Onkohematologické repetitórium 365 Úloha patológa v manažmente chronickej lymfocytovej leukémie MUDr. Tomáš Balhárek, PhD. 1, 2, prof. MUDr. Lukáš Pla

Prepis

1 365 Úloha patológa v manažmente chronickej lymfocytovej leukémie MUDr. Tomáš Balhárek, PhD. 1, 2, prof. MUDr. Lukáš Plank, CSc. 1, 2 1 Ústav patologickej anatómie JLF UK a UNM, Martin 2 Martinské bioptické centrum, s. r. o., Martin Po sérii prehľadových článkov venovaných biológii, diagnostike a liečbe chronickej lymfocytovej leukémie (CLL) dopĺňame spektrum poskytnutých informácií aj o pohľad patológa. Bioptické vyšetrenie lymfatických uzlín (LU) a kostnej drene (KD) má pri CLL osobité postavenie, pretože, na rozdiel od ostatných malígnych lymfómov a lymfoidných leukémií, nie je v typických prípadoch potrebné na stanovenie diagnózy ani na jej štádiovanie. V poslednom čase je zrejmý aj trend k znižovaniu počtu vyšetrení KD vykonávaných u pacientov s CLL, i keď názory na túto problematiku nie sú jednotné, čo odzrkadľuje aj rozdielna prax jednotlivých pracovísk. V konečnom dôsledku uvedené dôvody vytvárajú dojem, že vo vzťahu k CLL je úloh a patológa nepodstatná a realizované vyšetrenia sú zbytočné. Naša každodenná prax však ukazuje opak, pretože CLL stále patrí k najfrekventovanejším diagnózam, s ktorými sa stretávame. Nemožno to pritom vnímať len ako nerešpektovanie platných odporúčaní alebo nevôľu zmeniť zaužívané algoritmy. K bioptickému vyšetreniu KD, LU či iného tkaniva totiž existujú pri CLL aj iné indikácie než je stanovenie diagnózy a štádia ochorenia. Snahou predloženého článku je priblížiť postavenie a význam histomorfologického vyšetrenia v diagnostickom algoritme a manažmente pacientov s CLL, čo možno od tohto vyšetrenia očakávať, prípadne kedy ho správne indikovať. Kľúčové slová: chronická lymfocytová leukémia, bioptická diagnostika, histomorfológia. Role of pathologist in the management of chronic lymphocytic leukaemia In contrast to other malignant lymphomas and lymphoid leukaemias, biopsy examination is not required for making diagnosis and staging in typical cases of chronic lymphocytic leukaemia (CLL), in which diagnosis is usually made through examination of the peripheral blood or bone marrow (BM). This sometimes makes an impression that the role of pathologist in the management of CLL is only marginal and realized biopsy examinations are unreasonable. But making diagnosis and staging are not the only indications for biopsy examination. This article reviews indications for biopsy examination in CLL according to actual clinical guidelines and data from our practice. BM or lymph node (LN) biopsy may be helpful in cases with atypical cytomorphology, phenotype or when their findings are not conclusive. In the pretreatment period the BM biopsy is warranted to clarify the reason for unclear cytopenias or in clinical trials prior to initiating therapy with myelosuppressive agents. In the post-treatment period the BM biopsy is used for assessment of response, commonly not only for patients in clinical trials, but also in general practice. LN and BM biopsies are required to confirm the diagnosis of blastic transformation of CLL into an aggressive lymphoma. Key words: chronic lymphocytic leukemia, biopsy diagnostics, histomorphology. Onkológia (Bratisl.), 2014; roč. 9(6): Úvod Chronická lymfocytová leukémia (CLL) je chronické lymfoproliferatívne ochorenie charakterizované proliferáciou a progresívnou akumuláciou malých monoklonálnych CD5+/CD23+ B-lymfocytov, vedúcich k periférnej lymfocytóze, lymfadenopatii (LAP), hepatosplenomegálii a zlyhaniu kostnej drene (KD), nezriedka asociovaných s autoimunitnými a imunodeficitnými komplikáciami. CLL sa stále teší pomerne vysokému klinickému i vedeckému záujmu. Nie je to len vďaka jej incidencii, keďže je najčastejšou leukémiou dospelých a starších pacientov, ale aj vzhľadom na množstvo dosiaľ nezodpovedaných otázok týkajúcich sa biológie, patogenézy a liečby ochorenia. V rámci biológie a patogenézy CLL dlhodobo dominujú tri témy, ktoré boli sčasti spracované v predchádzajúcich článkoch. Prvou je snaha o nájdenie fyziologického protipólu, respektíve bunkového pôvodu nádorových lymfocytov, druhou je hľadanie molekulových abnormalít zodpovedných za iniciáciu a expanziu nádorovej lymfoproliferácie a treťou je skutočná, čiže v klinickej praxi upotrebiteľná úloha takzvaných prognostických a prediktívnych faktorov v kontexte dostupných poznatkov a možností liečby. Nespočetné množstvo dosiaľ publikovaných údajov na uvedené témy však vnáša do tejto problematiky určitú netransparentnosť, v dôsledku ktorej sú v niektorých prácach rekapitulované zbytočné alebo už neplatné údaje. Pôvod nádorových buniek stále nie je úplne jasný. Sprvu zjednodušene vnímaná dilema ohľadom pôvodu CLL v naivných alebo pamäťových B-lymfocytoch sa ukázala ako omnoho komplexnejšia. Taktiež molekulová patogenéza CLL sa ukazuje ako oveľa zložitejšia. Začína byť zrejmé, že sa asi nikdy nepodarí identifikovať jedinú univerzálnu genetickú abnormalitu zodpovednú za iniciáciu nádorového klonu, zato pribúdajú poznatky o klonálnych a subklonálnych abnormalitách ovplyvňujúcich správanie a priebeh ochorenia (del17p, del11q, abnormality TP53, mutácie NOTCH1, SF3BB1 a BIRC3). Postupne sa vyjasňujú názory aj na využiteľnosť prognostických a prediktívnych faktorov CLL, a treba podotknúť, že väčšinou v ich neprospech. Je evidentné, že žiadny z početných takzvaných prognostických faktorov nie je dostatočný na začatie liečby, ktorá je indikovaná len pri presne definovanom aktívnom a/alebo symptomatickom ochorení, so zohľadnením výkonnostného stavu pacienta a jeho komorbidity. S výnimkou delécie 17p, mutácií génu TP53 a delécie 11q, ktoré majú určitý prediktívny význam, žiadny iný z dosiaľ identifikovaných faktorov nemá vplyv na výber konkrétnej liečebnej schémy (1) ; 9(6) Onkológia

2 366 Diagnostika CLL v kontexte platných usmernení Aby sme mohli priblížiť postavenie bioptického vyšetrenia pri CLL, je potrebné aspoň v krátkosti pripomenúť jej diagnostické kritériá. Pri tom treba rozlišovať kritériá klinicko--laboratórne a histomorfologické (bioptické). Vzhľadom na prítomnosť dostatočného počtu cirkulujúcich nádorových buniek v periférnej krvi (PK) je diagnostika CLL vo väčšine prípadov založená na analýze PK a fyzikálnom vyšetrení pacienta, čiže bioptické vyšetrenie nie je potrebné. V súčasnosti sú v platnosti klinicko-laboratórne diagnostické kritériá publikované v 06/2008, neskôr doplnené a korigované v 12/2008 ako správa z Medzinárodného workshopu o CLL (IWCLL), preto takzvané IWCLL usmernenia (2). Tieto sú aktualizáciou dovtedy používaných NCI-WG kritérií z roku 1996 (3). V roku 2010 boli publikované a v roku 2011 následne doplnené a korigované aj diagnostické usmernenia od Európskej spoločnosti pre lekársku onkológiu (ESMO) (4, 5). Aktuálne histomorfologické diagnostické kritériá v bioptickom materiáli zase určuje Klasifikácia nádorov krvotvorného a lymfoidného tkaniva podľa Svetovej zdravotníckej organizácie (SZO klasifikácia) z roku Tá definuje CLL spolu s jej morfologicky i fenotypovo v zásade identickým, ale neleukemickým protipólom, malobunkovým lymfocytovým lymfómom (SLL), ako zrelé B-bunkové neoplázie v spektre CLL/SLL (6). Podľa IWCLL je pre diagnostiku CLL nevyhnutná prítomnosť monoklonálnej B-lymfocytózy v PK 5x10 9.l -1, s trvaním najmenej tri mesiace, bez ohľadu na iný orgánový nález v KD, LU alebo slezine. KD býva infiltrovaná vo všetkých prípadoch CLL. Nové IWCLL kritériá a ani SZO klasifikácia 2008 však už nevyžadujú nález viac ako 30 % infiltrácie KD charakteristickými bunkami a navyše umožňujú stanoviť diagnózu CLL aj v prípadoch s periférnou lymfocytózou < 5x10 9.l -1 alebo bez LAP, ak sú u pacienta prítomné cytopénie spôsobené infiltráciou KD alebo sú prítomné iné symptómy asociované s CLL. Hodnota 30 % infiltrácie bola pôvodne určená ako podiel lymfoidných buniek v aspiráte KD, až neskôr bola prebratá aj do hodnotenia biopsie KD. Prípady SLL vyžadujú prítomnosť LAP a/alebo splenomegálie, ale pri absencii cytopénií spôsobených infiltráciou KD, pričom počet B-lymfocytov v PK by nemal presiahnuť 5x10 9.l -1 a diagnóza SLL by mala byť potvrdená biopticky (2). Keďže aj SLL vykazuje vysokú frekvenciu postihu KD (45 85 %) (7, 8), diskriminácia CLL a SLL len na základe izolovaného vyšetrenia KD bez znalosti bližších klinicko-laboratórnych údajov nie je možná. Pacienti s klonálnou B-lymfocytózou < 5x10 9.l -1 v PK, bez LAP alebo organomegálie, bez cytopénií alebo iných klinických symptómov asociovaných s CLL, sú dnes klasifikovaní ako monoklonálna B-lymfocytóza (MBL) (9). Virtuálne vo všetkých prípadoch MBLsa vyskytuje infiltrácia KD, pričom väčšinou ide o infiltráciu malého rozsahu ( 10 %). Keďže biopsia KD sa v prípadoch MBL väčšinou nevykonáva, je tu k dispozícii len málo údajov na detailnejšie závery. Diagnostickým problémom býva nielen odlíšenie MBL s vyššou lymfocytózou (na hranici 5x10 9.l -1 ) od včasného štádia CLL, ale problematické bývajú aj prípady s B-lymfocytózou síce pod 5x10 9.l -1, no s extenzívnou infiltráciou KD, ktorých je cca 5 %. Obe skupiny tvoria akúsi sivú zónu medzi CLL-typom MBL a CLL. Ak by bolo uplatnené pôvodné NCI- WG kritérium o 30 % infiltrácii KD, tieto prípady by mohli byť považované za CLL (3). Niekoľko poznámok k histomorfológii CLL Histomorfológia CLL je čiastočne ovplyvnená mikroprostredím tkanív (kompartmentov), v ktorých nádor rastie. Nádorové bunky preferujú prostredie centrálnych a periférnych lymfoidných orgánov, najmä KD, LU a sleziny. Infiltráty CLL sú tvorené lymfoidnými bunkami pripomínajúcimi malé, respektíve menšie zrelé (periférne) B-lymfocyty (obrázok 1) s prímesou stredne veľkých elementov, označovaných ako prolymfocyty a väčších elementov označovaných ako paraimunoblasty, ktoré v tkanive LU a menej často i v infiltrátoch KD vytvárajú takzvané proliferačné centrá (pseudofolikuly) variabilnej veľkosti (obrázok 2). Mitotická aktivita lymfoproliferácie je zvyčajne veľmi nízka (proliferačný Ki-67 index je hlboko pod 5 %), s výnimkou spomenutých proliferačných centier. Difúzne rastúci infiltrát zvyčajne úplne nahrádza pôvodnú architektúru LU, len zriedkavo nachádzame ojedinelé zárodočné centrá reziduálnych lymfatických folikulov (6). V tkanive KD máva CLL podobu intersticiálnej, nodulárnej (intertrabekulárnej ložiskovej), zmiešanej intersticiálne-nodulárnej, či ložiskovo alebo difúzne splývajúcej infiltrácie, ktorá môže nakoniec takmer úplne nahrádzať pôvodnú krvotvorbu (8). V rámci klinických štúdií a za účelom prognostifikácie sa typ infiltrácie zjednodušene rozlišuje na non-difúznu a difúznu (obrázok 3 a 4), pričom difúzna infiltrácia svedčí pre pokročilejšie a/alebo aktívnejšie ochorenie, čo sa zvyčajne spája s jeho horším klinickým priebehom. Obrázok 1. CLL infiltrát v LU (Giemsa, zväčšenie 400-krát) Obrázok 2. Pseudofolikul v infiltráte LU (Giemsa, zväčšenie 200-krát) Obrázok 3. Intersticiálne-nodulárna infiltrácia KD (CHAE, zväčšenie 200-krát) Obrázok 4. Difúzna infiltrácia KD (CHAE, zväčšenie 200-krát) Bioptické vyšetrenie KD pri CLL V súčasnosti je pri viacerých lymfómoch evidentný trend znižovania počtu realizovaných bioptických vyšetrení KD. Avšak názory na vykonávanie biopsie KD pri CLL nie sú jednotné a klinická prax nezriedka nekorešponduje s platnými usmerneniami. Podľa účelu a načasovania sa rozlišuje biopsia KD diagnostická, štádiová alebo reštádiová, pred- alebo postterapeutická, pri progresii, relapse Onkológia 2014; 9(6)

3 367 alebo komplikáciách a pod. Platné usmernenia osobitne definujú diagnostickú a predterapeutickú biopsiu KD, vychádzajúc zo skutočnosti, že dnes je v krajinách s dobre rozvinutým zdravotníctvom a laboratórnou diagnostikou väčšina prípadov CLL diagnostikovaných v asymptomatickom štádiu. V prípadoch diagnostikovaných až v pokročilejšom štádiu sa v podstate diagnostická biopsia KD stáva predterapeutickou. Biopsia ani aspirát KD nie sú v typických prípadoch potrebné na stanovenie diagnózy CLL (2). Avšak z vlastných skúseností vieme, že sú tieto vyšetrenia stále vykonávané pomerne často, zvyčajne za účelom verifikácie klinicky či cytomorfologicky suponovanej CLL, kedy sa trepanobiopsia odoberá pri jednom zákroku spolu s aspiráciou KD na prietokovo-cytometrickú (FC) analýzu. Paradoxne, pre viaceré naše klinické pracoviská je bioptické vyšetrenie KD stále dostupnejšie než FC analýza, čomu nahráva i fakt, že na rozdiel od niektorých iných lymfómov je CLL imunohistochemicky dobre typizovateľná aj v tkanive KD. Formálne by diagnostická biopsia KD mala byť vykonávaná len v cytomorfologicky alebo fenotypovo atypických prípadoch, kedy FC analýza aj tak zvyčajne odkazuje na koreláciu s histomorfológiou. Ďalšou indikáciou sú prípady s nižšími hodnotami periférnej lymfocytózy (v minulosti CLL vo včasnom štádiu, dnes MBL), kedy by infiltrácia KD 30 % mohla svedčiť skôr pre CLL než MBL. V prípadoch MBL sa biopsia KD väčšinou nevykonáva alebo sú tieto prípady vedené ako včasné štádiá CLL či ako infiltrácia KD lymfómom zo spektra CLL/SLL. Ako CLL sú zvyčajne diagnostikované aj zriedkavé prípady MBL s prekvapivo rozsiahlou infiltráciou KD. Vyšetrenie KD nie je potrebné ani na štádiovanie CLL podľa Raia alebo Bineta. Postavenie biopsie KD vo fáze známej diagnózy pred začatím liečby symptomatického či aktívneho ochorenia je formálne definované v dostupných usmerneniach. Vyšetrenie KD je IWCLL usmerneniami uvádzané v rámci kategórie doplnkových vyšetrení ako žiaduce, respektíve vhodné (2), ale iba u pacientov, ktorí budú liečení potenciálne myelosupresívnymi schémami alebo za účelom odhalenia príčiny cytopénie. Naproti tomu Nemecká CLL študijná skupina (GCLLSG) v súvislosti s prepublikovaním IWCLL kritérií uvádza aspirát a biopsiu KD v predterapeutickej fáze ako štandardné vyšetrenie (10). ESMO odporúča vyšetrenia KD, ak sú klinicky indikované (5). Aj to poukazuje na rozdielne názory na vykonávanie biopsie KD pri CLL. Na rozdiel od predterapeutickej fázy sa IWCLL usmernenia detailnejšie venujú vyšetrovaniu KD pre hodnotenie liečebnej odpovede, t. j. v postterapeutickej fáze, i keď vyšetrenie opäť odporúčajú len u pacientov zaradených do klinických štúdií. Naše skúsenosti však ukazujú, že toto vyšetrenie je štandardne vykonávané aj u ostatných pacientov v rámci bežnej praxe. Biopsia a aspirát KD sú v spomenutých usmerneniach uvedené ako parametre potrebné na definovanie odpovede, pričom vyšetrenie KD by malo byť robené prinajmenej dva mesiace (v pôvodnej verzii usmernení z 06/2008 uvedené tri mesiace) po ukončení liečby. Na potvrdenie kompletnej remisie (CR) je totiž okrem iných parametrov (periférna lymfocytóza < 4x10 9.l -1, absencia LAP >1,5 cm, absencia hepato- a splenomegálie, hodnoty neutrofilov > 1,5x10 9.l -1, trombocytov > 100x10 9.l -1 a hemoglobínu > 110g.l -1 ), potrebný aj nález normocelulárnej drene s < 30 % infiltráciou lymfoidnými bunkami a neprítomnosťou nodulov tvorených B-bunkami (2). Prítomnosť nodulárnej infiltrácie je pritom možné určiť len v biopsii KD, nie v aspiráte. Pre pacientov spĺňajúcich kritériá CR, ktorí majú hypocelulárnu dreň a prezentujú sa perzistentnými cytopéniami nespôsobenými CLL infiltráciou, sa zaviedol termín kompletnej remisie s inkompletným zotavením krvotvorby (CRi). Aj na potvrdenie CRi je nevyhnutné vyšetrenie KD. Pri hypocelulárnej dreni v postterapeutickej fáze sa ďalej odporúča opakovať vyšetrenie KD za 4 6 týždňov alebo kým nedôjde k úprave krvného obrazu, najneskôr však do 6 mesiacov od ukončenia liečby. Parciálnu remisiu (PR) CLL definuje okrem poklesu, respektíve zlepšenia ostatných uvedených parametrov o 50 %, aj redukcia infiltrácie o 50 % alebo prítomnosť nodulov tvorených B-bunkami (2). I keď jedinou potenciálne kuratívnou modalitou je pri CLL transplantácia krvotvorných buniek, aj iné moderné liečebné schémy sú schopné u časti pacientov dosiahnuť výraznú redukciu leukemického klonu. V rámci hodnotenia KD v postterapeutickej fáze s tým súvisí potreba detekcie minimálnej reziduálnej choroby (MRD). Schopnosť dosiahnutia MRD je zároveň jedným z prognostických faktorov. Možnosti histomorfologickej detekcie MRD sú však limitované, pretože citlivosť morfologického vyšetrenia v kombinácii s imunohistochemickou analýzou je len 10-1 až To je omnoho menej než dosahuje FC analýza (10-4 až 10-5 ). Po imunochemoterapii s anti-cd20 protilátkami navyše často dochádza k oslabeniu až strate expresie znaku CD20, preto je na detekciu reziduálnej nádorovej populácie potrebné použiť okrem CD20 aj dôkaz iného B-bunkového znaku (najčastejšie využívame PAX-5), v kombinácii s CD5 a CD23. K nezanedbateľným faktom patrí, že okrem potvrdenia diagnózy či určenia typu a rozsahu infiltrácie KD, biopsia KD umožňuje vyhodnotiť aj stav a rezervy pôvodnej hemopoézy. V postterapeutickej fáze zase slúži nielen na zhodnotenie efektu liečby v zmysle vývoja infiltrácie, ale umožňuje posúdiť aj dynamiku regenerácie reziduálnej hemopoézy. Osobitný význam má biopsia KD pri progredujúcej alebo refraktérnej CLL, pri cytopenických či iných komplikáciách. Zopakovanie biopsie KD sa odporúča u pacientov s perzistujúcou cytopéniou po liečbe, za účelom odhalenia jej pôvodu, buď v pretrvávajúcej infiltrácii KD základným ochorením alebo v myelosupresívnom efekte liečby (2). Ďalšou indikáciou k biopsii KD je podozrenie na evolúciu sekundárneho postterapeutického myelodysplastického syndrómu (MDS), ktorých výskyt sa pozvoľne zvyšuje. Postterapeutické MDS pritom patria k najzložitejším histomorfologickým diagnózam. Potvrdenie tejto diagnózy vyžaduje úzku spoluprácu zainteresovaných odborov, vzájomné zdieľanie údajov a kritické hodnotenie nálezov v korelácii s klinicko-laboratórnym obrazom ochorenia. Veľmi nápomocné sú údaje o evolúcii sekundárnych cytogenetických abnormalít zvyčajne asociovaných s MDS. Diagnózu postterapeutického MDS bez genetických abnormalít často potvrdí až rebiopsia KD s časovým odstupom. Nakoniec sa ešte treba krátko zmieniť k prognostickému významu biopsie KD. Dnes prevláda názor, že prognostický význam biopsie KD v predterapeutickej fáze je prekonaný molekulovými prognostickými faktormi a používanou liečbou. Typ a rozsah infiltrácie KD si totiž v multivariantných analýzach väčšinou nezachovávajú významnosť. Keď však obídeme prognostický význam biopsie KD, samotný rozsah infiltrácie je užitočný ukazovateľ, ktorý priamo aj nepriamo reflektuje aktivitu i vlastnosti ochorenia, najmä v zmysle rizikového profilu genetických abnormalít a expresie ZAP-70, pri ktorých sa častejšie stretávame s difúznou infiltráciou, atypickou histocytológiou, vyšším podielom menej zrelých elementov či nápadnými pseudofolikulmi. Infiltrácia KD v podstate reflektuje veľkosť nádorovej masy, čo má význam pre monitorovanie aktivity ochorenia. Bioptické vyšetrenie LU pri CLL Pokiaľ biopsia KD má pri CLL ešte relatívne široké spektrum indikácií, biopsia LU je v typických prípadoch skutočne nadbytočným výkonom, ktorý sa neodporúča a ani neposkytuje žiadnu relevantnú prognostickú informáciu ; 9(6) Onkológia

4 368 Podľa IWCLL usmernení je biopsia LU v zásade indikovaná len v troch situáciách: 1.) na stanovenie diagnózy CLL v problematických prípadoch, v ktorých neboli prínosné iné vyšetrenia alebo ich závery neboli konkluzívne (napríklad atypická cytomorfológia, imunofenotyp alebo nezvyčajná klinická prezentácia); 2.) ako súčasť štúdií, ktorých protokol explicitne vyžaduje biopsiu LU a 3.) pri podozrení na vysokomalígnu tranformáciu, pri ktorej je úloha bioptického vyšetrenia nezastupiteľná (2). Aj napriek uvedenému sa v našej praxi stále pomerne často stretávame aj s primodiagnostikou CLL v biopsii LU. Nezriedka ide o incidentálne prípady s periférnou LAP, kedy je vykonávaná exstirpácia zväčšených LU vo fáze pred ukončením základných vyšetrení, prekvapujúco často aj bez znalosti o krvnom obraze. K uvedeným indikáciám biopsie LU alebo iného extranodálneho tkaniva pri CLL ešte možno doplniť bioptizáciu dostupných lézií pri pochybnostiach o správnosti primárnej diagnózy, v prípadoch atypickej extramedulárnej a extranodálnej prezentácie CLL či suponovanej kolízie s iným nádorovým postihnutím. CLL sa môže atypicky prezentovať napríklad v miestach, kde vzniklo lymfoidné mikroprostredie, napríklad v dôsledku chronického zápalu. Vysokomalígna transformácia CLL Vysokomalígna transformácia je špecifická komplikácia CLL asociovaná so zlou prognózou, ktorá si vyžaduje osobitný diagnosticko-terapeutický prístup, v rámci ktorého je úloha bioptického vyšetrenia nezastupiteľná. Transformácia CLL predstavuje pomerne široké spektrum morfologických jednotiek, z ktorých časť nemá jasne definované kritériá, čo zvyšuje riziko ich nad- alebo poddiagnostikovania. Taktiež klinický význam niektorých jednotiek považovaných za prejav transformácie je otázny. Podozrenie na transformáciu vzniká pri progresii alebo asymetrii LAP, extranodálnej prezentácii, progresii splenomegálie, B-symptómoch, elevácii β2- mikroglobulínu a LDH. V takýchto prípadoch sa odporúča bioptizovať dominujúce a disproporcionálne lézie, postihnuté extranodálne miesta a v prípade potreby tieto biopsie opakovať. Najčastejším typom transformácie je progresia do sekundárneho difúzneho veľkobunkového B-lymfómu (DLBCL), označovaná ako Richterov syndróm (RS) (obrázok 5 a 6), ktorého incidencia sa v závislosti od zvolených kritérií uvádza 2 15 %, no reálne dosahuje menej než 3 5 % (11, 12). Sekundárny DLBCL má histocytologické črty identické s primárnym DLBCL, môže mať Obrázok 5. Richterov syndróm v LU (Giemsa, zväčšenie 200-krát) podobu ktoréhokoľvek morfologického variantu, i keď imunoblastový sa vyskytuje častejšie. Fenotypovo > 80 % prípadov vykazuje non-gcb profil. Sekundárny DLBCL si väčšinou zachováva pôvodný fenotyp, ak sa vyskytnú zmeny, ide zvyčajne o stratu expresie CD5, CD23, ZAP-70 alebo Ig. Vo väčšine prípadov klasického RS (63 81 %) ide o klonálny proces, t. j. primárna CLL a sekundárny DLBCL sú klonálne príbuzné entity. RS častejšie postihuje prípady CLL s nemutovanými génmi pre IgVH (UM-CLL), často vzniká extranodálne (30 40 %), ale KD infiltruje len v < 10 % prípadov (13, 14). Klasický RS treba histomorfologicky odlíšiť od rastovo aktívnej (akcelerovanej) CLL a tzv. paraimunoblastového variantu CLL, ktorý je opísaný nižšie. Druhým typom transformácie CLL je progresia do klasického Hodgkinovho lymfómu (CHL), označovaná aj ako Hodgkinov variant RS (HvRS) (obrázok 7). Jeho incidencia sa uvádza 0,5 2 %, ale reálne dosahuje len 0,5 1 % (11, 15). K tomuto typu transformácie častejšie dochádza v prípadoch CLL liečených purínovými analógmi (fludarabín) s následnou EBV infekciou. HvRS je zriedkavý v extranodálnej lokalizácii (< 10 %), ale údajne častejšie (30 40 %) infiltruje KD než klasický RS. CHL vznikajúci v teréne UM- CLL je zvyčajne klonálne príbuzný, v teréne CLL s mutovanými IgVH génmi (M-CLL) je častejšie nepríbuzný. HvRS môže mať v bioptickom obraze podobu dvoch separovaných komponent (CHL + CLL) alebo sú Hodgkinove a Sternbergove- Reedovej (HRS) bunky a bunky hodgkinoidného inflamatórneho pozadia premiešané s CLL. Keďže v prvom prípade je pravdepodobnejšie, že ide o klonálne nepríbuzný proces, pri nedostupnosti molekulovo-genetických analýz hovoríme radšej o kolízii, respektíve kompozitnom lymfóme (15). Uvedené prípady ešte treba odlíšiť od CLL s nálezom tzv. HRS-like buniek na pozadí CLL bez zodpovedajúceho hodgkinoidného prostredia (obrázok 8). Tieto prípady sa nepovažujú za HvRS, i keď strata expresie CD20 a expresia Hodgkinasociovaných antigénov CD15 a CD30 u nich Obrázok 6. Richterov syndróm v KD (Giemsa, zväčšenie 400-krát) Obrázok 7. Hodgkinov variant Richterovho syndrómu v LU (HE, zväčšenie 200-krát) Obrázok 8. CLL s HRS-like bunkami (HE, zväčšenie 400-krát) zvyšuje riziko možnej transformácie. Histologická subtypizácia CHL, vzniknutého v rámci HvRS, je zvyčajne zložitá a často nemožná (13, 14). Diagnosticky náročnou je raritná prolymfocytová transformácia CLL, od ktorej treba odlíšiť takzvanú atypickú CLL so zvýšeným počtom prolymfocytov (CLL/PL). Tú v PK definuje prítomnosť % cirkulujúcich prolymfocytov, ale jej diagnostika v tkanive LU či KD je problematická. Toto ochorenie vykazuje horšiu odpoveď na liečbu a horšiu prognózu, často ide o prípady s deléciou 17p alebo funkčnými abnormalitami TP53 (16). CLL s prolymfocytovou transformáciou je extrémne zriedkavá entita, definovaná > 55 % podielom cirkulujúcich prolymfocytov, no v tkanive sú jej diagnostické kritériá nejasné (> 30 % prolymfocytov?). Potvrdenie tejto diagnózy vyžaduje koreláciu s klinickým priebehom, morfológiou a fenotypom v PK (FMC7+, strata expresie CD5 a CD23, silná expresia CD20). Onkológia 2014; 9(6)

5 369 Obrázok 9. Plazmocytoidná diferenciácia CLL v KD (c-ig kappa+, zväčšenie 400-krát) Obrázok 10. Silná expresia ZAP-70 sk óre 2+ (zväčšenie 400-krát) Obrázok 11. Akcelerovaná CLL s nápadnými pseudofolikulmi (Giemsa, zväčšenie 40-krát) Obrázok 12. Paraimunoblastový variant/transformácia CLL (Giemsa, zväčšenie 400-krát) Otvorené otázky histomorfológie CLL Asi v 25 % prípadov CLL sa stretávame s nálezom takzvanej plazmocytoidnej diferenciácie so silnou expresiou monotypického imunoglobulínu (obrázok 9), ktorá raritne nadobúda až črty plazmocytovej diferenciácie. Konštatovanie o prítomnosti, respektíve neprítomnosti plazmocytoidnej diferenciácie je štandardnou súčasťou našich bioptických nálezov. Plazmocytoidná diferenciácia je biologicky nepochybne zaujímavý fenomén nádorových B-buniek, ale dosiaľ bez spoľahlivo potvrdeného klinického či prognostického významu. Nebol dokázaný ani jej vzťah k výskytu paraproteínu, ktorý býva detegovaný v sére cca 5 10 % prípadov CLL. V rámci imunohistochemických analýz vyšetrujeme aj expresiu ZAP-70 proteínu (obrázok 10), ktorú skórujeme ako negatívnu (0), slabo pozitívnu (1+) a silno pozitívnu (2+), i keď klinická využiteľnosť tejto informácie je otázna. Ďalším zaujímavým morfologickým fenoménom je variabilita veľkosti a zloženia pseudofolikulov v infiltrátoch CLL. Ich veľkosť v LU alebo prítomnosť v infiltrátoch KD spravidla koreluje s aktivitou nádoru, preto prípady s prominentnými pseudofolikulmi, zvýšeným podielom menej zrelých elementov a zvýšenou mitotickou aktivitou označujeme ako rastovo aktívna alebo akcelerovaná CLL (obrázok 11). Prognostický význam tohto fenoménu je však sporný, i keď niektoré práce preukázali agresívnejšie správanie týchto prípadov (17). V ojedinelých prípadoch CLL sa v tkanive LU stretávame s extenzívnou proliferáciou paraimunoblastov. Tieto prípady sa označujú ako paraimunoblastový variant, respektíve paraimunoblastová transformácia CLL (obrázok 12). SZO klasifikácia takúto entitu nepozná, čiže v súčasnosti pre ňu ani nemáme jednotné diagnostické kritériá (6). To býva nielen zdrojom diagnostických rozpakov, ale môže byť aj príčinou diagnostických omylov. Odhadovaná incidencia tejto entity je cca 2 %. Paraimunoblastový variant CLL je v zásade definovaný difúznym zmnožením paraimunoblastov, s prímesou disperzných prolymfocytov, zvýšenou mitotickou aktivitou (15 50 %) a raritne i obrazom hviezdneho neba. Počet cirkulujúcich prolymfocytov je < 10 %. Prípady bývajú zvyčajne reportované ako akcelerovaná CLL s odporúčaním dispenzarizácie pacienta pre zvýšenú pravdepodobnosť blastovej transformácie, i keď klinický priebeh ani frekvencia transformácie do DLBCL nie sú presne známe. K ďalším otvoreným otázkam bioptickej diagnostiky CLL patria prípady na hranici MBL a CLL, ako aj raritné incidentálne detegované, málo rozsiahle infiltrácie CLL/SLL bunkami v teréne reaktívnych LU (18). Diferenciálna diagnostika CLL Diferenciálna diagnostika CLL zahŕňa niektoré malobunkové NHL, obzvlášť ak tieto leukemizujú alebo prebiehajú leukemicky. Problematické bývajú aj prípady CLL s atypickým fenotypom, slabou alebo nedetegovateľnou pozitivitou CD5 alebo CD23 či silnou expresiou monotypického imunoglobulínu. Riziko zámeny zvyšuje použitie limitovaných fenotypizačných panelov alebo nedostupnosť FC analýzy. Najviac diagnostických omylov spôsobuje zámena s konvenčným, malobunkovým a/alebo leukemickým lymfómom z plášťových buniek (MCL), ktorý rovnako ako CLL exprimuje CD5. Na jeho odlíšenie slúži imunohistochemický dôkaz nukleárnej nadexpresie cyklínu-d1 a genetický dôkaz prestavby CCND1 génu (11q13). Druhým lymfómom s vyššou pravdepodobnosťou zámeny je lymfoplazmocytový lymfóm (LPL), kde hrozí zámena najmä s prípadmi CLL vykazujúcimi prominentnú plazmocytoidnú diferenciáciu, niekedy dokonca sprevádzaných paraproteínom v sére. LPL je však väčšinou CD5a CD23 negatívny, okrem plazmocytoidnej vykazuje aj plazmocytovú diferenciáciu a časť prípadov sprevádza typická IgM paraproteinémia (Waldenströmova makroglobulinémia). K zámene môže dôjsť aj s niektorým zo spektra splenických lymfómov, obzvlášť s leukemizovaným splenickým lymfómom z buniek marginálnej zóny (SMZL), variantnou leukémiou z vlasatých buniek (HCLv), prípadne inými neklasifikovateľnými splenickými lymfómami. CLL treba odlíšiť aj od prolymfocytových leukémií B-pôvodu (B-PLL) i T-pôvodu (T-PLL). Tu je nápomocnou najmä morfológia lymfoidných buniek, imunofenotypové vyšetrenie, nápadná splenomegália, rýchla progresia periférnej lymfocytózy a agresívny klinický priebeh, v časti T-PLL i kožné lézie. Raritnú B-PLL treba odlíšiť od veľmi zriedkavej prolymfocytovej transformácie CLL. Pri T-PLL sú problematické najmä prípady s malobunkovou morfológiou, ktorých býva cca 20 %. Z ďalších T-NHL môžu ešte morfológiu CLL imitovať niektoré prípady leukémie z veľkých granulovaných lymfocytov (T-LGL), ktoré boli v minulosti klasifikované ako dnes neexistujúca T-CLL, no v ére imunofenotypizácie by k týmto zámenám dochádzať nemalo. Záver Ako vyplýva z uvedeného, pri splnení určitých podmienok má aj bioptické vyšetrenie svoje miesto v manažmente pacientov s CLL. Toto vyšetrenie nemá byť vykonávané paušálne a v prípadoch, kedy poskytuje len duplicitnú informáciu k iným, menej invazívnym či neinvazívnym metódam, čo sa týka najmä diagnostiky typických prípadov, kde na potvrdenie klinicko-laboratórne suponovanej diagnózy postačuje FC vyšetrenie PK. Biopsia KD alebo ; 9(6) Onkológia

6 370 LU však býva diagnosticky nápomocná v prípadoch s atypickou cytomorfológiou alebo imunofenotypom, ako aj v prípadoch, v ktorých nebola diagnóza stanovená inými metódami, pre ich nedostupnosť alebo nejednoznačný výsledok, kde hrozí zámena s iným lymfoproliferatívnym ochorením. Bioptické vyšetrenie KD sa nemá vykonávať za účelom prognostifikácie a ani nie je potrebné na iniciálne štádiovanie ochorenia. V predterapeutickej fáze sa formálne odporúča len u pacientov s cytopéniami alebo ak sú títo zaradení do klinických štúdií a budú liečení potenciálne myelosupresívnymi schémami. Je však zrejmé, že mnohé pracoviská vykonávajú predterapeutickú štádiovú biopsiu KD štandardne u všetkých pacientov. V postterapeutickej fáze možno vyšetrenie KD využiť nielen na zhodnotenie efektu liečby, ale aj na posúdenie regenerácie krvotvorby. I keď to v rámci bežnej praxe nie je bezpodmienečne nevyhnutné, väčšina našich pracovísk vykonáva reštádiové vyšetrenie KD aj u pacientov nezaradených do štúdií. Bioptické vyšetrenie KD je zvyčajne vykonávané aj pri progresii či relapse ochorenia a je nenahraditeľné pri pátraní po príčinách pretrvávajúcej dyshemopoézy a pri podozrení na evolúciu sekundárneho postterapeutického MDS. Histomorfologické vyšetrenie LU a KD je nezastupiteľné pri podozrení na blastovú transformáciu. Literatúra 1. Balhárek T, Barthová M, Szépe P, et al. Komentár k vývoju konceptu prognostických faktorov chronickej lymfocytovej leukémie: cesta od prognostických faktorov k prediktorom liečebnej odpovede. Klinická Onkologie. 2009;22(6): Hallek M, Cheson BD, Catovsky, D, et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute Working Group 1996 guidelines. Blood. 2008;111(12): Cheson BD, Bennett JM, Grever M, et al. National Cancer Institute-sponsored Working Group guidelines for chronic lymphocytic leukemia: Revised guidelines for diagnosis and treatment. Blood. 1996;87(12): Eichhorst B, Hallek M, Dreyling M. Chronic lymphocytic leukemia: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2010;21(suppl 5):v Eichhorst B, Dreyling M., Robak T, et al. Chronic lymphocytic leukemia: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2011;22(suppl 6):vi50 vi Müller-Hermelink HK, Montserrat E, Catovsky D, et al. Chronic lymphocytic leukaemia/small lymphocytic lymphoma. In: Swerdlow, S.H. et al. (eds.). WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC, p. 7. Arber AA, George TI. Bone marrow involvement by non- -Hodgkin s lymphoma: Frequency of lymphoma types, patterns, blood involvement and discordance with other sites in 450 specimens. AmJ Surg Pathol. 2005;29(12): Zhang Q-Y, Foucar K. Bone marrow involvement by Hodgkin and non-hodgkin lymphomas. Hematol. Oncol. Clin. of Nort Am. 2009;23: Marti GE, Rawstron AC, Ghia P, et al. Diagnostic criteria for monoclonal B-cell lymphocytosis. Br J Haematol. 2005;130(3): Zenz T, Döhner H, Stilgenbauer S. Differential diagnosis, staging and prognostic factors. In: O Brien S, Gribben JG. (eds.). Chronic lymphocytic leukemia. London: Informa Healthcare, p. 11. Giles FJ, O Brien SM, Keating MJ. Chronic lymphocytic leukemia in (Richter s) transformation. Semin Oncol. 1998;25: Müller-Hermelink HK, Zettl A, Pfeifer W, Ott G. Pathology of lymphoma pregression. Histopathology. 2001;38: Tsimberidou AM, Keating MJ. Richter syndrome: biology, incidence and therapeutic strategies. Cancer. 2005;103(2): Carney DA, Seymour JF. CLL-specific complications: Autoimmunity and Richter s transformation. In: O Brien S, Gribben JG. (eds.). Chronic lymphocytic leukemia. London: Informa Healthcare, p. 15. De Leval L, Vivario M, de Prijck B, et al. Distinct clonal origin in two cases of Hodgkin s lymphoma variant of Richter s syndrome associated with EBV infection. Am J Surg Pathol. 2004;28(5): Rossi D, Cerri M, Capello D, et al. Biological and clinical risk factors of chronic lymphocytic leukaemia transformation to Richter syndrome. Br J Haematopathol. 2008;142(2): Giné E, Martinez A, Villamor N, et al. Expanded and highly active proliferation centers identify a histological subtype of chronic lymphocytic leukemia ( accelerated chronic lymphocytic leukemia) with aggressive clinical behavior. Haematologica. 2010;95(9): Gibson, S., Swerdlow, S.H., Ferry, J.A. et al. Reassessment of small lymphocytic lymphoma in the era of monoclonal B-cell lymphocytosis. Haematologica, 2011; 96(8): MUDr. Tomáš Balhárek, PhD. Ústav patologickej anatómie JLF UK a UNM Kollárova 2, Martin balharek@jfmed.uniba.sk Onkológia 2014; 9(6)