 101 Počiatočne reaktívny (IR) 100 (1 nejednoznačný) Opakovane reaktívny (RR) 101 Špecifickosť RR (%) 100% 101/101 CI 95 % [96,4 % - 100,0 %] Zo 101 vzoriek bola 1 vzorka nejednoznačná. Po opakovanom testovaní boli všetky vzorky pozitívne. Diagnostická citlivosť na retrospektívnych vzorkách sa rovnala 100 % (101/101) s intervalom spoľahlivosti na 95 % z [96,4 % - 100,0 %]. 9.3. Štúdia analytickej špecifickosti - krížovej reaktivity Analytická špecifickosť testu Syfilis RPR bola hodnotená na celkom 65 krížom reagujúcich vzoriek vybraných tak, aby boli z iných infekčných chorôb a/alebo iných podmienok, ktoré môžu dať falošne pozitívny výsledok vzhľadom k nešpecifickosti (reumatoidný faktor, lymská borelióza, EBV, rubeola, leptospiróza, SLE (lupus), hepatitída B, hepatitída C, HIV ½, ženy, ktoré viackrát rodili, tehotné ženy). Získaná špecifickosť testu sa rovná 100,0 % (65/65) s intervalom spoľahlivosti 95 % z [94,5 % - 100,0 %]. [SK] 9
9.4. Prozónový efekt Tri (3) veľmi vysoko pozitívne vzorky na Ab syfilis (> 1:128) boli testované neriedené a riedené na overenie neprítomnosti prozónového efektu. Všetky neriedené pozitívne vzorky sú pozitívne. Žiadny prozónový efekt nie je pozorovaný u titrov až do 1:256. 10. BIBLIOGRAFICKÉ ODKAZY. 1. Larsen SA.,Pettit, et coll., EDTA treated plasma in the Rapid Plasma Reagin card test and the toluidine red unheated serum test for serodiagnosis of syphilis. J Clin Microbiology 1983;17;431-5 2. Larsen S.A., Pope V., et coll., A manual of Tests for Syphilis. 9th Edition ;1998; 193 207 3. Portnoy J. Modifications of the rapid plasma reagin (RPR) card test for syphilis, for use in large-scale testing.am J Clin Pathol;1963;40;473-9 4. Singh AE and Romanowski. Syphilis: Review with emphasis on clinical, epidemiological, and some biologic features. Clin Microbiol Rev. 1999 Apr; 12(2):187 209. 5. Stability of selected serum proteins after long-term storage in the Janus Serum Bank. Clin Chem Lab Med. 2009. 47:596-606. [SK] 10
[SK] 11
Bio-Rad 3, Boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33 2014/12 www.bio-rad.com 883684 [SK] 12