Vedecká rada Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. Mgr. Peter Gerhart. A uíoreferát dizertačnej práce

Prepis

1 Vedecká rada Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave SK99K0353 Mgr. Peter Gerhart A uíoreferát dizertačnej práce ŠPECIÁCIA RÁDIONUKLIDOV V PRÍRODNÝCH POLYELEKTROLYTOCH MLIEKA A PÔD na získanie vedecko-akademickej philosophiae doctor hodnosti v odbore doktorandského štúdia Jadrová chémia Bratislava

2 DISCLAIMER Portions of this document may be illegible in electronic image products. Images are produced from the best available original document.

3 Dizertačná práca bola vypracovaná v dennej forme doktorandského Studia na Katedre jadrovej cliémic Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave PralklaJali-ľ: Mgr. Peter Cícrhart WERT. s.r.o.. «>!9 31 Jaslovské Bohunice Školiteľ: Prof. UNl)r. Fcdor Macásck, DrSc, Prírodovedecká fakulta UK Oponenti: Prof. Inp. Vasil Koprda, DrSc, Chemickotechnologická fakulta STU, Bratislava Doc. RNDr. Rudolf Kopuncc, CSc., Prírodovedecká fakulta UK. Bratislava KNDr. Vladimir Šŕasnár, CSc.. Ústav experimentálnej farmakológie SAV, Bratislava Autorcfcrát bol rozoslaný dňa. r< ^. / fs /j/j /)L* 0 Obhajoba dizertačnej práce sa koná dňa.í^ľíííh.".../../.».. o../.../.j hod. pred komisiou pre obhajobu dizertačnej práce v odbore doktorandského štúdia Jadrová chémia vymenovanou predsedom spoločnej odborovej komisie dfla na Prírodovedeckej fakulte l'k Mlynská dolina, Bratislava, v miestnosti VR PriF UK. pavilónu B-1 č Predseda spoločnej odborovej komisie: Prof. RNDr. Fcdor MacáSck, DrSc. Katedra jadrovej chémie PriF UK Mlynská dolina Cf h Bratislava

4 1. Súčasný stav problematiky V poslednom období sa začali v chemickej analýze hľadať nové možnosti na získanie informácií o fyzikálno-chemickej forme vo vzorke nachádzajúcich sa rôznych prvkov, zložiek a komponentov. Toto poznanie je dôležité preto, že environmentálny a toxický efekt závisi v prevažnej miere práve od chemickej formy, v akej sa prvok, komponent vo vzorke nachádza (1-13). Takýto prístup riešenia sa začal nazývať špeciácia (I. 14). Ustanovenie významu špeciácie prešlo určitým vývojom (15-17). Postupne sa ustálilo definovanie špeciácie tak, že sa ňou rozumie proces identifikácie a kvantifikácie rozličných ľyzikálno-chemických foriem daného prvku v rôznych fázach a matriciach vzorky ( ). Význam kontaminácie kravského mlieka a mliečnych produktov rádionuklidmi (najmä rádiocéziom. rádiostronciom a rádiojódom) začal mať väčší význam ako dôsledok intenzívnych skúšok jadrových zbraní a začiatkov prevádzok jadrových elektrární (22, 23, 24 slrl4 \ 25 strlä0, 26 sulí6, 27 SIrl 2 ). Avšak až po havárii Černobyľskej jadrovej elektrárne sa problematike kontaminácie, dekontaminácie a možnostiam viazania rádionuklidov na jednotlivé časti mlieka začala venovať väčšia pozornosť ( SIľ '*'. 27 s " m, 28-34). Človek cez mlieko a mliečne výrobky prijíma až 55% w Sr a 60% U7 Cs {24 s1 ' Mrl " ). Významnými natívnymi kontaminantami mlieka môžu byť ďalej ťažké prvky, ako napr. olovo, ortuť (37 strg ). 70 až 90% Pb je po resorbcii kumulovaného v organizme človeka (38). Nebezpečnosť olova spočíva najmä v blokácii tiolových skupín enzýmov, čo sa najvýraznejšie prejavuje v mechanizme jeho inhibičného vplyvu na syntézu hemoglobínu (37 st ' r9 \39). Jedny z najperspektívnejších separačných sústav z hľadiska nami vytýčeného cieľa boli vodné dvojfázové sústavy a vysokoúčinná gélová chromalografia s využitím Jenness- Koopsovho pufru simulujúceho mliečne sérum (40). Antonov a kol. (41-46) demonštrovali možnosť vytvoriť pre získavanie mliečnych bielkovín vodnú dvojfázovú sústavu pomocou rôznych polysacharidov (napr. pektínu, alginátu, dextránu, arabskej gumy a pod.). Vlastnosťou tohto systému je odvodnenie a zakoncentrovanie proteínov. Tento proces bol nazvaný bezmembránová osmóza" (42). Nami vybraný polysacharid pektín je vysokomolekulárny polyuronid rastlinného pôvodu. Účinnosť pektínu závisi od stupňa jeho esteriťikácie (47-53). Vo viacerých prácach sa skúmala väzbovosť rôznych iónov (Ca 2 *, Sr 2 \ Ba 2 *, Sn 2 *, Cr 3f ) na pektínový reťazec (43, 49-51,54). Gokten a kol. (55-57) na stanovenie syrovátkových bielkovín použili detergent Aerosol OT, pomocou ktorého sú proteiny extrahované do izooktánu. Molochnikova. Spivakov a kol. študovali vo svojich prácach (58-61) extrakčné sústavy nasýtených vodných roztokov K 2 CO 3, Na 2 CO 3, (NH 4 ) 2 COj a aktinoidov s polyetylénglykolom Sústavu 6% vodný roztok dextránu a 4.5% vodný roztok polyetylénglykolu pripravil a popísal Albertsson (62). Podobne na očistenie biopolymérov použil vo svojej práci dvojfázový vodný systém s roztokom polyméru za prítomnosti solí Johansson (63). Vápnik predstavoval najrozsiahlejšiu skupinu prác sledujúcich distribúciu kovu v mlieku. Z hľadiska biologickej hodnoty je vápnik jedným z najvýznamnejších prvkov nachádzajúcich sa v mlieku (64, 65). Viaceré práce ukázali, že časť vápnika je viazaná na proteiny, časť asociovaná s rôznymi ligandami mliečneho séra a zvyšok je v iónovej, difuzibilnej forme (22. 24, ). Minimálne množstvo sa ho nachádza v emulznej fáze (25 str " v ).

5 Va/bovosľ vápnika a viacerých iných kovov na rôzne proteiny (najmä' ctlakioalbumin) pomocou SliC (77-81) a kombináciou rôznych metód (elektroforéza, fluorescencia, atómová absorbčná spektrometria) (82) si všímali viacerí autori. ; Značná skupina prác sa venovala špeciácii zinku v materskom a kravskom mlieku. Výskum sa robil na vysvetlenie príčiny choroby malých delí acrodermatitis enteropathica, ktorá vzniká pri nedostatočnom prísune zinku do organizmu dieťaťa. Chancy (83) priznáva určitú nejednotnosť vo vysvetľovaní daného problému. Pomocou SI-C (84) a ultraľiltrácic (85) bolo zistené, že Zn je asociovaný v kravskom mlieku s frakciami s vysokými molekulovými hmotnosťami a v materskom mlieku s nízkou " molekulovou hmotnosťou. V sére materského aj kravského mlieka je zinok viazaný najmä i citrátom (85-90). Predmetom záujmu bola nielen distribúcia Fe, Cd a H g, ale i dekontaminácia mlieka od ťažkých toxických kovov (91-93). * Coni a kol. (94) sledovali vysokoúčinnou gélovou chromatografiou špeciáciu Mg, Sr, Ba. Pb. Cd. Zn, Cu. Sc. Mn, Fe. Ni. Co, Cr a Al v rôznych typoch mlieka. Štúdiu viazania kovov v ľudskom sére na prítomné proteiny, sa venovalo niekoľko prác. ktoré si všímali najma' špeciáciu hliníka (pre jeho toxický charakter, postihujúci hlavne pacientov s chronickými chorobami obličiek) (95-100), vápnika (101), ďalej železa (95, ). zinku (16). sclénu(io5, 106), chrómu (6, 16), arzénu (5, 16). ; Najvýznamnejšími Ugandami hliníka sú citrát, albumín a transferín (95-100); železa transferin a feritín (95, ); chrómu transferin (6). Huminové kyseliny, ako degradačné produkty biologických látok Humínové látky, ktoré sa delia na huminové kyseliny a fulvokyseliny, predstavujú heterogénny komplex molekúl ( ), ktoré hrajú významnú úlohu v environmentálnych, geochemických procesoch a fyziológii rastlín (111, 112). Frakcionáciu podľa molekulovej hmotnosti pôdnych humínových látok pomocou HP- SF.C sledovali viacerí autori (108, 109, 113, 114). Pozorovali významný vplyv ph a iónovej sily na distribúciu huminov. 1 luminové látky pre svoje ionovýmenné vlastnosti sú významné komplexátory, zachytávajú a kumulujú na nerozpustných humínových kyselinách rôzne prvky a zlúčeniny, čim sa stávajú súčasťou ich kolobehu v prírode.! Technika SHC sa od práce Gjcssingera (115) ukázala jednou z najvhodnejších na ', sledovanie špeciácie kovov a rádionuklidov medzi frakciami huminových kyselín. Viaceré práce ( ) modifikovanou I lummcl-drcycrovov metódou SEC a papierovou chromatografiou sledovali komplexáciu kovov na huminových látkach. Zo štúdia komplexov medi. zinku, hliníka a železa s humínovými kyselinami sú kovy viazané na frakcie s vyššou molekulovou hmotnosťou (120). Livens a Singleton (121) sledovali distribúciu 239i240 Pu a :41 Am na humínových ' látkach. Len 23.4% Pu a 23% Am je sorbovaného na organickej matrici, pričom Pu nepatrne i' viac preferuje vysokomolekulové frakcie huminových kyselín a Am nízkomolekulárne fulvokyseliny. ' Chirkst á kol. ( ) riešili problém dekontaminácie pôdy, najmä humínových! kyselin, oú nasorbovaného '"'Cs. Stanovili tiež konštantu stability komplexu rádiocéziumfrakcie huminových kyselín na log K.=6.0. Stým súhlasia výsledky Agapkina a koľ (124, 125). že 70-85% cé/.ia doprevádza huminové frakcie s molekulovou hmotnosťou Mw 900- j 1000 a celkovo 80-95% stroncia bolo nájdených na frakciách s molekulovými hmotnosťami j okolo 330 Da. '

6 1.1. Literatura (1) Morrison. G.M.P. Batlcy. G.E.. Florence, T.M.. Chemistry in Britain (1989). (2) Bchne. D.. Analyst (1992). (3) Chakrabarti, C.L.. Lu. Y.. Cheng, J.. Back, M.H., Schroeder, W.H.. Anal. Chim. Acta 267, </7(1993). (4) Papofľ, P., Bctti. M., Fuoco. R., Jn: Paltcrson. J.W.. Passino, R., (eds) Metals Speciation, Separation, and Recovery 1, Volume II. Lewis publishers. Chelsea (5) Demesmay. C. Olle, M., Porthault, M., Frcscnius J. Anal. Cheni. 348,205 (1994). (6) Comelis, R., Borguet, F.. De Kimpc, J., Anal. Chim. Acta 283, 183 (1992). (7) Burgess, J., Analyst 117, 605 (1992). (8) Urasa, I.T., In: Caroli, S., (eds) Elemental Speciation in Bioinorganic Chemistry, J. Wiley, New York (9) Thompson, J.J., Houk. R.S., Anal. Chem. 58, 2541 (1986). (10) Gardiner, P.E.. Fresenius J. Anal. Chem ^7(1993). (11) Al-Rashdan, A.. Vela. N.P., Caruso. J.A., J. Anal. At. Spectrom. 7, 551 (1992). (12) Wolf, W.R., In: Bernhard, M.. Brinckman, F.E., Sadler, P.J., (eds) The Importance of Chemical "Speciation" in Environmental Processes, Springer, Berlin (13) Duffield, J.R., Williams, D.R., Chemistry in Britain 25, 375 (1989). (14) Florence, T.M.,Talanta 29, 345 {1982). (15) Bernhard, M., Brinckman, F.E., lrgolic, K.J., In: Bcmhard, M., Brinckman, F.E., Sadler, P.J., (eds) The Importance ofchemical "Speciation" in Environmental Processes, Springer, Berlin (16) Cornelis, R., De Kimpc, J., J. Anal. At. Spectrom (1994). (17) Mazzucotelli. A.. Frache, R., Viarengo. A.. Martino. G.. Talanta 35,693 (1988). (18) Urasa, I.T., Mavnra. W.J., Lewis, V.D., Nam, S.H., J. Chromatogr. 547, 211 (1991). (19) Ure, A.M., rresenius J. Anal. Chem. 337, 577 (19901 (20) Crews, H.M., Massey, R., McWeeny, D.J., Dean, J.R., J. Res. Nat. Bur. Stand. 93, 349 (1988). (21) Christie, G.L., In: Fifield, F.W., Haines, P.J., (eds) Environmental analytical chemistry, Chapman & Hall, London (22) Smith, G.L., Rees, S.B., Williams. D.R., Polyhedron 4, 713 (1985). (23) Measurement of Radionuclides in Food and the Environment, A Guidebook, IAEA, Vienna (24) Walstra, P., Jenness, R., Dairy Chemistry and Physics, J. Wiley and Sons, New York (25) Lengemann, F.W., Wentworth, R.A., Comar. C.L, In: Larson, B.L., Smith, V.R.. (eds) Lactation, V.3: Nutrition of Milk/Maintenance, Academic Press, New York (26) Pijanowski, E., Základy chémie a technológie mliekarenstva, I. diel. Príroda. Bratislava (27) Koprda, V., Vnútorná kontaminácia rádioaktívnymi látkami. Veda. Bratislava (28) Anspaugh, L.R.. Catlin, R.J., Goldman. M., Science 242, 1513 (1988). (29) Koch, J., Tadmor, J., Health Physics (1986). (30) Hôtzl, H., Rosner, G., Winkler. R.. Radiochim. Acta 41, 181 (1987). (31) Devell, L.. Tovedal, H., Naiure321. /W (1986). (32) Ward. G.M., J. Dairy Sci. 72, 284 (1989). (33) Wilson, L.G., Bottomley, R.C., Sutton, P.M., Sisk, C.H.. J. Soc. Dairy Technology 41, 10 (1988). (34) Fifield, F.W.. In: Fifield, F.W., Haines, P.J., (eds) Environmental analytical chemistry, Chapman & Hall. London (35) Wong. N.P., Jennes, R., Kecney. M., Marth, E.H., (eds) In: Fundamentals of Dairy Chemistry, 3rd Ed., Van Nostrand Reinhoíd. New York (36) Wasserman, R.H., Corradino, R.A., Annu. Rev. Biochem. 40, 501 (1971). (37) Grieger, C, Holec. J.. a kol., Hygiena mlieka a mliečnych výrobkov. Príroda. Bratislava (38) Ward, N.I., In: Fifield. F.W., Haines. P.J., (eds) Environmental analytical chemistry. Chapman & Hall. London (39) Kain. W.. Schwedenski. B.. Bioinorganic Chemistry. J. Wiley. New York (40) Jcnncss, R.. Koops, J.. Neth. Milk Dairy (1962). (41) Antonov. Yu.A.. Grinberg. V.Yu., Tolstoguzov. V.B., Nahrung (1979). (42) Zhuravskaya, N.A.. Kiknadzc. E.V.. Antonov. Yu.A., Tolstoguzov. V.B.. Nahrung (1986). (43) Antonov. Yu.A., Kiknadzc. E.V., Nahrung (1987). (44) Antonov. Yu.A.. Zhuravskaya, N.A.. Tolstoguzov. V.B.. Nahrung 29. i9(1985). (45) Zhuravskaya. N.A.. Kiknadze, Ľ.V.. Antonov. Yu.A., Tolstoguzov. V.B.. Nahrung (1986). (46) Kiknadze. E.V., Zhuravskaya. N.A.. Serov. A.V.. Antonov. Yu.A.. Tolstoguzov, V.B.. Nahrung 30, 1009 (1986).

7 (47) Kohn. R., Funto. I.. Hang. A.. Smidsrod. 0.. ActaChem. Scand. 22. J09<?(I968). (48) Kohn. R.. Pure Appl. Chcm. 42, i'/(!975). (49) Kohn. R. Luknár. 0., Coll. Czcchosl. Chem. Commun (1975). : (50) Maloviková. A.. Kohn. R.. Coll. Czechosl. Chem. Commun (1979). (51) Kohn, R.. Tibcnsky. V.. Coll. Czechosl. Commun. 36, 92 (1971). (52) Kohn. R.. Furdn. I.. Coll Czechosl. Commun. 32, 4470 (1967). (53) Lin. C.F.. In: Graham. H.D.. (eds) Food Colloids. AVI Publishing Co.. Wcstport (54) Weber. G.. Anal. Chim Acta (1987). (55) Goklen. K.E.. Hntton. T.A.. Sep. Sci. Technol. 22. Si/(1987). ; (56) Goklen. K.Ľ.. Hatton. T.A.. Biotech. Prog. I. 69(1985). * (57) Goklen. K.E.. Hntton. T.A.. Proceedings IISECS6, Vol (1986). I \ (58) Molochnikova. N.P.. Frcnkel. V.Va.. Myasocdov, B.F.. Shkinev, V.M.. Spivakov. B.Yu., Zolotov. Yn.A.. Radiokhimiya I..19(1987). \ \ (5^) Molochnikova. N.P. Frenket. V.Ya.. Myasocdov, B.F.. Shkinev, V.M., Spivakov. B.Yu., Zolotov. Yu A.. Radiokhimiya 3. -L?0(I987). * (60) Shkinev. V.M.. Molochnikova. N.P., Zvarova, T.I., J. Radioanal. Nucl. Chem., Articles 88, //5(I985). (61) Molochnikova. N.P. Shkinev, V.M., Spivakov, B.Yu.. Zolotov. Yu.A., Myasoedov, B.F., Radiokhimiya J<>. M (1988). (62) Albcrtsson. PA.. Partition of Cell Particles and Macromolecules. 3rd Ed.. J. Wiley, New York (63) Johansson. G..J. Biotechnology 3.//(1985). (64) Marshall. K.R.. In: Fox, P.F.. (eds) Developments in Dairy Chemistry, 1. Proteins, Appl. Sci. Publ., London (65) Schmidt. D.G., In: Fox, P.F., (cds) Developments in Dairy Chemistry, 1. Proteins. Appl. Sci. Publ., ' London j (66) Holt. C. Dalglcish. D.G.. Jenness. R.. Anal. Biochem /5-/(l98l). j (67) Abrams. S.A., Vicira. N.F... Ycrgcy. A.Ľ. J. Nutr /<572(l990).! (68) Varnám. AIL, Sutherland. J.P. Milk and milk products, p. 23, Chapman & Hall, London (69) Rcykdal. O.. Lee. K.. J. Food Sci (1991). (70) Aoki. T.. Kawahara. A.. Kako. Y.. Imamura, T., Agric. Biol. Chcm /7(1987). (71) Gaines, T.P.. West. J.W.. McAllister. J.F.. J. Sci. Food Agricult. 51, 207 (1990). (72) Van Staden. J. F., Van Rensburg, A., Analyst 115, 605 (1990). j (73) Van Staden. J.F.. Van Rensburg, A., Fresenius J. Anal. Chem. 337, 393 (1990). i (74) Twardoc. A.R.. Prinr, W.H.. Comar, C.L. Arch. Biochem. Biophys (1960V (75) Keller. R.P.. Casey. C.E.. Neville. M.C.. Faseb J. 2, Ao>3 (1988).' j (76) MacáSek. F.. Kobclová, I. Sbomik Konference Scparačnf metody v chemii", VVŠ PV Vyškov, Vyíkov2.-5 Listopad (77) Lonnerdal, B.. Glazier, C. J. Nutr I2O9{ 1985). (78) Vogel, H.J.. Lindnhl, L.. Thulin. E.. FEBS Leu (1983). (70) Vogel. H.J.. Thulin. E.. Lindahl. L. Dev. Biochem (1983). (80) Wu. S.L.. Figucron, A., Kargcr. B.L., J. Chromatogr. 371, 3 (1986). (81) Murakami. K.. Andrcc. P.J.. Berliner. L.J., Biochemistry 21, 5488 {\9S2). i (82) Berliner. L.J.. Mcinholtz. D.C.. llirai. Y.. Musci, G.. Thompon. M.P.. J. Dairy Sci. 74, 2394 (1991). j (83) Chancy. R.L.. In: Kramer. JR., Allen, H.E., (eds) Metal Speciation: Theory, Analysis and Application, second editions. Lewis publishers. Chelsea (84) Hckhcrt. CO., Sloan. M.V.. Duncan, JR., Hurley. L.S.. Science 95, 7,?O(1977). (85) makeborough. P.. Saltcr. D.N.. Gurr. Ml, Biochem. J. 209, 505(1983). í (86) Ľvans. G.W.. Johnson. P.Ľ.. Brushmiller. J.G.. Ames. R.W.. Anal. Chem (1979). ijl (87) Lonnerdal. B.. Stanislowski. A.G., Hurley. L.S.. J. Inorg. Biochem. 12, 7/(1980). (88) Manin, M.T., Lichlider. K.F.. Brushmiller. J.G.. Jacobs. F.A.. J. Inorg. Biochem. 15,55(1981). l,i (8 1?) Mariin. M.T. Jacobs. F. A., Brushmiller. J.G., J. Nutr. 114, 569(1984). ; (90) Michalke. B.. Munch. DC. Schramcl, P.. J. Trace Elem. Electrolytes. Health. Dis (1991). * (91) Roh. J.K.. Bradley. R.L.Jr.. J. Dairy Sci (1975). O2) Roh. J.K., Bradley. R.L.Jr. J Dairy Sci. 59. Jľrf( 1976). í (93) Nash. J.J.. Jones. S.1V. Kalan. E.B. J. Dairy Sci (1974). ; (94) Com. Y... Alimunti. A. Bocca. A.. La Torre. F.. Piz/uti, D.. Caroli. S., In: Caroli, S., (eds) Elemental Speciation in Bioinorganic Chemistry. J. Wiley. New York j (95) Van Landeghem. G.F.. D'Haese. PC. Lamberts. L.V.. De Broe. M.. Anal. Chem. 66, 2//5(l994). ]

8 (96) Gonzalez. E.B.. Parajón, J.P., Alonso, J.I.G.. Sanz-Medcl, A.. J. Anal. At. Spectrom. 4, 175 (1989). (97) Wrobel. K.. Gonzalcs. E.B., Wrobcl. K., Sanzincdcl, A.. Analyst (1995). (98) Leung, F.Y., Niblock, A.E., Bradley. C. Henderson. A.R.. Sci. Total. Environ. 71, 49 (1988). (99) Keirssc. H., Sineyers, J., Vcrbeelen. D., Massart. D.L.. Anal. Chim. Acta 196, 103 (1987). (100) Favarato, M.. Mizzen, C.A., Sutherland. M.K.. Krishnan. 13., Kruck, T.P.A., Crapper. D.R., Clin. Chim. Acta 207, 41 (1992). (101) TofFalciti, J., Savory, J., Gitelman, H.J., Clin. Chcm (1977). (102) Stuhne-Sekalec. L, Xu, S.X., Parkes. J.G., Olivieri. N.F., Templcton, P.M., Anal. Biochem. 205, 278 (1992). * (103) Takatera, K.. Watanabe.T., Anal. Sci. 7, (595(1991).! i (104) La Torre, F.. Violante, N., Senofonte, O.. D'Arpino, C.D., Caroli, S., Ann. 1st. Super. Sanita 25, 481 (\9&9). f S (105) Shum,S.C.K., Houk. R.S., Anal. Chem. 65, 2972(1993). (106) Suzuki, K.T., Uoh, M.. Ohmíchi, M.. J. Chromatoiir. Ei (1995). * (107) Stevenson, F.J.. Humus Chemistry; Genesis, Composition, Reactions, p. 285n, J. Wiley, New York (108) Kipton, H.. Powell, J., Town, R.M., Anal. Chim. Acta 267, 77(1992). (109) Mori, S.. Hiraide, M., Mizuike. A.. Anal. Chim. Acta 193, 2J/ (1987). (110) Yonebayashi. K Hattori. T., Geodcrma 47, 327 (1990). (111) Grenthe. I., Radiochim. Acta (1991). (112) Takamatsu. T., Kusakabe, R., Yoshida, T., Soil Sci. 136, 371 (1983). (113) Birdén. M., Berggren, D.. J. Soil Sci. 41, 0/(1990). (114) Hine, P.T.. Bursill, D.B., Water Res (1984). (115) Gjessing, E.T., Nature 208,1091 (1965). (116) Adamic, M.L., Barták, D.Ľ., Anal. Chcm. 57, 279(1985). (117) Kuiters, A.T., Mulder, W., J. Soil Sci. 44, 501 (1993). (118) Warwick, P., Hall, A., Shaw, P., Higgo, J.J.W., Williams, Smith, Haig, D., Radiochim. Acta 52, 465(1991). (119) Karapanagiotis, N.K., Sterritt, R.M., Lester, J.N., Environmental Pollution 67, 259 (1990). (120) Kribek, K., Kaigl, J., Gruzínsky, V., Chem. Geol. 19, 73 (1977). (121) Livens, F.R., Singleton, D.L., J. Environ. Radioactivity 323 (1991). (122) Chirkst, D.Eh., Chaliyan, K.N.. Chaliyan, A.G., Radiokhimiya 36, 459 (1994). (123) Chirkst, D.Eh., Chaliyan, K.N.. Chaliyan, A.G., Radiokhimiya 36, 462 (1994). (124) Agapkina, G.I., Tikhomirov, F.A., Proc. Ail-Union Symp. Principles of Geochemical Onvestigations of Radionuclide Migration", Suzdal , p. 90, Geokhi AN SSSR, Moscow (125) Virchenko, E.P., Agapkina, G.I., In: Proc. Int. Symp. On Radioecology, Znojmo , CEC Intern. Union Radioecology 1992.

9 2. Ciele dizertačnej práce Predmetom výskumu bolo sledovanie špeciácic pridaných významných štiepnych produktov (stroncia, cézia. curópia a tcchnécia), natívnych iónov (Na +, K\ Mg 2 *, Ca 2+ a Sr 2+ ) v nespracovanom kravskom mlieku a 2l2 Pb ako rádioaktívneho indikátora ťažkého kovu, ktorý je jeho významným natívnym kontaminantom s ohľadom na jeho bioaktivitu. Integrálnu súčasť práce predstavovalo štúdium distribúcie 90 Sr a l37 Cs na jednotlivých frakciách,,ú huminových kyselin, ktoré sú produktmi degradácie biologických matríc. {I Cieľom Štúdia bolo stanovenie distribúcie a chemickej formy, t.j. špeciácie, najmä voľných iónových foriem rádionuklidov, bez vážnejšieho narušenia fyzikálno-chemickej štruktúr.- mlieka a možnosti jeho dekontaminácie, stanovenie podielu jednotlivých frakcií humínových kyselín na viazaní pridaných rádionuklidov. Pre splnenie vytýčených cieľov boli zvolené také separačné sústavy, ktoré minimalizujú zásahy do prírodného stavu rádionuklidov v čerstvom mlieku a humínových látkach izolovaných z pôd. í

10 3. Metody spracovania Čerstvé, odtučnené kravské mlieko sa stabilizovalo v 0.05% roztoku HiOj. Mlieko sa označilo pomocou rádionuklidov 85 Sr, 137 Cs. l52 Eu a 2l2 Pb (spolu s izotopovým nosičom Pb, ktorého koncentrácia v mlieku bola 10"" mol/l) rozpustených v Jenncss-Koopsovom pufre (1.5mL, 0. IMBq/mL) a uskladnilo pri 4 C do merania distribúcie rádionuklidov. Citrusové a jablčné pektíny so známym stupňom esterifikácie a obsahom galakturónovej kyseliny sa očistili od kyseliny pektovej a označili za tých istých podmienok ako mlieko. Experimenty s neaktívnym stronciom sa urobili pridaním 0.15 mg Sr 2+ na 7 ml mlieka alebo 3 ml pektínového roztoku. ph označeného mlieka bolo v rozsahu 6.5 až 7.0. ph pektínového roztoku sa pohybovalo v rozmedzí 6.4 až ml 4% (w) vodného roztoku pektínu sa pridalo ku 7 ml mlieka. Jeden z roztokov bol označený rádionuklidom. Fázy sa premiešavali magnetickou miešačkou 15 minút a následne odseparovali centrifugáciou pri g 20 minút. Extrakcia s Aerosólom OT (Sigma) v izooktáne sa urobila zmiešaním 5.0 ml značeného mlieka s 5.0 ml izooktánu a 5.0 ml 10% vodného roztoku Aerosolu OT. Katex Dowex 50X8 (Dow Chemicals) premytý 1M NaCl a saturovaný pretrepávaním s Jenness-Koopsovým pufrom, sa uvádzal do rovnováhy s 5 ml vodných roztokov (pektínu, Jenness-Koopsovho pufru) alebo mlieka 2 hodiny pri 20 C. Objemy rovnovážnych fáz sa stanovili volumelricky. Merná aktivita odvážených vzoriek po oddelení fáz sa merala pomocou jednokanálového scintilačného detektora NP-420 (Maďarsko) obsahujúceho kryštál Nal(Tl) s neistotou merania 1% a 5% pre nízkoaktívne vzorky. Sledovanie distribúcie natívnych iónov v mlieku sa robilo na Perkin-Ľlmer Atomic Absorption Spectrophotometer Model 1100, v plameni: vzduch-acetylén. Vzorky sa najprv vysušili pod infralampou a spopolnili pri 550 C. Popol sa rozpustil v 2.5 ml kone. HCI a doplnil destilovanou vodou do 50 ml. Pre Mg sa použila spektrálna čiara nm, pre Ca nm. pre Sr nm, pre Na nm a pre K nm. Cliromatografická analýza sa robila pre mlieko na kolóne Biosep-SEC-S (Phenomenex), pre huminové kyseliny na kolóne Micro-aquagel (Chrompack) pomocou lsochrom lsocratic Pump (Spectra-physics). Na detekciu sa sériovo zapojili: UV detektor LCD 2040 (Laboratorní přístroje Praha) pri 280 nm pre mliečne vzorky, pri 240 nm pre huminové kyseliny a prietokový scintilačný detektor v koincidenčnom zapojení s tuhým scintilátorom Ca(Y)F 2. Mobilnou fázou bol Jenness-Koopsov pufor (ph 6.8), ktorý sa pred použitím degasoval pomocou ultrazvuku a přefiltroval cez acetátcelulózový membránový filter 0.45 um. Prietok bol 1 ml/min. Objem nástreku bol 0.02 ml. Na kalibráciu sa použili proteínové štandardy (hovädzí a kurací albumín, aldoláza a p-kazeín), blue dextrán a set polyetylénglykolových štandardov. Odtučnené mlieko sa označilo vybraným rádionuklidom prostredníctvom Jenness- Koopsovho pufru ( 90 Sr 10 kbq/ml mlieka s rádionuklidovou čistotou 98%. 99 Tc 40 kbq/ml mlieka. l37 Cs 20 kbq/ml mlieka a l52 Eu 20 kbq/ml mlieka) a odložilo pri 4 C na 30 min. Vzorka sa pred injeklovanim přefiltrovala pomocou acctátcelulózového membránového filtra 0.45 um. Podobne sa označili i huminové kyseliny (Aldrich). Po pridaní rádionuklidu (^Sr 10 kbq/ml, l37 Cs 20 kbq/ml) sa vzorka na 30 min. odložila pri 4 C a pred separáciou přefiltrovala pomocou acelátcelulózového membránového filtra 0.45 j.im.

11 4. Hlavné výsledky práce 1. Spomedzi separačných sústav použitých na delenie zložiek mlieka a sledovanie špcciácie v jednotlivých jeho frakciách, vyhovujúcich kritériu minimálneho ovplyvňovania chemických foriem viazaných rádionuklidov, sa vybrali: distribúcia vo vodných dvojfázových sústavách odtučnené mlieko - polysacharid pektín, polyetylénglykol mlieko, extrakcia nízkomolekulámych bielkovinových miciel s detergentom Aerosol OT do izooktánu a vysokoúčinná gélová chromatografia. 2. Po pridaní rádionuklidov k čerstvému, odtučnenému kravskému mlieku (v Jenness- Koopsovom pufre simulujúcom mliečne sériím) a po kontaktovaní označeného mlieka so 4% (w) vodným roztokom jablčného pektínu, 80% cézia, 22% stroncia a menej než 1.5% európia prešlo do pektínovej fázy. 3. Rozdelenie pridaných rádionuklidov v sústave mlieko-pektín sa opísalo ako bezmembránová osmóza" a vyhodnotilo pomocou modelu Donnanových membránových rovnováh. Nepodarilo sa získať jednoznačný záver vplyvu rozdeľovacieho pomeru od stupňa esterifikácic pektínu na delenie iónov v dvojfázovej vodnej sústave mlieko-pektín. 4. Zakoncentrovanie rádionuklidov v mliečnej fáze je možné len v prípade, ak ich distribučný pomer je dostatočne vysoký. Platí to najmä pre multivalentné elementy. Z tohto dôvodu dekontaminácia mlieka pomocou natívneho pektínového roztoku (bez pridania komplexotvorného činidla) môže byť účinná len pre Cs. 5. Proces vodnej bezmembránovej osmózy z mliečnej do pektínovej fázy je rýchly a je spojený s 3.5- až 4.7-násobnou redukciou mliečnej fázy. 6. Kinetika distribúcie rádionuklidu závisí od jeho distribúcie v mikroheterogénnej podsústave (osobitne medzi kazeínom a ostatnými proteínovými micelami a mliečnou plazmou) a v makroheterogénnej sústave mlieko-pektín ako celku (najmä od plochy medzifázového rozhrania a viskozity fáz). Tento proces je dostatočne rýchly (hoci viskozita v mliečnej fáze počas kontaktu vzrastá). 7. Na základe výsledkov výťažkov rádionuklidov do pektínovej fázy v sústave mliekopektín sa dá určiť podiel difuzibilncj formy daného rádionuklidu v sledovanej matrici v závislosti od použitého modelu vyhodnotenia. Model A: vychádza z podielu transferu difuzibilných foriem pri bezmembránovej dialýze z mliečnej do pektínovej fázy, bez ohľadu na objem vymieňaných špécií v sústave. Podiel difuzibilnej formy rádionuklidov tak predstavuje 99% pre cézium, 43% pre stroncium a 3.2% pre európium. ' Model B: hodnota vypočítaná modelom A môže byť nadhodnotená v prípade, ak ide o dynamickú rovnováhu medzi jednotlivými formami (najmä ak čas separácie prekračuje relaxačný čas medzi koloidnou a tónovou formou). Percento difuzibilnej formy rádionuklidov potom predstavuje 96% pre cézium, 13% pre stroncium a 0.75% pre európium. 8. Štúdium viazania rádionuklidov mliečnymi proteínmi s molekulovou hmotnosťou nižšou než pomocou kvapalinovej extrakcie s aniónovým biologickým detergentom Aerosólom OT neprinieslo jednoznačný výsledok. S pojyetylénglykolom sa nami využiteľné dvojfázové vodné sústavy s mliekom netvoria. 9. Rozlíšenie špécii rádionuklidov komplexovaných s Ugandami mliečneho séra a ich podiel z makromolekulárnych špécii mlieka sa sledovalo pomocou sorbcie na katexe Dowex 50X8 nasýteným so zložkami simulovaného mliečneho séra. Podiel viazaného rádionuklidu na vysokomolekulárne Ugandy je v rozmedzí 42% pre Cs, 69% pre Sr a 60% pre Eu. lo

12 10. Zistili sa rozdiely distribúcie 2l2 Pb medzi surovým (nespracovaným) a pasterizovaným mliekom, čo je spôsobené čiastočnou denaturáciou proteínov v mliečnom sére pasterizovaného mlieka. Zadržanie katiónu Pb" + v mliečnej fáze korešponduje s chovaním sa trojmocných iónov. 11. Pre štúdium špeciácic pridaných štiepnych produktov 90 Sr, 99 Tc, l37 Cs a 152 Eu v surovom kravskom mlieku sa použila vysokoúčinná gélová rádiochromatografia s kolónou Biosep-SEC-S. Mobilnou fázou bol Jenness-Koopsov pufor, simulujúci mliečne sérum. Chromatogratlckou separáciou sa odseparovalo 6 frakcií kravského mlieka. Na neproteínových frakciách sa delegovalo 100% l37 Cs, 17% 99 Tc, a 57% 90 Sr. Na frakciách nízkomolekulárnych proteínov sa komplexovalo 11% 90 Sr a 76% l?2 Eu. 32% 90 Sr a 24% l52 Eu bolo identifikovaných na vysokomolekulárnych proteínových frakciách. Efekty neideálnej gélovej chromatografie sa prejavili pri separácii mlieka označeného 9 Tc. 83% Tc sa eluovalo za celkovým objemom mobilnej fázy v kolóne. 12. Vysokoúčinná gélová chromalografia a vysokoúčinná gélová rádiochromatografia s kolónou Micro-aquagel sa použili pre sledovanie rôznych vplyvov na chromatografiu humínových kyselín a identifikáciu ich interakcií s rádiocéziom a rádiostronciom. Chromatografické správanie humínových kyselín a ich komplexov je silno ovplyvnené koncentráciou solí a ph mobilnej fázy a koncentráciou humínových kyselín vo vzorke. Pri nízkej iónovej sile a v slabo kyslej oblasti ph sú humínové kyseliny separované v troch frakciách s efektívnymi molekulovými hmotnosťami v rozsahoch: >760 kda, kda a <5 kda. Rádiocézium bolo nájdené v nízkomolekulárnych frakciách (<1 kda) humínových kyselín a nezaregistrovala sa žiadna signifikantná interakcia s frakciami majúcimi vyššiu efektívnu molekulovú hmotnosť. Rádiostroncium naopak interaguje s obidvomi odseparovanými frakciami humínových kyselín v rozsahu 2-5 kda, pričom menšia časť 90 Sr je komplexovaná frakciami s nižšou molekulovou hmotnosťou. n

13 Prínos dizertačnej práce pre prax a ďalší rozvoj vedy Prírodné polyclektrolyty. osobitne proteiny, polysacharidy a humínové látky, v dôležitej miere ovplyvňujú pohyb rádionuklidov v životnom prostredí a v potravinových reťazcoch. Mlieko a mliečne výrobky ako jedny z viacerých zdrojov vstupu rádionuklidov a toxických iónov do organizmu človeka predstavujú možnosť zvýšenia radiačnej záťaže obyvateľstva a kontaminácie organizmu ťažkými kovmi. V súlade stým je dôležité poznať Špcciáciu ich foriem, v akých sa nachádzajú v matriciach vstupujúcich do organizmu človeka. Špcciácia štiepnych produktov (cézia, stroncia, európia) v mlieku a štúdium viazania iónov na polyuronidy sa sledovala vo vodnej dvojfázovej sústave mlieko-pektín. Táto sústava predstavuje vhodné riešenie ako v surovom mlieku, ktoré sa charakterizuje vysokým stupňom mikrobiologickej i chemickej nestability a zároveň prírodné vysokej variantnosti, získať údaje o špeciácii rádionuklidov a toxických iónov. Analýza prebieha za prirodzených, nedenaturujúcich podmienok bez významnejšieho narušenia fyzikálno-chemickej štruktúry mlieka a s minimálnymi zásahmi do prírodného stavu rádionuklidov v sledovanej sústave. Pripravená dvojfázová sústava sa môže stať základom pre ďalšie modifikovania vodných dvojfázových sústav bielkovín. V práci sa navrhol pre stanovenie špeciácie pridaných štiepnych produktov (^Sr, "Tc, l?7 Cs a Eu) v surovom mlieku postup pomocou vysokoúčinnej gélovej chromatografie v kombinácii s prietokovým rádiodetektorom a za použitia mobilnej fázy, ktorá simuluje mliečne sérum a umožňuje tak Štúdium interakcii kov-mlieko za natívnych podmienok. Vplyv mobilnej fázy, ph, iónovej sily mobilnej fázy a koncentrácie humínov na správanie humínových kyselín v gélovej chromatografii sa sledoval vysokoúčinnou gélovou chromatografiou. Pomocou vysokoúčinnej gélovej rádiochromatografie sa študovali interakcie medzi pridanými rádionuklidmi (" 0 Sr a l37 Cs) s jednotlivými frakciami humínových kyselín. Použitá mobilná fáza napriek jej nedeštruktívnemu pôsobeniu na humínové kyseliny, minimalizuje sprievodnú sorbciu rádionuklidov na tuhom scintilátore radiometrického detektora. 12

14 6. Zoznam prác, vzťahujúcich sa ku skúmanej problematike 1. MacáŠek. F.. Gerhart, P., Distribution and speciation of cesium, strontium and europium in the aqueous two-phase system milk-pectin. in: J. Radioanal. Nucl. Chem., Letters 186, 9-21 (1994). 2. MacáŠek, F., Gerhart, P., Malovíková, A., Mcmbranelcss dialysis of strontium in aqueous liquid-liquid milk-pectin system, in: J. Radioanal. Nucl. Chem., Letters 186, 99-/7/(1994). 3. Macášek, F., Gerhart, P., Navrátil, J.D.. Aqueous biphasic extraction of radionuclides from milk, in: Proc. Symposium of Aqueous Biphasic Separation, Acs., Meeting, San Diego, USA, 10 ('l 994). 4. Gerhart, P., MacáŠek, F., Speciation of added radionuclides in raw milk, in: Proc. 6th int. conference separation of ionic solutes, S1S % 95, Piešťany Spa, Slovakia, 181 (1995). 5. Gerhart, P., MacáŠek, F., Celková, A., Špeciácia pridaných rádionuklidov v surovom mlieku, 49. zjazd chem. spol., Bratislava, Zborník príspevkov, Vol.: 2, (1995). 6. Macášek, F., Gerhart, P., Malovíková, A., Celková, A., Speciation of native cations and added radionuclides in raw bovine milk. I. Membranelcss dialysis in aqueous biphasic systems, in: J. Radioanal. Nucl. Chem., Articles 208, (1996). 7. Bartoš, P.. Macášek, F., Gerhart, P., Partition of lead in milk-pectin aqueous biphasic system with complexation agents, in: Proc. 7th int. conference separation of ionic solutes, SIS'97, Piešťany Spa, Slovakia, 52-53(1991). 8. Macášek, F., Bartoš, P.. Gerhart. P., Partition of lead in a milk-pectin aqueous biphasic system with complexing agents, in: J. Radioanal. Nucl. Chem., Articles 229, (1998). 9. Gerhart, P., Rajec, P., Macášek, F., Speciation of fission products in raw cow milk by high-performance size exclusion radiochromatography, in: Proc. 7lh int. conference separation of ionic solutes, SIS'97, Piešťany Spa, Slovakia, 1OS>-110 ()997). 10. Gerhart, P.. Rajec. P., Macášek, F.. Spccialion of Fission products in raw cow milk by high-performance size exclusion radiochromatography, in: J. Radioanal. Nucl. Chem.. Articles (1998). 11. Gerhart. P., Rajec. P., Shaban. I., Bartoš, P.. Speciation of 137-Cs in the humic acids by HP-SEC combined with radiodetector. in: Proc. 7th int. conference separation of ionic solutes. SIS'97. Piešťany Spa, Slovakia, / //-/12 (1997). 12. Rajec, P.. Gerhart. P., Macášek. F.. Shaban. 1., Bartoš, P.. Size exclusion (radio)chromatography of aqueous humic acid solutions with cesium and strontium, in: J. Radioanal. Nucl. Chem.. Articles in press. 13

15 7. Summary Milk and other milk products are possible sources of radionuclide intake into the human body. This was the main reason for the study of the radionuclide speciation in raw bovine milk. The object of our research was to follow the chemical speciation of added radionuclides K 'Sr or ""Sr. g> Tc, 137 Cs. l52 Eu. and native cations in cow milk, as well as 212 Pb as a radioactive indicator oľ lead, which are important contaminants. The possibility of decontamination of milk from the contaminants was investigated. Speciation of ^'Sr and L< Cs in the humic acids, as the products of biological matrix degradation was studied as well. To achieve the given target, the selected separation techniques (without destroying the system under investigation while maintaining the native state of the radionuclides in the milk or solutions of humic acids) were membranelcss dialysis and size exclusion chromatography. The main objectives of this research were: 1. (a) To prepare an aqueous biphasic system: skimmed milk-polysaccharide pectin, and the use of membraneless osmosis for speciation of added radionuclides and native cations in the milk, (b) To evaluate kinetics of chemical exchange in the systems. 2. (a) To determine the distribution ratio dependence on the degree of pectin csthcrification. (b) To estimate complexity of used nuclidcs in the artificial milk serum, skimmed milk and pectin as well as the determination of ratio binding radionuclides on the low-molecular-wcight proteins by extraction using Aerosol OT. 3. To determine the speciation of fission products ^Sr, w Tc, l37 Cs and l52 Eu in fresh skimmed milk by size exclusion chromatography. 4. (a) To study the distribution of radionuclides ^Srand U7 Cs in humic acids by HP- SBC, (b) To attempt the determination of molecular weight of certain humic acids fractions, and to select suitable conditions for chromatographic analysis, especially the ionic strength of the mobile phase and pfi of system. The principal conclusions of our work are as following: 1. Skimmed milk-pectin was prepared, which was used to follow the speciation of added radionuclides in the milk. The process of membraneless dialysis from milk to the pectin phase was rapid and associated with the 3.5 to 4.7 times prcconcentration of the nondiffusible components in the milk phase in 15 minutes. From the fresh skim bovine milk spiked with respective radionuclides dissolved in the Jenness-Koops buffer (simulating milk scrum) and agitated with 4% w/w water solution of apple pectin, about 80% of cesium, 22% of strontium and less than 1.5% of europium was recovered with the pectin. 2. Preconcentration of radionuclides in the milk phase is possible if their distribution ratio remains sufficiently high. Therefore, decontamination of milk by a pectin solution without a dictating agent would be efficient only for cesium. 3. The partition of the ions in membraneless dialysis was described by means of the Donnan equilibrium. The results indicated that pectin and milk behave according polvelectrolytes. Thus, distribution does not depend on the degree of esterification pectin within the uncertainty of the results. 4. The kinetics oi' radionuclide distribution was sufficiently rapid even though the viscosity of milk phase strongly increased during the contact. 5. The recovery of radionuclides into the pectin phase using the milk-pectin membraneless dialysis system allowed the determination of the fractions of diffusible speciess of radionuclides. depending upon the model of evaluation employed: 14

16 Model A. This model considers the ratio of transfer of diffusible species from milk to pectin phase disregarding the volumes of exchanged species in the studied systems. Diffusible speciess are: 99% for cesium, 43% for strontium a 3.2% for europium. Model B. Dynamic equilibrium between individual species exists (especially if the time of separation exceeds the relaxation time between these two species, the colloidal and ionic one). Diffusible species arc: 96% for cesium, 13% for strontium a 0.75% for europium. 6. The study of binding of radionuclides with milk proteins of low-molecular weight (below ) by solvent extraction with the anionic biological detergent Aerosol OT did not yield any explicit results. The low-molecular fraction of added strontium in milk was assessed from sorplion on the Dowex 50x8 presaturated with the simulated milk serum components. The sorplion of strontium was 31% and that of cesium and europium 58% and 40% respectively. 7. Difference of the lead distribution between raw and pasteurized milk exists presumably due to particularly denaturation of proteins in milk serum of pasteurized milk. The behaviour of 2l2 Pb recalls that of trivalent elements. 8. Speciation of fission products 90 Sr, 99 Tc. l37 Cs and l52 Eu in raw cow milk was studied using the high-performance size exclusion radiochromatography by Biosep-SEC-S column. Six fractions were identified by mobile phase consisted of the Jenness-Koops buffer that simulated milk serum. Radiocesium was present only in a non-protein fractions, which complexed also 17% of technetium and 57% of strontium. About 32% of strontium and 24% of europium were bound by the high-molecular-weight proteins (micellar casein), LOWmolecular-weight proteins bounded about 11% of strontium and 76% of europium. Non-size effects play a dominant role at HP-SERC speciation of techneiium, 83% of which follow the lightest fractions of milk. 9. The technique of HP-SEC and HP-RSEC by Micro-aquagcl column was used for identification of radiocesium and radiostrontium interaction with humic acid. The behaviour of humic acid on size-exclusion chromatography is sensitive to the salt concentration and ph of the mobile phase. At a lower ionic strength and in acidic region of pi I, the Aldrich humic acid exhibited three main fraction within the ranges >760 kda kda and <5 kda. Radiocesium was found in the low-molecular fractions (<1 kda) of humic acids but radiostronlium interacted preferably with the fractions of humic acid of molecular weight within the range 2-5 kda. 15