Identifikácia baktérií Moderná diagnostika (PCR, Maldi-TOF, Vitek 2 system)
Genetická identifikácia izolácia DNA, PCR reakcia, gélová elektroforéza, vizualizácia gélu, alebo priamo z PCR na sekvenáciu, porovnanie s databázou sekvencií Moderná multi-biochemická identifikácia mnohé biochemické testy v mikro-platniach vyhodnocované počítačom Fingerprintová identifikácia na základe zloženia bielkovín izolácia proteínov, detekcia proteínov na základe molekulovej hmotnosti a porovnaním s databázou hmotnostných spektier Možnosti identifikácie
Ribozomálna 16S RNA Súčasť malej podjednotky ribozómu 30S ináč nazývaná aj SSU rrna Má približne 7000 báz Má však svoje limity dokáže odlíšiť predkov, nie však v časovej následnosti, 97 % určuje podobnosť v rode, avšak existujú baktérie ako Thermospora bispora ktorá má viacero kópií 16S RNA s rozdielnosťou 6,4%, alebo podobnosť niektorých druhov v 16S RNA Do úvahy prichádza sekvenovať celé genómy Bežné izolačné metódy kombinácia extrakcie a zrážania DNA (fenol-chloroformová metóda) alebo izolácie pomocou kolóniek Izolácia DNA prvý krok
PCR polymerázová reťazová reakcia (Mullis, 1944) Je to metóda molekulárnej biológie, ktorá slúži na amplifikáciu (zmnoženie) molekuly DNA pomocou DNA-polymerázy Súčasti PCR reakcie: templát, primery, dntp, Taqpolymeráza, PCR pufor + MgCl2, deionizovaná sterilná voda Termocykler prístroj určený výlučne pre PCR reakcie, ktorý dokáže rýchlo meniť teplotu vzoriek, ktorá je potrebná pri samotnej PCR reakcii PCR metóda druhý krok
PCR reakcia pozostáva z troch cyklicky sa opakujúcich krokov (20 30 krát) 1. Denaturácia vplyvom tepla (>90 C) templát denaturuje 2. Anelácia teplotným poklesom (37-65 C) nastáva hybridizácia primerov na templátovú DNA 3. Polymerizácia zvýšením teploty na 72 C Taq-polymeráza syntetizuje nové vlákno z dntp 4. Záverečná polymerizácia tento krok prebehne len raz (slúži na "dobehnutie" všetkých polymerizačných reakcií, ktoré ešte prebiehajú Pomocou PCR reakcie sa dá získať dostatočné množstvo kópií DNA alebo jej úsekov na ďalšiu prácu s DNA (napr. pre elektroforetický gél) Priebeh PCR metódy
princíp: Molekuly NK (DNA, RNA) sa v elektrickom poli delia podľa náboja využíva sa schopnosť nabitých častíc pohybovať sa v el. poli ku opačne nabitým elektródam. nosič: GÉL agaróza - pre DNA v tlmivom roztoku: Tris-acetátový (TAE) Tris-borátový (TBE) Tris-fosfátový (TPE) polyakrylamid - pre bielkoviny Gélová elektroforéza - ELFO
pod transluminátorom (UV 300-360 nm) pomocou interkalačných farbív, ktoré sa viažu s prítomnými bázami napr. etídium-bromid, GoldView, SYBR-Green vyhodnotenie veľkosti fragmentov podľa štandardov (fragmentov DNA o známej dĺžke) Vizualizácia PCR produktu po skončení PCR reakcie v termocykleri na 2 % agarózovom géle L 1 2 3 4 5 6 7 8 L DNA Ladder (marker) 1 až 7 - PCR produkt (185 bp ) 8 negatívna kontrola (Master mix bez DNA) Vizualizácia DNA v géle
Replikované úseky genetického materiálu z PCR putujú priamo na sekvenovanie Sekvencie zo 16S RNA sú priamo porovnávané z databázou Podobnosť alebo zhoda sekvencií je vyhodnotená v percentách Sekvenovanie
Vitek 2 system je prístroj na identifikáciu baktérií a zároveň u nich testuje antibiotickú citlivosť Funguje na princípe biochemických testov, ktoré sú umiestnené v mikroplatničkách Rýchlosť identifikácie je obmedzená biochemickými reakciami v mikroplatničke (okolo 10 hodín) Vitek 2 system
Maldi TOF (Matrix assisted laser desorption/ionisation Time-of-light) Rýchla identifikácia bielkovín (10 s.) Na základe bielkovinového zloženia, dokáže podľa databázy identifikovať druh baktérie Maldi-TOF Mass Spectrofotometry Maldi - výsledky
Čistenie izolátov pomocou etanolu a vody Izolácia bielkovín z baktérií silná leptavá kyselina (kys. mravčia) a extrakčné činidlo (acetonitril) na bielkoviny (ribozomálne bielkoviny) Zmiešanie bielkovín z matricou (kys. škoricová) Kryštalizácia Ostreľovanie laserom nabitie (ionizácia) matrice odovzdanie náboja bielkovine prelet cez detektor (TOF) meranie rýchlosti preletu, detekcia hmostnosti bielkovín Automatické porovnávanie bielkovinového spektra s databázou identifikácia na úrovni druhu Maldi-TOF MS
Maldi-TOF MS - spektrá
Biochemické testy negatívna pozitívna Ureázový test urea broth na 1 liter destil. H 2 O - Močovina...20 g - Chlorid sodný...5 g - Monopotassium fosfát...2 g - Želatínový peptón...1 g - Glukóza...1 g - Fenolová červeň...0,012 g - ph...6,8 ± 0,2 pri 25 C Škrobový agar na 1 liter destil. H 2 O - Tryptón...5 g - Kvasničný extrakt...2,5 g - Glukóza...1 g - Škrob...10 g - Agar...10 g - ph...7,0 ± 0,2 pri 25 C - Prevrstviť iódom po očkovaní Praktické cvičenie
Biochemické testy Cukrová rada na 100 ml destil. H 2 O - Bakteriologický peptón...1 g - Príslušný cukor... 1 g - Bromthymolová modrá...1 ml - ph...7,2 ± 0,2 pri 25 C Použité cukry: glukóza, laktóza, sacharóza, arabinóza, manóza. Naplniť do skúmaviek, sterilizovať, nechať ochladnúť a očkovať. Kultivácia prebieha pri 37 C 24 hodín. Praktické cvičenie
Biochemické testy Cukrová rada Escherichia coli Praktické cvičenie
Escherichia coli Escherichia coli inactive Citrobacter freundii Citrobacter braakii Citrobacter farmeri Edwardsiella tarda Enterobacter c loacae Enteobacter aerogenes Hafnia alvei Klebsiella pneumoniae sups. pnuemoniae Klebsiella oxytoca Klebsiella terrigena Morganella morganii Proteus vulgaris Proteus mirabilis Salmonella enterica Serratia marcescens Serratia odorifera group 1 Serratia plymuthica Serratia rubidae Shigella flexneri Yersinia pestis Biochemické testy Cukrová rada Vyhodnotenie Testy / Baktérie Ureázový test 1 1 44 47 59 0 65 2 4 95 90 0 95 95 98 1 15 5 0 2 0 5 Glukóza - kyseliny 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Glukóza - plyn 95 5 93 96 96 100 100 100 98 97 97 80 90 85 96 96 55 0 40 30 3 0 Galaktóza 95 25 78 80 15 0 93 95 5 98 100 100 1 2 2 1 2 70 80 100 1 0 Fruktóza 95 80 100 100 100 100 100 99 100 98 100 100 0 97 0 97 96 100 94 99 30 80 Manit 98 93 100 100 100 0 100 100 99 99 99 100 0 0 0 100 99 100 100 100 95 97 Sacharóza 50 15 89 7 100 0 97 100 10 99 100 100 0 97 15 1 99 100 100 99 1 0 Praktické cvičenie