VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta chemická BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Brno, 2017 Slavomír Jagoš

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ Fakulta chemická BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Brno, 2017 Slavomír Jagoš

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FAKULTA CHEMICKÁ FACULTY OF CHEMISTRY ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY SROVNÁNÍ ÚČINNOSTI VYBRANÝCH ESTERIFIKAČNÍCH METOD COMPARISON OF EFFICIENCY OF SELECTED ESTERIFICATION METHODS BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS AUTOR PRÁCE AUTHOR Slavomír Jagoš VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR Ing. Eva Vítová, Ph.D. BRNO 2017

Zadání bakalářské práce Číslo práce: FCH-BAK1097/2016 Ústav: Ústav chemie potravin a biotechnologií Student: Slavomír Jagoš Studijní program: Chemie a technologie potravin Studijní obor: Biotechnologie Vedoucí práce: Ing. Eva Vítová, Ph.D. Akademický rok: 2016/17 Název bakalářské práce: Srovnání účinnosti vybraných esterifikačních metod Zadání bakalářské práce: 1. Zpracujte literární přehled dané problematiky: lipidy charakteristika, rozdělení, vlastnosti mastné kyseliny charakteristika, rozdělení, vlastnosti možnosti stanovení mastných kyselin plynová chromatografie princip, popis, instrumentace, provedení 2. Pomocí metody GC FID identifikujte a kvantifikujte mastné kyseliny ve vzorcích olejů s aplikací různých esterifikačních metod 3. Porovnejte obsah mastných kyselin v jednotlivých vzorcích 4. Srovnejte výhody a nevýhody vybraných esterifikačních metod Termín odevzdání bakalářské práce: 26.5.2017 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu. Toto zadání je součástí bakalářské práce. Slavomír Jagoš student(ka) Ing. Eva Vítová, Ph.D. vedoucí práce prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. vedoucí ústavu V Brně dne 31.1.2017 prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D. děkan Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně / Purkyňova 464/118 / 612 00 / Brno

ABSTRAKT Táto bakalárska práca sa zaoberá optimalizáciou metódy pre stanovenie mastných kyselín. V teoretickej časti sú stručne charakterizované lipidy, mastné kyseliny a ich stanovenie pomocou plynovej chromatografie s plameňovo-ionizačnou detekciou. Cieľom experimentálnej časti práce bolo vyskúšať a porovnať tri typy esterifikačných metód: bázickú s metanolickým roztokom KOH a kyslú s metanolickým roztokom HCl alebo bortrifluoridom. Na základe zhodnotenia metód z hľadiska výťažku, dostupnosti a bezpečnosti chemikálii, na jednoduchosti a rýchlosti prevedenia bola vybraná metóda s použitím metanolického roztoku bortrifluoridu. ABSTRACT The present thesis aims to determine the optimal method of analysis of fatty acids. The theoretical part offers a concise introduction to lipids, fatty acids and their analysis using gas chromatography with flame-ionization detection. The goal of the experimental part of this thesis was to test and compare three different types of esterification methods: basic esterification with methanolic solution of potassium hydroxide, acidic esterification with methanolic solution of hydrochloric acid and acidic esterification with boron trifluoride. By evaluating these methods from various aspects, including their yield, availability and safety of the used chemicals, and simplicity and speed of application, the suggested optimal method is the acidic esterification with boron trifluoride. KĽÚČOVÉ SLOVÁ Oleje, mastné kyseliny, GC-FID KEYWORDS oils, fatty acids, GC-FID 3

JAGOŠ, S. Srovnání účinnosti vybraných esterifikačních metod. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2017. 38 s. Vedoucí bakalářské práce Ing. Eva Vítová, Ph.D. PREHLÁSENIE Prehlasujem, že som bakalársku prácu vypracoval samostatne a že všetky použité literárne zdroje boli správne a úplne citované. Bakalárska práca je z hľadiska obsahu majetkom Fakulty chemickej VUT v Brne a môže byť použitá ku komerčným účelom len so súhlasom vedúceho bakalárskej práce a dekana FCH VUT.... podpis študenta POĎAKOVANIE V prvom rade chcem poďakovať svojej vedúcej práce Ing. Evě Vítové, Ph.D. za odborné rady a čas strávený pri konzultáciach. Ďalej by som rád poďakoval celému kolektívu v laboratóriu, a ich ochotu, ústretovosť a spoločne strávený čas. Takisto by som rád poďakoval RNDr. Marii Polcerové, Ph.D., ktorá mi bola ochotná vždy pomôcť, bez ohľadu na intenzitu mojich nepríjemných a sarkastických poznámok. Ďalej by som rád poďakoval prof. RNDr. Ivane Márové, CSc. za cenné rady a konzultácie ohľadom môjho štúdia. 4

OBSAH 1 Úvod... 7 2 Teoretická časť... 8 2.1 Lipidy... 8 2.1.1 Homolipidy... 8 2.1.2 Heterolipidy... 9 2.1.3 Komplexné lipidy... 9 2.2 Mastné kyseliny... 9 2.2.1 Nasýtené mastné kyseliny... 10 2.2.2 Nenasýtené mastné kyseliny s jednou dvojnou väzbou... 10 2.2.3 Nenasýtené mastné kyseliny s dvoma a viac dvojnými väzbami... 11 2.3 Stanovenie mastných kyselín a lipidov... 12 2.3.1 Esterifikácia... 12 2.4 Plynová chromatografia... 14 2.4.1 Princíp plynovej chromatografie... 14 2.4.2 Inštrumentácia plynovej chromatografie... 15 3 Experimentálna časť... 18 3.1 Laboratórne vybavenie a chemikálie... 18 3.1.1 Plyny... 18 3.1.2 Prístroje... 18 3.1.3 Pracovné pomôcky... 18 3.1.4 Chemikálie... 18 3.2 Analyzované vzorky... 19 3.3 Použité metódy a postupy... 19 3.3.1 Esterifikácia mastných kyselín... 19 3.3.2 Stanovenie metylesterov mastných kyselín metódou GC-FID... 20 3.4 Štatistické spracovanie výsledkov... 21 4 Výsledky a diskusia... 22 4.1 Identifikácia mastných kyselín vo vzorkách oleja... 22 4.2 Porovnanie esterifikačných metód... 23 5 Záver... 30 6 Zoznam použitých zdrojov... 31 7 Zoznam použitých skratiek... 33 5

8 Prílohy... 34 6

1 ÚVOD Tuky sú veľmi dôležitou súčasťou potravín. Dodávajú potravinám chuť, textúru, vôňu a z energetického hľadiska sú najbohatšími zložkami. Významnou časťou tukov sú mastné kyseliny. Mastných kyselín sa v lipidoch nachádza viacero druhov, ktoré sa odlišujú navzájom rôznymi fyzikálnymi vlastnosťami. Jednou z možností ako stanoviť tieto látky je využitím štandardnej metódy plynovej chromatografie v spojení s plameňovo-ionizačným detektorom (GC-FID). Priame stanovenie pomocou GC-FID je výrazne obmedzené, vzhľadom k nízkej prchavosti týchto látok. V tomto prípade sa využívajú rôzne derivatizačné postupy, ktoré tieto látky prevádzajú na látky s vyššou prchavosťou, čo už vyhovuje podmienkam stanovenia pomocou GC-FID Cieľom tejto práce bolo porovnať a optimalizovať esterifikačné metódy pre stanovenie mastných kyselín. Ako vzorky na porovnanie esterifikaňých metód boli použité rôzne druhy slnečnicového oleja. 7

2 TEORETICKÁ ČASŤ Vzhľadom k zameraniu tejto práce sú v nasledujúcich kapitolách charakterizované lipidy, mastné kyseliny ako ich hlavné zložky a stručne je zmienený princíp plynovej chromatografie ako najčastejšej metódy používanej pre ich stanovení. 2.1 Lipidy Lipidy sú látky prírodného aj živočíšneho pôvodu. Môžu byť v pevnom alebo kvapalnom skupenstve. Patria k významným zložkám potravín a pre človeka sú podstatnou časťou výživy. Takisto majú nepochybne veľký význam pre vývoj organizmu. Sú zdrojom energie, jedná sa o energeticky najbohatšiu zložku potravín vzhľadom k relatívne vysokému obsahu vodíku. Tvoria biomembrány a sú transportným prostriedkom pre niektoré vitamíny. Ďalej majú štruktúrnu a ochrannú funkciu ako mechanická opora orgánov a ako izolačná bariéra zabraňujúca strate tepla a vody. Napriek všetkému nepredstavujú jednotne definovanú skupinu zlúčenín, pretože hlavným kritériom zaradenia látok do tejto skupiny je hydrofóbnosť a nie ich chemické vlastnosti. Zo štruktúrneho hľadiska sú lipidy estery mastných kyselín a alkoholov alebo ich derivátov. Sú teda rozpustné v nepolárnych rozpúšťadlách (chloroform, benzén), ale nerozpustné v polárnych rozpúšťadlách (voda). V praxi sa väčšinou za lipidy považujú tiež neprchavé lipofilné zlúčeniny, ktoré v prírodných či priemyselných produktoch sprevádzajú vlastné lipidy. Preto sa nazývajú sprevádzajúce látky lipidov. Ich chemická štruktúra je ale odlišná a často neobsahujú viazané mastné kyseliny. Do tejto skupiny sprevádzajúcich látok patrí veľké množstvo zlúčenín, ako napr. terpenoidy, karotenoidy, farbivá, antioxidanty a iné lipofilné zlúčeniny. Bežne delíme lipidy do troch skupín: Homolipidy Heterolipidy Komplexné lipidy Voľné mastné kyseliny sa ťažko zaradzujú, pretože nemajú viazaný alkoholový zvyšok. Napriek tomu sú považované za lipidy, ale mali by tvoriť samostatnú skupinu. Taktiež sa môžeme stretnúť s delením na polárne a neutrálne lipidy. Toto delenie je založené predovšetkým na chovaniu látok pri chromatografickom delení. K neutrálnym lipidom priradzujeme estery glycerolu,(obrázok 1) steroly ale aj voľné mastné kyseliny, pretože nie sú neutrálne. K polárnym lipidom patrí veľa heterolipidov a fosfolipidy. V potravinárskom priemysle lipidy delíme na tuky, oleje, mastné kyseliny, vosky a lecitin. [1,2] 2.1.1 Homolipidy Homolipidy sú zlúčeniny mastných kyselín a alkoholov. Ďalej sa delia podľa štruktúry viazaného alkoholu. Patria sem acylglyceroly(obrázok 1) a vosky. Acylglyceroly sú estery mastných kyselín s glycerolom. Podľa skupenstva sa označujú názvami tuky s vyšším obsahom nasýtených matných kyselín, alebo oleje kde prevažujú nenasýtené mastné kyseliny. Acylglyceroly sú hlavnými zložkami rezervného tuku, ide o zmes esterov rôznych mastných kyselín, ktoré sú sprevádzané rôznymi hydrofóbnymi látkami, ako sú fosfolipidy, steroly, karotenoidy a iné. Živočíšne tuky sú uložené v podkožných tkanivách, zatiaľ čo rastlinné tuky sa nachádzajú v semenách a niektorých plodoch. Pri hydrolýze triacylglycerolov vznikajú voľné mastné kyseliny a glycerol. Vosky sú tuhé estery vyšších mastných kyselín a vyšších primárnych alkoholov. Sú vo vode nerozpustné. V živočíšnych voskoch prevažujú alkoholy so 14 až 18 uhlíkmi, v rastlinných voskoch alkoholy s 26 až 30 uhlíkmi. Vosky majú najmä 8

ochrannú funkciu. V rastlinách sa nachádzajú na povrchoch listoch a stonkách, u živočíchov pokrývajú kožu a srsť. [1,2] 2.1.2 Heterolipidy Heterolipidy sú lipidy, ktoré obsahujú okrem mastných kyselín a alkoholu ešte ďalšie kovalentne viazané zlúčeniny, podľa ktorých sa delia na fosfolipidy, glykolipidy a sulfolipidy. Medzi najrozšírenejšie heterolipidy patria fosfolipidy, ktoré v hydrofilnej časti obsahujú kyselinu fosforečnú, s ktorou sú estericky spojené vo forme esteru alebo diesteru. Sú stavebnými jednotkami všetkých biomembrán, najväčšie zastúpenie majú v mozgu, v obaloch nervových buniek a u rastlín v semenách. [1,2] 2.1.3 Komplexné lipidy Komplexné lipidy sú makromolekulárne látky, ktoré obsahujú aj homolipidy aj heterolipidy. Okrem kovalentných väzieb sú niektoré zložky viazané rôznymi fyzikálnymi väzbami, napr. vodíkovými mostíkmi alebo hydrofóbnymi interakciami. Nelipidovou zložkou býva najčastejšie protein, polysacharid alebo ich zmes. Lipoproteiny sú najdôležitejšie a najpreskúmanejšie komplexné lipidy. Sú zložené z bielkovín a lipidov, pričom proteiny tvoria obal a lipidy jadro. Práve preto sa lipoproteiny dispergujú vo vode a slúžia ako transport lipidov. [1,2] Obrázok 1 Esterifikácia glycerolu za vzniku 1-monoacylglycerolu, 1,3-diacylglycerolu a 1,2,3- triacylglycerolu [3] 2.2 Mastné kyseliny Mastné kyseliny sú najdôležitejšou zložkou lipidov. Podľa názvoslovia, ktoré sa používa v organickej chémii, sa ako mastné kyseliny označujú karboxylové kyseliny s alifatickým uhľovodíkovým reťazcom. Táto definícia sa ale úplne nekryje s mastnými kyselinami prítomnými v lipidoch. Až na niektoré výnimky sú tvorené dlhým nerozvetveným reťazcom. V prírode je známych viac ako 50 rôznych mastných kyselín. Sú tvorené párnym počtom atómov uhlíku, čo je pre mastné kyseliny charakteristická črta. Vychádza to z ich biosyntézy vznikajú spájaním C2 jednotiek. Základné rozdelenie mastných kyselín je podľa prítomnosti dvojných väzieb na nasýtené a nenasýtené(tabuľka 1). Spolu so stupňom nasýtenosti sa menia aj fyzikálne vlastnosti mastných kyselín. V živých organizmoch prevládajú nenasýtené mastné kyseliny s rôznym počtom dvojných väzieb. V prírode a v potravinách sú rozoznávané nasledujúce skupiny mastných kyselín: Nasýtené mastné kyseliny Nenasýtené mastné kyseliny s jednou dvojnou väzbou (monoénové) Nenasýtené mastné kyseliny s viacerými dvojnými väzbami (polyénové) 9

Mastné kyseliny s trojitými väzbami a s rôznymi substituentmi (rozvetvené, cyklické, s rôznymi funkčnými skupinami). [1,2] Tabuľka 1 Prehľad najdôležitejších mastných kyselín [2] Druh Mastná kyselina Triviálny názov Cx:poč. dvojných väzieb dodekanová laurová 12:0 tetradekanová myristová 14:0 Nasýtená hexadekanová palmitová 16:0 oktadekanová stearová 18:0 eikosanová arachová 20:0 hexadecenová palmitolejová 16:1 oktadecenová olejová 18:1 Nenasýtená oktadekadiénová linolová 18:2 oktadekatriénová α-linolenová 18:3 eikosatetraénová arachidonová 20:4 2.2.1 Nasýtené mastné kyseliny Skupina nasýtených mastných kyselín neobsahuje žiadnu dvojnú väzbu (Obrázok 2). Zo všetkých mastných kyselín a prírodných lipidov predstavujú asi 10-40 % (Tabuľka 2). Ide o molekuly s veľkým počtom konformácii vďaka pomerne voľnej rotácii okolo každej z väzieb C-C. Energeticky najvýhodnejšia je úplne natiahnutá konformácia, teda majú väčšinou rovný, nerozvetvený reťazec. Teplota topenia je závislá na molekulovej hmotnosti nižšie mastné kyseliny sú kvapalné, od mastných kyselín s počtom uhlíkov 10 a viac sa jedná o tuhé látky. Niekedy sa môžeme stretnúť s názvom saturované (z anglického Saturated Fatty Acids SFA). [1,2] Tabuľka 2 Nasýtené mastné kyseliny vyskytujúce sa v lipidoch [2] Mastná kyselina Triviálny názov Počet atómov uhlíkov butanová maslová 4 hexanová kaprónová 6 oktanová kaprylová 8 dekanová kaprinová 10 dodekanová laurová 12 tetradekanová myristová 14 hexadekanová plamitová 16 oktadekanová stearová 18 eikosanová arachová 20 Obrázok 2 Štruktúrny vzorec kyseliny stearovej [3] 2.2.2 Nenasýtené mastné kyseliny s jednou dvojnou väzbou Monoénové mastné kyseliny obsahujú jednu dvojnú väzbu (Obrázok 3) (anglicky Monounsaturated Fatty Acids MUFA). Okrem polohy dvojnej väzby sa líšia tiež 10

v priestorovej konfigurácii. Konfigurácia cis býva prirodzenejšia, trans konfigurácia menej. Trans-izoméry nenasýtených mastných kyselín sa niektorými vlastnosťami podobajú nasýteným mastným kyselinám. Monoénové kyseliny sú oproti nasýteným mastným kyselinám reaktívnejšie (napr. samovoľná oxidácia na vzduchu). Taktiež sú dôležitou štruktúrou bunkových membrán, predovšetkým myelinu v nervových tkanivách. Dvojná väzba sa zvykne opakovať medzi atómami uhlíku C9 a C10 (Tabuľka 3). [1,2] Tabuľka 3 Prehľad hlavných monoénových kyselín [2] Počet Mastná Triviálny atómov kyselina názov uhlíkov Poloha dvojnej väzby Izomér decenová kaprolejová 10 9 cis dodecenová laurolejová 12 9 cis tetradecenová myristolejová 14 9 cis hexadecenová palmitolejová 16 9 cis oktadecenová olejová 18 9 cis oktadecenová elaidová 18 9 trans dokosenová eruková 20 13 cis Obrázok 3 Štruktúrny vzorec kyseliny olejovej [3] 2.2.3 Nenasýtené mastné kyseliny s dvoma a viac dvojnými väzbami Polyénové mastné kyseliny (anglicky Polyunsaturated Fatty Acids PUFA) obsahujú viac dvojných väzieb. U polyénových mastných kyselín sa vyskytujú polohové a priestorové izoméry. Veľmi významnou skupinou sú kyseliny typu n-3 a n-6 (podľa polohy dvojnej väzby v cis konfigurácii) (Tabuľka 4). Tu sa môžeme stretnúť s onačením omega-3 a omega-6 kyseliny. Niektoré polyénové kyseliny patria medzi tzv. esenciálne mastné kyseliny. Nasýtené a nenasýtené monoénové mastné kyseliny si ľudské telo dokáže nasyntetizovať samo; esenciálne mastné kyseliny musíme prijať zo stravy. Dobrým zdrojom esenciálnych mastných kyselín sú rôzne druhy semien a orechov a olejov z nich vyrobené. Nedostatky týchto esenciálnych mastných kyselín môžu spôsobiť poruchy rastu, vývoja a tiež môžu spôsobiť rôzne neurologické ochorenia. [1,2] Tabuľka 4 Prehľad polyénových mastných kyselín [2] Mastná kyselina Triviálny názov Počet atómov uhlíkov Poloha dvojnej väzby oktadekadiénová linolová 18 9, 12 oktadekadiénová γ-linolenová 18 6, 9, 12 eikosatetraénová arachidonová 20 5, 8, 11, 14 11

2.3 Stanovenie mastných kyselín a lipidov V dnešnej dobe poznáme veľmi veľa inštrumentálnych metód pre analýzu lipidov. Nižšie je uvedený prehľad tých najdôležitejších, ich výhody a nevýhody. Vzhľadom k zameraniu tejto práce je najväčšia pozornosť venovaná plynovej chromatografii. [4] Chromatografia na tenkej vrstve (TLC) je založená na separácii na stacionárnej fáze, na základe rôznej polarity analyzovaných zložiek. V oblasti lipidov sa TLC v poslednej dobe využíva hlavne na rýchlu separáciu lipidických tried. TLC je relatívne lacná záležitosť a v podstate patrí medzi rýchle metódy. Rôzne variácie mobilnej fázy umožňujú separáciu aj zložitých zmesí. Nevýhodou môže byť oxidácia nenasýtených mastných kyselín v prípade dlhšej expozície TLC dosky na vzdušnom kyslíku. 5 Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) je založená na separácii na stacionárnej fáze, pod vysokým tlakom s použitím rôznych rozpúšťadiel ako mobilnej fázy. V tejto metóde je dosiahnutá účinná separácia s možnosťou prepojenia HPLC s hmotnostnou spektrometriou. Používa sa k stanoveniu mastných kyselín alebo k ich predbežnej separácii. Mastné kyseliny delí na základe ich polarity (kolóny s normálnou alebo obrátenou fázou), stupne nasýtenia (silver-ion HPLC) alebo chirality (chirálna HPLC). 4,6,7 Plynová chromatografia (GC) je metóda využívaná k separácii prchavých látok. Detekcia je často prevádzaná hmotnostnou spektrometriou. Mäkká ionizačná hmotnostná spektrometria, typy MALDI (k splyneniu, degradácii a ionizácii molekúl vo vzorke sa používa dusíkový laser pri 337 nm) a ESI MS (tzv. elektrosprejová ionizácia) umožňujú analýzu lipidov bez väčších fragmentácii analytu. Obe metódy sú veľmi citlivé a umožňujú priamu detekciu analytu. Nukleárna magnetická rezonančná spektroskopia (NMR) je fyzikálno-chemická metóda využívajúca interakcie atómových jadier s magnetickým polom. NMR spektroskopiou sa dá určiť zloženie, štruktúra a množstvo molekúl skúmanej látky. Takmer všetky lipidy sú zistiteľné touto metódou.[4,8] 2.3.1 Esterifikácia Stanovenie mastných kyselín plynovou chromatografiou si vyžaduje tzv. derivatizáciu, pretože voľné aj viazané mastné kyseliny nie sú dostatočne prchavé. Pojem derivatizácia zahŕňa chemickú úpravu analytu, predovšetkým pre zvýšenie prchavosti. Mastné kyseliny sú najčastejšie prevádzané na metylestery (MEMK). Tak isto môžu byť prevedené aj na vyššie estery, ale metylestery majú radu výhod: najväčšia prchavosť zo všetkých esterov, vysoké výťažky a široké spektrum zavedených metylačných metód. Existuje niekoľko spôsobov prípravy metylesterov. Vzhľadom k tomu, že ide o reverzibilné reakcie, je potreba prítomnosti katalyzátoru, na základe toho sa esterifikačné metódy delia na dve základné skupiny: kyslo a bázicky katalyzovaná esterifikácia. V Tabuľke 5 sú porovnané výhody a nevýhody obidvoch typov metód.[9] 12

Tabuľka 5 Porovnanie kyslo a bázicky katalyzovanej esterifikácie 10 Kyslá Bázická Teplota vysoká stredná (laboratórna) Doba minúty hodiny sekundy minúty Esterifikačná sila stredná vysoká žiadna Transesterifikačná sila nízka vysoká Riziko saponifikácie nízka vysoká Vodná interferencia nízka vysoká 2.3.1.1 Kyslo katalyzovaná esterifikácia Reakcie s kyslou katalýzou pre urýchlenie procesu je treba zahrievať. Ako katalyzátory sa požívajú HCl, H2SO4 a BF3. Schéma kyslo katalyzovanej esterifikácie a transesterifikácie je uvedené na Obrázku 4 a Obrázku 5. Voľné mastné kyseliny sú esterifikované zahrievaním v prebytku bezvodného metanolu v prítomnosti kyslých katalyzátorov. Prítomnosť vody môže zabrániť úplnej reakcii. Najčastejším činidlom je 5% bezvodná kyselina chlorovodíková v metanole, ktorá je najčastejšie pripravovaná prebublávaním suchého metanolu chlorovodíkom. S 1 2% roztokom koncentrovanej H2SO4 v metanole prebieha esterifikácia rovnakým spôsobom. Obvykle sa vzorka lipidov s činidlom zahrieva zhruba 2 hodiny pod spätným chladičom. Medzi ďalšie katalyzátory patrí BF3 v metanole, ako rýchly prostriedok esterifikujúci voľné mastné kyseliny. Pri nedbalom používaní činidiel, napríklad pri použití príliš starých alebo príliš koncentrovaných roztokov, však môže dôjsť k rozkladu alebo k značnej strate PUFA. Nepolárne lipidy ako estery cholesterolu alebo triacylglycerolu nie sú rozpustné v činidlách zložených prevažne z metanolu, teda musí byť pridané ďalšie rozpúšťadlo Pre tieto účely bol kedysi používaný benzén, ale kvôli jeho vysokej toxicite je vhodnejšie použiť iné rozpúšťadlá, ako napr. toluén alebo tetrahydrofurán. Vzniknuté metylestery mastných kyselín sú po samotnej esterifikácii vytrepávané do organického rozpúšťadla akým je hexán alebo heptán. Táto zmes je vysušená bezvodným síranom sodným. Prípadný prebytok rozpúšťadla môže byť odstránený za zníženého tlaku na rotačnej vákuovej odparke alebo odparením rozpúšťadla v prúde dusíku alebo hélia.[8,11] Obrázok 4 Schéma kyslo katalyzovanej esterifikácie [12] 13

Obrázok 5 Schéma kyslo katalyzovanej transesterifikácie [12] 2.3.1.2 Bázicky katalyzovaná esterifikácia Pri bázickej katalýze je esterifikácia rýchlejšia, stačia mierne podmienky. Schéma bázicky katalyzovanej esterifikácie je uvedené na Obrázku 6. Lipidy sú esterifikované veľmi rýchlo v bezvodnom metanole v prítomnosti bázického katalyzátoru. Najbežnejším činidlom bázicky katalyzovaných reakcí je roztok metoxidu sodného v bezvodnom metanole, ktorý sa pripravuje rozpustením čistého sodíku v suchom metanole. Medzi ďalšie používané činidlá patrí metoxid draselný alebo hydroxid draselný či hydroxid sodný v metanole. Metylestery mastných kyselín sú rovnako ako v prípade kyslo katalyzovaných reakcí extrahované do hexánu alebo heptánu. Oddelená hexánová vrstva je následne sušená bezvodým síranom sodným. Podobne ako u kyslo katalyzovaných esterifikácii je nutné pre rozpustenie nepolárnych lipidov akými sú estery cholesterolu pridať ďalšie rozpúšťadlo, akým je opäť napr. tetrahydrofurán.[8,13] Obrázok 6 Schéma bázicky katalyzovanej transesterifikácie [12] 2.4 Plynová chromatografia Plynová chromatografia (GC) nesie svoje označenie podľa skupenstva v ktorom sa nachádza mobilná fáza, ktorá je plyn (Obrázok 7). Je to separačná metóda pri ktorej sa separujú zložky obsiahnuté vo vzorke. Používa sa pre kvantitatívne aj kvalitatívne analýzy vzorky. GC je vhodná pre analýzu prchavých látok, ktoré je možno previesť do plynného skupenstva s bodom varu menším ako 400 C. GC je najrozšírenejšou technikou pre stanovenie profilu mastných kyselín; a je to oficiálna metóda uznávaná spoločnosťou American Oil Chemist s Society.[14,15,16] 2.4.1 Princíp plynovej chromatografie Vzorka sa nanáša medzi dve vzájomne nemiesiteľné fázy. Stacionárna fáza je nepohyblivá, mobilná fáza je pohyblivá, nazýva sa nosný plyn. Ten prenáša analyt kolónou. Aby mohla byť vzorka prenášaná, musí sa ihneď premeniť na plyn. Pre separáciu sa využíva rozdelenie koncentrácie analytu medzi stacionárnu a mobilnú fázu na základe adsorpcie alebo rozpustnosti a analyt je postupne eluovaný interným nosným plynom. Zložky opúšťajúce kolónu sú 14

indikované detektorom. Signál detektoru sa vyhodnocuje a z časového priebehu intenzity signálu sa určí druh a množstvo zastúpenia zložiek.[15,16] Obrázok 7 Zjednodušená schéma plynovej chromatografie [17] 2.4.2 Inštrumentácia plynovej chromatografie Zariadenie pre plynovú chromatografiu sa skladá zo zdroja nosného plynu, čistiaceho zariadenia, dávkovača (injektoru), chromatografickej kolóny umiestnenej v termostate, detektoru a vyhodnocovacieho zariadenia.[14] 2.4.2.1 Zdroj nosného plynu Zdrojom nosného plynu je tlaková nádoba, obsahujúca podľa zvoleného spôsobu detekcie separovaných zložiek vodík, dusík, hélium alebo argón. Nádoby sú plnené maximálne na tlak 20 MPa a sú označované unikátnymi farbami podľa plynu.. Voľba nosného plynu ma vplyv na separačnú účinnosť v dôsledku rozdielnych difúznych koeficientov zložiek v rôznych plynoch. Pri výbere plynu sa dbá na toxicitu, bezpečnosť práce a cenu. 2.4.2.2 Čistiace zariadenie Zachytáva vlhkosť a nečistoty v nosnom plyne. Zbavuje nosný plyn nežiadúcich stôp iných plynov. [14] 2.4.2.3 Regulačný systém Regulačný systém zaisťuje kontinuálny alebo periodicky sa meniaci prietok nosného plynu. Rozlišujú sa mechanické a elektronické regulátory a regulátory podľa konštantného tlaku alebo prietoku. Elektronickou reguláciou sa dá docieliť stanovený prietok i pri zmenách teploty pri priebehu separácie. [14,15] 2.4.2.4 Dávkovač (injektor) Dávkovač slúži k zavedeniu vzorky do prúdu nosného plynu a prevedenie do plynného stavu (Obrázok 8). Prevádza sa mikrostriekačkou cez tesnenie uzatvárajúce vnútorný priestor dávkovača. Objem vzorky, ktorý je možno previesť do separačnej kolóny, je veľmi malý (0,01 0,1µl), preto je väčšinou nutné v dávkovači oddeliť definovaný podiel vzorky mimo kolónu (pomocou deliča toku). Pre plynné vzorky sa používajú plynotesné injekčné striekačky alebo obtokové dávkovacie kohúty rôznych konštrukcii. Dávkovanie vzorky sa dá prevádzať dvoma spôsobmi, nad ústim kolóny a priamo na kolónu. Prvý spôsob je využívaný pre náplňové kolóny, druhý spôsob sa uplatňuje pri kapilárnych kolónach. Dávkovanie priamo na kolónu sa robí rôznymi spôsobmi, dávkovanie priamo 15

do kolóny (on column), pomocou deliča toku (split injection), bez deliča toku (splitless injection).[14] 2.4.2.5 Kolóny Obrázok 8 Schéma injektoru [17] V plynovej chromatografii sa používajú náplňové alebo kapilárne kolóny. Náplňové kolóny sú kovové alebo sklenené trubice s priemerom 2 6 mm a dĺžkou 1 5 m. Plnia sa adsorbentami na báze silikagélu, aktívneho uhlia alebo aluminy. Nosičom kvapalnej fázy pre rozdeľovacie chromatografiu je napr. kremelina. Ako molekulové sitá sa používajú hlinitokremičitany. Ako zakotvené fázy sa používajú neprchavé, pri použitej teplote chemicky inertné kvapaliny, ktoré sa zakotvujú na povrch inertných nosičov. Používajú sa stacionárne fázy rôznej polarity na princípe siloxanov a polyetylenglykolov, esterov, uhľovodíkov, silikónových olejov a ďalších. Kapilárne kolóny sú sklenené, kremenné, plastové (polyamdy, polyestery, teflón) alebo kovové. Ich vnútorné steny obsahujú film so stacionárnou fázou alebo sú kapiláry naplnené stacionárnou fázou v celom objeme. Kapilárne kolóny dosahujú veľmi vysoké separačné výsledky, sú však obmedzené malým množstvom dávkovanej vzorky. V dnešnej dobe sa už konštruujú kovové kolóny s vnútornou kremennou stenou alebo kremenné kapiláry potiahnuté polyimidom. Polyimid dáva krehkému materiálu kolóny pružnosť a chráni ho pred zlomením. Podľa uloženia stacionárnej fázy rozlišujeme tri typy kapilárnych kolón: Kolóny s kvapalinou zachytenou na vnútorných stenách kapilárnej trubice (WCOT Wall Coated Open Tubular) Kolóny s kvapalinou zakotvenou na nosiči, ktorý je zachytený na vnútorných stenách kapiláry (SCOT Support Coaed Open Tubular) Kolóny s adsorbentom, ktorý je zachytený na vnútorných stenách kapilárnej trubice (PLOT Porous Layer Open Tubular) [14,15,16] 16

2.4.2.6 Detektory Detektory sú zariadenia v ktorých je fyzikálno-chemická vlastnosť analytu prevedená na zmerateľný, väčšinou elektrický signál. Nosný plyn z kolóny prechádza detektorom, ktorý zaznamenáva prítomnosť analytu a vysiela signál v závislosti na čase. Detektory umožňujú registráciu jednotlivých zón separovateľných zložiek, ich identifikáciu a kvantifikáciu. Ideálny detektor pre GC by mal mať vysokú citlivosť, dobrú stabilitu a reprodukovateľnosť signálu, skoro žiadny šum, rýchlu odozvu, teplotný rozsah minimálne do 400 C a obdobnú odozvu pre všetky analyty. Pre stanovenie mastných kyselín je najčastejšie využívaný nižšie charakterizovaný plameňový ionizačný detektor. Plameňový ionizačný detektor (FID) je univerzálny detektor pre organické zlúčeniny. Pôvodne sa predpokladalo že ionizačný mechanizmus v plameni FID je podobný ionizačnému procesu v uhľovodíkovom plameni. V súčasnosti sa prijalo vysvetlenie, že ionty nevznikajú termálnou ionizáciou, ale termálnou emisiou z mikroskopických uhlíkových čiastočiek, ktoré vznikajú behom procesu spaľovania. Preto dominantným faktorom pri ionizácii organických látok nie je ich ionizačný potenciál, ale závislosť na uhlíku, ktorý prechodne vzniká behom horenia. Plazma v plameni obsahuje ako kladné ionty, tak elektróny ktoré sú zbierané buď na tryske alebo elektróde v závislosti na polarite vloženého napätia. Toto napätie je tiež závislé na vzdialenosti elektród. Detektor FID je pravdepodobne najjednoduchším, najľahším a najspoľahlivejším z používaných detektorov. Spaľovaním organických látok vo vodíkovom plameni dochádza k ionizácii. Molekuly organických látok, ktoré sa dostanú do plameňa, sú štiepené na fragmenty iontového alebo radikálového typu. Tieto ionty alebo radikály sa na prvej elektróde nabijú na určitý potenciál a sú priťahované druhou elektródou, na ktorej svoj náboj odovzdajú. Vzniknutý ionizačný prúd, ktorý medzi elektródami preteká, je priamo úmerný počte iontov. Odozva tohto typu detektoru je závislá na počte uhlíkov v separovanej molekule, na charaktere väzieb C-C a na počte ostatných atómov v molekule. [14,15,16] Obrázok 9 Plameňový ionizačný detektor (FID) [17] 17

3 EXPERIMENTÁLNA ČASŤ 3.1 Laboratórne vybavenie a chemikálie 3.1.1 Plyny Dusík 5.0 SIAD v tlakovej bombe s redukčným ventilom a kovovou membránou Vodík 5.5 SIAD v tlakovej bombe s redukčným ventilom Vzduch 5.0 SIAD v tlakovej bombe s redukčným ventilom pre kyslík 3.1.2 Prístroje Plynový chromatograf TRACE GC (Thermoquest Italia S. p. A., Taliansko) s plameňovo-ionizačným detektorom, split/splitless injektorom a kapilárnou kolónou DB-23 o rozmeroch 60 m x 0,25 mm x 0,25 µm Počítač PC, Intel Pentium Procesor Analytické digitálne váhy HeLAGO, GR-202-EC, Taliansko Ohrevné hniezdo 100 ml, Drutěva v.d, Česká republika Chladničky Vodná kúpeľ so stojanmi, Julabo TW2 Digestor Sušiareň, Memmert Vákuová rotačná odparka, KIKA WERKE-RVO6-ML, s príslušenstvom 3.1.3 Pracovné pomôcky Mikropipeta Biohit-Proline (0,5 1000 µl) Bežné laboratórne sklo Vialky 3.1.4 Chemikálie 3.1.4.1 Chemikálie pre bázickú esterifikáciu Isooktán p. a., Lach-Ner, Česká republika Hydroxid draselný p. a., Lach-Ner, Česká republika Metanol p. a., Lach-Ner, Česká republika Hexan p. a., Lach-Ner, Česká republika 3.1.4.2 Chemikálie pre kyslú esterifikáciu s HCl Metanol p. a., Lach-Ner, Česká republika Kyselina chlorovodíková 35 % p. a., Lach-Ner, Česká republika Heptan p. a., Lach-Ner, Česká republika Bezvodý síran sodný, p. a., Lach-Ner, Česká republika Metyloranž, p. a., Lach-Ner, Česká republika 3.1.4.3 Chemikálie pre kyslú esterifikáciu s BF3 Bortrifluorid (14% roztok v metanolu), p. a., SIGMA-ALDRICH, Nemecko Hydroxid sodný p. a., Lach-Ner, Česká republika Metanol p. a., Lach-Ner, Česká republika 18

Isooktan p. a., Lach-Ner, Česká republika Chlorid sodný, p. a., Lach-Ner, Česká republika Bezvodý síran sodný, p. a., Lach-Ner, Česká republika 3.1.4.4 Chemikálie pre stanovenie mastných kyselín Zmesový štandard metylesterov mastných kyselín, Supelco 37 Component FAME Mix, SIGMA-ALDRICH, Nemecko 3.2 Analyzované vzorky V tejto práci boli analyzované vzorky slnečnicového oleja, zakúpené v bežnej tržnej sieti. Celkom bolo zakúpených a analyzovaných 5 rôznych druhov oleja (od rôznych výrobcov) označených S1-S5. Vzorky boli uchovávané v chladničke pri teplote do 6 C. 3.3 Použité metódy a postupy 3.3.1 Esterifikácia mastných kyselín 3.3.1.1 Bázická esterifikácia Do vialiek s gumovou zátkou sa naváži 100 mg vzorky oleja. Obsah vialky je za prídavku 2.5 ml isooktanu a 0,5 ml metanolického roztoku KOH (c = 2 mol.l -1 ) dokonale rozpustený. Vialka sa po dobu 8 minút dobre pretrepáva a potom sa nechá minimálne 6 minút stáť až do oddelenia fáz. Po tejto dobe sa z hornej isooktanovej vrstvy odoberie 1 ml analýze na plynovom chromatografe. [18,19] Príprava metanolického roztoku KOH (c = 2 mol l -1 ) Navážka 2,24 g KOH sa za mierneho ohrievania rozpustí v 20 ml metanolu. Pripravený roztok metanolického KOH je uchovávaný v chladničke maximálne po dobu 3 mesiacov, alebo kým sa nezačnú tvoriť kryštáliky na dne. [3] 3.3.1.2 Kyslá esterifikácia s kyselinou chlorovodíkovou Do destilačnej banky s guľatým dnom (50 ml) sa naváži 100 mg oleja a pridá sa 7 ml metanolického roztoku chlorovodíku (c = 1 mol l -1 ) a varný kamienok. Na banku sa pripojí reflux a obsah sa varí 10 minút. Banka sa ochladí pod tečúcou vodou, pridá sa 12,5 ml vody. Celý obsah sa kvantitatívne prevedie do oddeľovacieho lieviku a pridajú sa 4 ml heptanu. Silne sa pretrepe (1 min) a nechá sa stáť až do momentu oddelenia dvoch fáz. Oddelí sa vrchná heptanová vrstva; vodná sa ďalej extrahuje ďalšími 4 ml heptanu. Oba heptanové extrakty sa spoja a premývajú vždy 5 ml vody až do úplného odstránenia kyselín, ktoré sa indikuje metyloranžou (Obrázok 10). Roztok sa vysuší bezvodým síranom sodným a filtruje cez filtračným papier do 10 ml odmernej banky. Doplní sa heptanom po rysku. Z pripraveného roztoku sa odoberie 1 ml k analýze na plynovom chromatografe. [18,19] Príprava metanolického roztoku HCl (c = 1 mol l -1 ) Objem 0,6 ml HCl (35%) sa pridá do 6,4 ml metanolu. Pripravený roztok metanolického HCl možno uchovávať v digestore. [11] 19

Obrázok 10 Zmena farby roztoku postupným vymytím kyselín [12] 3.3.1.3 Kyslá esterifikácia s bortrifluoridom S ohľadom na jedovatosť BF3 je nutné prevádzať nasledovné úkony v digestore. Všetko laboratórne sklo musí byť ihneď po použití umyté vodou. Do destilačnej banky s guľatým dnom (50 ml) sa naváži 100 mg oleja. Pridajú sa 4 ml metanolického roztoku hydroxidu sodného (c = 0,5 mol l -1 ) a varný kamienok. K destilačnej banke sa pripojí spätný chladič. Obsah banky sa varí pod spätným chladičom do vymiznutia kvapôčok tuku. Každých 30 sekúnd sa jemne krúži s bankou, aby nedošlo k tvorbe pevného krúžku hydroxidu sodného na stene banky. Tento krok trvá približne 5 až 10 minút. Potom sa pridá 5 ml metanolického roztoku bortrifluoridu (BF3) cez horný koniec chladiča a varí sa (3 min). Následne sa pridajú cez horný koniec chladiča 3 ml isooktanu do variacej sa zmesi. V momente pridania sa var zastaví, odstráni sa chladič a ihneď, bez akéhokoľvek chladenia sa pridá 20 ml nasýteného vodného roztoku chloridu sodného (NaCl). Banka sa uzavrie a poriadne sa pretrepe (15 s). Pridá sa väčšie množstvo nasýteného roztoku chloridu sodného tak, aby sa hladina kvapaliny dostala do hrdla banky. Následne sa nechajú oddeliť obe fázy (5 min). Z vrchnej isooktanovej vrstvy sa odoberie 1 až 2 ml a prenesú sa do 4 ml vialky. Pridá sa malé množstvo bezvodého síranu sodného, aby sa odstránili stopy vlhkosti. Z pripraveného roztoku sa odoberie 1 ml k analýze na plynovom chromatografu. [18,19] Príprava metanolického roztoku NaOH (c = 0,5 mol l -1 ) Navážka 2 g NaOH sa za mierneho ohrievania rozpustí v 100 ml metanolu. Pripravený roztok metanolického NaOH je uchovávaný v chladničke maximálne po dobu 3 mesiacov. Ak má byť roztok skladovaný dlhšiu dobu, môžu sa vytvoriť malé množstvá bielej zrazeniny uhličitanu sodného, ktoré nemajú vplyv na prípravu metylesterov. [11] 3.3.2 Stanovenie metylesterov mastných kyselín metódou GC-FID 3.3.2.1 Podmienky stanovenia metylesterov mastných kyselín Plynový chromatograf TRACE GC (ThermoQuest S.p.A., Taliansko) Autosampler AI/AS 3000 Kapilárna kolóna: DB-23 o rozmeroch 60 m x 0,25 mm x 0,25 µm Teplotný program 60 C 10 minút Vzostupný gradient 12 C min -1 do 200 C s výdržou 10 minút Vzostupný gradient 5 C min -1 do 220 C s výdržou 15 minút 20

Vzostupný gradient 10 C min -1 do 240 C s výdržou 7 minút Celková doba analýzy: 60 minút Injektor Teplota injektoru: 250 C Splitless time: 5 minút Dávkovanie: autosampler bez deliča toku (splitless) (1 µl) Nosný plyn Prietok dusíku: 0,5 ml min -1 Detektor FID (plameňovo-ionizačný) Teplota detektoru: 250 C Prietok vzduchu: 350 ml min -1 Prietok vodíku: 35 ml min -1 Make-up dusíku: 30 ml min -1 3.3.2.2 Identifikácia a kvantifikácia mastných kyselín Mastné kyseliny boli stanovené po prevedení na MEMK (viď. kapitola 2.3.1). Identifikácia jednotlivých MEMK v testovaných vzorkách bola prevedená na základe porovnania retenčných časov identických štandardov. Semikvantitatívne zastúpenie vybraných mastných kyselín je vyjadrené ako plocha príslušných píkov na chromatograme. 3.4 Štatistické spracovanie výsledkov Dáta boli spracované a vyhodnotené pomocou MS Excel 2010. Výsledky sú prezentované formou grafov ako priemer z dvoch meraní (n = 2). Relatívna smerodajná odchýlka sa vo všetkých prípadoch pohybovala 10 % 21

4 VÝSLEDKY A DISKUSIA Lipidy patria medzi hlavné živiny, preto je ich stanovenie jedným zo základných cieľov v analýze potravín. Hlavná pozornosť je venovaná stanoveniu celkového množstva lipidov, stanovenie frakcii alebo funkčných skupín lipidov, stanovenie stability resp. stupne oxidácie tukov a iné. Táto práca sa venuje stanoveniu mastných kyselín ako najdôležitejších zložiek lipidov [3]. Celkový obsah lipidov a zloženia mastných kyselín sú dva kľúčové ukazovatele pre hodnotenie nutričnej hodnoty potravín. Najfrekventovanejšie využívanou analytickou metódou pre stanovenie mastných kyselín je GC, menej často HPLC, prípadne tieto metódy spojené s hmotnostnou detekciou. Medzi ďalšie techniky patria spektrofotometrické metódy a elektromigračné techniky [4,6,7]. Rovnako ako v iných analytických metódach je i pri analýze lipidov a stanovení mastných kyselín dôležitá príprava vzoriek. Aj keď je v zásade možné priame stanovenie mastných kyselín, ich stanovenie pomocou GC vyžaduje derivatizáciu pre zvýšenie prchavosti. Mastné kyseliny sú najčastejšie prevádzané na metylestery [9]. Táto tzv. esterifikácia je kľúčovou časťou analýzy a výber vhodnej metódy esterifikácie je pre získanie kvalitných výsledkov zásadný. Cieľom tejto práce teda bolo vyskúšať a porovnať tri typy esterifikačných metód z hľadiska pracnosti, časovej náročnosti apod. Ako kritéria výberu boli stanovené: čo najvyšší výťažok, lacné a bezpečné chemikálie, jednoduchosť a rýchlosť prevedenia. Experimenty boli prevádzané na vzorkách slnečnicového oleja, pre stanovenie mastných kyselín, resp. MEMK bola použitá plynová chromatografia s FID detekciou. 4.1 Identifikácia mastných kyselín vo vzorkách oleja Identifikácia mastných kyselín vo vzorkách bola prevedená na základe zrovnania retenčných časov s retenčným časmi štandardov. V nasledujúcej Tabuľke 6 je uvedený prehľad štandardov použitých pre identifikáciu. Získané chromatogramy sú uvedené v prílohách 1-4. 22

Tabuľka 6 Prehľad štandardov použitých pre identifikáciu mastných kyselín vo vzorkách slnečnicového oleja Číslo píku Mastná kyselina Retenčný Číslo Retenčný Mastná kyselina čas [min] píku čas [min] 1 maslová 13,39 20 linolová 38,86 2 kapronová 18,28 21 γ-linolenová 39,69 3 kaprylová 21,68 22 linolenová 40,60 4 kaprinová 24,15 23 arachová 42,02 5 undekanová 25,26 24 eicosenová 43,03 6 laurová 26,39 25 eicosadienová 44,97 7 tridekanová 27,59 26 heneicosanová 45,38 8 myristová 28,99 27 eicosatrienová 6 46,24 9 myristoolejová 29,72 28 arahidonová 47,10 10 pentadekanová 30,61 29 eicosatrienová 3 47,58 11 pentadecenová 31,55 30 eicosapentaenová 49,54 12 palmitová 32,63 31 behenová 50,04 13 palmitoolejová 33,35 32 eruková 51,03 14 heptadekanová 34,61 33 docosadienová 53,00 15 heptadecenová 35,41 34 trikosanová 53,26 16 stearová 36,79 35 lignocerová 56,70 17 elaidová 37,20 36 docosahexaenová 57,97 18 olejová 37,56 37 nervonová 58,31 19 linolelaidová 38,04 4.2 Porovnanie esterifikačných metód Boli vyskúšané a porovnané tri esterifikačné metódy: bázická esterifikácia s metanolickým roztokom KOH a kyslá esterifikácia s metanolickým roztokom HCl alebo bortrifluoridom. Postupy boli prevzaté z príslušných noriem [18,19] a sú uvedené v kap. 2.3.1. Jednotlivé esterifikácie vychádzali z totožnej navážky (100 mg) slnečnicového oleja, získané extrakty boli okamžite analyzované GC-FID. Porovnanie výťažnosti esterifikačných metód bolo prevedené semikvantitatívne porovnaním plôch píkov vybraných mastných kyselín na chromatograme. Výsledky sú vyjadrené graficky (viď grafy 1-10). Vzhľadom k pomerne veľkým rozdielom v obsahu jednotlivých mastných kyselín je každý graf (vzorka) rozdelený na dve časti (vysoký/nízky obsah). Z grafov je jednoznačne patrné, že najvyšších výťažkov mastných kyselín bolo dosiahnuté kyslou katalýzou s použitím BF3 23

Plocha píkov Plocha píkov 300000000 250000000 200000000 150000000 100000000 50000000 0 palmitová stearová olejová HCl Bázická BF3 Graf 1Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S1) 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 HCl Bázická BF3 Graf 2 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S1) 24

Plocha píkov Plocha píkov 300000000 250000000 200000000 150000000 100000000 50000000 0 palmitová stearová olejová HCl Bazická BF3 Graf 3 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S2) 6000000 5000000 4000000 3000000 2000000 1000000 0 HCl Bazická BF3 Graf 4 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S2) 25

Plocha píkov Plocha píkov 800000000 700000000 600000000 500000000 400000000 300000000 200000000 100000000 0 palmitová stearová olejová HCl Bazciká BF3 Graf 5 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S3) 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 HCl Bazciká BF3 Graf 6 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S3) 26

Plocha píkov Plocha píkov 700000000 600000000 500000000 400000000 300000000 200000000 100000000 0 palmitová stearová olejová HCl Bazická BF3 Graf 7 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S4) 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 HCl Bazická BF3 Graf 8 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S4) 27

Plocha píkov Plocha píkov 700000000 600000000 500000000 400000000 300000000 200000000 100000000 0 palmitová stearová olejová HCl Bazická BF3 Graf 9 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S5) 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 HCl Bazická BF3 Graf 10 Porovnanie účinnosti troch esterifikačných metód (výťažky mastných kyselín vzorka S5) Bázicky katalyzovaná esterifikácia je jednoduchá, rýchla (celková doba trvania cca 20 min) a šetrná vzhľadom k malým objemom rozpúšťadiel s ktorými sa ľahko pracuje. Ako je patrné z Tabuľky 5, prebieha i pri nízkych teplotách, z tohto dôvodu sa doporučuje pri materiáloch, ktoré majú vysoký obsah prchavých, príp. inak labilných (napr. konjugovaných nenasýtených) mastných kyselín. 28

Hlavnou nevýhodou je, že dochádza iba k transesterifikácii, teda esterifikované sú iba mastné kyseliny viazané (v triacylglyceroloch ap.). Preto je táto metóda vhodná tam kde sa nepredpokladá vysoký obsah voľných mastných kyselín. Je nevyhnutné využívať vysoko kvalitné činidlá s nízkym obsahom vlhkosti, keďže prítomnosť vody bráni úplnej derivatizačnej reakcii. Ďalšou nevýhodou je potenciálne riziko zmydelnenia esterov behom transesterifikácie. Každopádne bolo preukázané, že transesterifikácia je cca 1500krát rýchlejšia než príp. zmydelnenie, čo umožňuje priebeh reakcie s dosiahnutím uspokojivých výťažkov dokonca i v prítomnosti vody, za predpokladu, že reakcia je včas ukončená (než dôjde k zmydelneniu) obvykle prídavkom HCl pre neutralizáciu ph média. [10] Pri kyslej katalýze dochádza k esterifikácii voľných i viazaných mastných kyselín, na druhú stranu je ale dlhšia a vyžaduje vysokú teplotu (Tabuľka 5). Bola vyskúšaná metóda s bortrifluoridom a alternatívna metóda s HCl. V poslednej dobe sa v praxi najčastejšie používa ako katalyzátor BF3 (12 až 14% roztok v metanole), predovšetkým kvôli vysokej esterifikačnej účinnosti. Tento postup uvádzajú i platné ISO normy pre stanovenie mastných kyselín v tukoch [18,19]. Metanolický BF3 má však radu nevýhod, predovšetkým je to vysoká toxicita, vysoká cena a krátka trvanlivosť. Je potrebné ho uchovávať v chladničke alebo ešte lepšie v mrazničke, najlepšie pod dusíkom (max 3 mesiace). Použitie nekvalitného roztoku môže viesť k tvorbe artefaktov, príp. k strate PUFA. Je veľmi citlivý na prítomnosť vlhkosti a môže byť aplikovaný iba pri bezvodých vzoriek. [10]. Esterifikácia s 1-2% roztokom HCl v metanole poskytuje obdobné, príp. mierne nižšie výťažky ako pri použití BF3. Toto činidlo je lacné, bezpečné a ľahko použiteľné. Nevýhody sú podobne ako u BF3, malá stabilita pri skladovaní, naviac pomerne náročná príprava (prebublávaním metanolu chlorovodíkom) a za určitých podmienok môže tiež dôjsť k tvorbe artefaktov. Reakcie je opäť citlivá na prítomnosť vlhkosti, aj keď menej ako je to v prípade bázickej esterifikácie. Z tohto dôvodu je metanolická HCl mnohými autormi doporučovaná ako obecne najlepšie esterifikačné činidlo, vhodné pre vzorky s príp. stopami vlhkosti. [10]. Ako už bolo zmienené z hľadiska výťažku najúčinnejšia esterifikácia je s použitím BF3, naopak najmenej účinná kyslá esterifikácia s HCl, ktorá mala vždy výrazne nižšiu výťažnosť (viď grafy 1-10). Po zhodnotení metód z hľadiska získaného výťažku, dostupnosti a bezpečnosti chemikálii, jednoduchosti a rýchlosti prevedenia bola nakoniec vybraná v praxi najpoužívanejšia metóda s BF3, aj napriek jej nevýhodám ako sú vysoká toxicita, obmedzená trvanlivosť a náročnosť prevedenia, pretože celý proces je potrebné prevádzať v digestore. Táto esterifikačná metóda bude ďalej optimalizovaná za účelom minimalizácie množstva vzorky a použitých reagencií, skrátenia doby analýzy a predovšetkým zisku maximálneho výťažku. 29

5 ZÁVER Obsah lipidov a zloženie mastných kyselín sú dva kľúčové ukazovatele pre hodnotenie nutričnej hodnoty potravín. Preto je ich stanovenie jedným zo základných cieľov v analýze potravín. Táto práca sa venuje stanoveniu mastných kyselín ako najdôležitejších zložiek lipidov. Pred samotným stanovením je nutné mastné kyseliny previesť na prchavejšie formy, najčastejšie na metylestery. Výber vhodnej metódy esterifiácie má zásadný vplyv na kvalitu získaných výsledkov. Hlavným cieľom tejto bakalárskej práce teda bolo vyskúšať a porovnať tri typy esterifikačných metód: bázická s metanolickým roztokom KOH a kyslá s metanolickým roztokom HCl alebo bortrifluoridom. Na stanovenie metylesterov mastných kyselín bola použitá plynová chromatografia s plameňovo-ionizačným detektorom. Ako modelová matrica bol použitý slnečnicový olej zakúpený v bežnej tržnej sieti. Na základe zhodnotenia metód z hľadiska výťažku, dostupnosti a bezpečnosti chemikálií, jednoduchosti a rýchlosti prevedenia bola vybraná metóda s použitím metanolického roztoku bortrifluoridu, aj napriek jej nevýhodám ako sú vysoká toxicita, vysoká cena a krátka trvanlivosť bortrifluoridu. Výťažky mastných kyselín boli v tomto prípade výrazne vyšší než s použitím ostatných dvoch metód. Na túto prácu budú nadväzovať ďalšie experimenty zamerané na optimalizáciu ďalších parametrov metódy a jej následná aplikácia na rôzne vzorky tukov/olejov. 30

6 ZOZNAM POUŽITÝCH ZDROJOV [1] VODRÁŽKA, Zdeněk. Biochemie. 2. opr. vyd. Praha: Academia, 1996, 186, 134, 191 s. ISBN 80-200-0600-1 [2] VELÍŠEK, Jan a Jana HAJŠLOVÁ. Chemie potravin. Rozš. a přeprac. 3. vyd. Tábor: OSSIS, 2009, 2 sv. ISBN 978-80-86659-17-6. [3] PRUKNEROVÁ, K. Stanovení mastných kyselin v tavených sýrech. Brno. Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2014. 80 s. Vedoucí diplomové práce Ing. Eva Vítová, Ph.D. [4] FUCHS, Beate, Rosmarie SÜß, Kristin TEUBER, Mandy EIBISCH a Jürgen SCHILLER. Lipid analysis by thin-layer chromatography A review of the current state. Journal of Chromatography A. 2011, 1218(19), 2754 2774. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2010.11.066. [5] TOUCHSTONE, Joseph C., Rosmarie SÜß, Kristin TEUBER, Mandy EIBISCH a Jürgen SCHILLER. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. DOI: 10.1016/0378-4347(95)00232-8. ISBN 10.1016/0378-4347(95)00232-8. [6] ELFAMN-BORJESSON, I., HARROD, M. Analysis of non-polar lipids by HPLC on a diol column. Hrc-Journal Of High Resolution Chromatography. 1997. Vol. 20, no. 9. pp. 516-518 [7] MOREAU, RA. The analysis of lipids via HPLC with a charged aerosol detector. Lipids 2006. Vol: 41, no. 7, pp. 727-734 [8] CHRISTIE, William W. Gas chromatography and lipids. Ayr, Scotland: The Oily Press, 1989. ISBN 0-9514171-0-X. [9] FABBRI, Daniele, Valentina BARAVELLI, Giuseppe CHIAVARI a Silvia PRATI. Profiling fatty acids in vegetable oils by reactive pyrolysis gas chromatography with dimethyl carbonate and titanium silicate. Journal of Chromatography A. Bologna, 2005, 1100(2), Pages 218 222. DOI: https://doi.org/10.1016/j.chroma.2005.09.051. [10] CARRAPISO, AI; GARCIA, C. Development in lipid analysis: Some new extraction techniques and in situ transesterification. Lipids, 2000, Vol: 35, no. 11, pp. 1167-1177. ISSN: 0024-4201. [11] ČSN EN ISO 1735 Sýry a sýrové výrobky Stanovení obsahu tuku Gravimetrická metoda (Referenční metoda). [12] SÝKORA, M. Optimalizace a validace metody stanovení volných mastných kyselin. Brno, 2016. Vysoké Učení technické v Brně. VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ. Vedoucí práce Ing. Eva Vítová, Ph.D. [13] CHRISTIE, William W. Preparation of ester derivatives of fatty acids for chromatographic analysis. Advances in Lipid Methodology, II (W. W. Christie), The Oily Press, Dundee 1993, pp. 69-111 [14] KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 s. ISBN 80-863-6907-2 [15] CHURÁČEK, Jaroslav. Analytická separace látek. Praha: Nakladatelství technické literatury, 1990. ISBN 80-03-00569-8. [16] SOMMER, L. Základy analytické chemie 2. 1. vyd. Brno: VUTIUM, 2000. 347 s. ISBN 80-214-1742-0. [17] Gas Chromatography [online]. Sheffield [cit. 2017-05-16]. Dostupné z: http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm 31

[18] ČSN ISO 5508: Živočišné a rostlinné tuky a oleje Analýza methylesterů mastných kyselin plynovou chromatografií. [19] ČSN EN ISO 5509: Živočišné a rostlinné tuky a oleje Příprava methylesterů mastných kyselin. 32

7 ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK SFA nasýtené mastné kyseliny (Saturated Fatty Acids) MUFA mononenasýtené mastné kyseliny (Monounsaturated Fatty Acids) PUFA polynenasýtené mastné kyseliny (Polyunsaturated Fatty Acids) TLC tenkovrstvá chromatografia (Thin Layer Chromatography) HPLC vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High Performance Liquid Chromatography) MALDI hmotnostná spektrometrie s laserovou ionizáciou (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) ESI MS elektrosprejová ionizácia (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) NMR nukleárna magnetická rezonancia MK mastne kyseliny MEMK metylestery mastných kyselín GC plynová chromatografia (Gas Chromatography) FID plameňový ionizačný detektor (Flame Ionization Detector) 33