Microsoft Word - Praca č. 4.docx

Prepis

1 plyv inhibíie na priebeh reakie vo vádzkovo reaktore TEORETICÝ ÚOD Enzýové inhibítory ú látky, ktoré poaľujú alebo pôobujú zatavenie heikýh reakií. Enzýy katalyzujú praktiky všetky bunkové proey, preto nie je prekvapujúe, že enzýové inhibítory patria k najdôležitejší látka pri výkue, vo výrobe aj aplikáii. Z hľadika ehanizu pôobenia rozoznávae štyri typy inhibíie. Pri kopetitívnej inhibíii inhibítor úťaží o ubtráto o aktívne ieto enzýu. Ak inhibítor obadí aktívne ieto, zabraňuje tak väzbe ubtrátu do enzýu. opetitívne inhibítory ú štruktúrne čato veľi podobné ubtrátu a interagujú enzýo za vzniku koplexu EI, avšak bez naledujúej katalytikej reakie. opetetívnyi inhibítori bývajú čato i produkty enzýovej reakie. opetitívna inhibíia ôže byť analyzovaná kvantitatívne rovnovážnou kinetikou. prítonoti kopetetívneho inhibítora, vyzerá ihaeli-entenovej rovnia naledovne: r p (1) + kde r P rýhloť vzniku produktu, je axiálna rýhloť neinhibovanej reakie a je zdanlivá ihaeliova konštanta pre kopetetívnu inhibíiu pre ktorú platí: (1 ) (2) + I 1 kde je ihaeliova konštanta neinhibovanej reakie, je konentráia ubtrátu a I 1 je ihibičná konštanta.. Pretože a inhibítor viaže reverzibilne do enzýu, ôže byť kopetitívne vytlačený ubtráto zvýšení konentráie ubtrátu. eď [S] >> [I], pravdepodobnoť, že olekula inhibítora bude viazaná do enzýu je inializovaná a reakia vykazuje norálnu hodnotu. Jednoduhý príklado kopetetívnej inhibíie je otrava etanolo. ax Alkoholdehydrogenáza ení etanol na foraldehyd, ktorý je škodlivý pre nohé tkanivá Etanol ako alternatívny ubtrát je účinný v kopetíii o aktívne ieto na alkoholdehydrogenáze a terapia počíva v intravenóznej infúzii etanolu, ktorý poalí tvorbu

2 foraldehydu a zníži tak riziko vážneho poškodenia itýh tkanív, zatiaľ čo obličky odfiltrujú etanol do oču. Pri nekopetetívnej inhibíii a inhibítor viaže io aktívneho ieta a neovplyvní afinitu ubtrátu k enzýu. Inhibítor a viaže na koplex ES a ovlyvňuje teda jeho konentráiu čo a prejaví na znížení. Pri toto type inhibíie a teda ení a hodnota a neení... Pre čito nekopetetívneho inhibíiu, vyzerá ihaeli-entenovej rovnia naledovne: r p + a zdanlivá axiálna rýhloť inhibovanej reakie je vyjadrená: 1 1+ I I2 (3) (4) kde je zdanlivá axiálna rýhloť inhibovanej reakie, I2 je inhibičná konštanta. Avšak takýto typ čitej nekopetetívnej inhibíie je veľi zriedkavý a zväčša väzba inhibítora ovplyvňuje aj štruktúru aktívneho ieta a teda aj afinitu ubtrátu k enzýu a teda aj hodnotu. Pre takúto ziešanú inhibíiu vyzerá ihaeli-entenovej rovnia naledovne: rp + a I (1+ I2 ) I (1+ ) I1 I (1+ ) I2 (5) Pri akopetetívnej inhibíii a inhibítory viažu až na koplex enzý-ubtrát a tý zabraňujú rozpadu na produkt. Paraetre a a znižujú rovnakou ierou, takže ih poer je rovnaký ako v prípade neinhibovanej reakie a je ju ožné ľahko odhaliť pretože platí: (6) Hodnoty kinetikýh paraetrov a z experientálnyh údajov (difereniálnyh alebo integrálnyh) ôžu zitiť buď grafiky alebo lineárnou rep. nelineárnou regreiou.

3 Cieľo tejto laboratórnej práe je navrhnúť vhodný ateatiký odel opiujúi inhibíiu invertázy CuSO 4 a zitiť jeho kinetiké paraetre na základe naeranýh údajov, pričo rozhodujúi teto vhodnoti navrhovaného ateatikého odelu bude priliehavoť naeranýh (experient) a vypočítanýh údajov (ateatiký odel). Typiký experient na eranie enzýovej kinetiky ôže byť vykonaný naledujúi pôobo. čae nula a do zei vodného roztoku ubtrátu inhibítoro pridá enzý a vo vzorkáh odoberanýh v prenýh čaovýh intervaloh a zitia konentráie potrebovaného ubtrátu rep. produktu vhodnou analytikou etódou. Pri vyhodnoovaní kinetikýh paraetrov, a použijú len začiatočné údaje zeny konentráie od čau (rýhloť vzniku rep. zániku zložky difereniálne údaje) keď ú oni ešte tále lineárnou záviloťou. Z naeranýh údajov, konentráie ubtrátu/produktu ako funkia čau, a vypočíta ernia priakovej záviloti pre danú začiatočnú konentráiu ubtrátu: dp ds dt dt t 0 t 0 ( ri) t 0 a vyneie a grafiká záviloť rp f(). Avšak rovnia v toto tvare harakterizujúa yté inhibíiou ( rovnie 1,3,5 ) nie je veľi vhodná na zíkanie kinetikýh paraetrov, pretože funkia r P nezávií na paraetroh lineárne (je to nelineárna funkia). Preto je potrebné rovnie pre inhibíie upraviť (zlinearizovať) tak, aby nová závile preenná (y new y) záviela na novýh (odifikovanýh) paraetroh k 1, k 2 lineárne. Jednou z ožnýh úprav používanýh v enzýovej kinetike je Lineweaver-Burkova linearizáia, kde napríklad pre kopetetívnu inhibíiu je ihaeli-entenovej rovnia upravená do tvaru: 1 r p 1 + I I (8) (7) Hoi kinetiké paraetre zitené lineárnou regreiou ú neprené, v prípade inhibíie je ožné porovnaní linearizovanýh tvarov neinhibovanej a inhibovanej rovnie identifikovať typ inhibíie. Tento potup pokytne aj prvotný odhad paraetrov do nelineárnej regreie ktorá podobne ako v prípade neinhibovanej reakie je prenejšou etódou na vyhodnotenie paraetrov ateatikého odelu Zitenie paraetrov v ihaeli entenovej rovnii (ax, ) je dôležité z hľadika prevádzkovania reaktora Na základe zitenýh paraetrov je teda ožné vypočítať ča potrebný na doiahnutie predpíanej konverzie alebo opačne ak reaktor prevádzkuje

4 predpíaný ča až k akej konverzii a ôže dotať. prípade indentifikáie inhibíie je ožné navrhnuť aj tehnologiké opatrenia na zníženie účinku inhibíie. 2. CIEĽ PRÁCE 1. Ukutočniť erania rýhloti enzýovej reakie etódou začiatočnýh rýhlotí v ytée invertáza-aharóza inhibítoro. 2. Na základe porovnania experientálnyh závilotí r p f( 0 ) inhibíiou a bez (výledky z práe č.5) určiť o aký typ inhibíie ide ( graf 1) 3. etódou lineárnej regreie vypočítať približné hodnoty paraetrov,,i1, I 2 z experientálnyh údajov závilotí (graf 2) 4. Prenoť vypočítanýh paraetrov overiť ih výpočto etódou nelineárnej regreie (atlab, Exel). 5. Overiť platnoť identifikovaného inhibičného odelu grafiký porovnaní experientálnyh a vypočítanýh hodnôt závilotí r p f( 0 ) pričo rozhodujúi teto vhodnoti bude priliehavoť naeranýh a vypočítanýh rýhlotí reakie( graf 3) a ua štvorov odhýlok. 6. Ako by te potlačili účinok inhibíie vo vašo experientálno ytée. Uveďte príklad výpočtu. EXPERIENTÁLNA ČASŤ 3.1 ateriály Použitý enzý Ako experientálny yté používae enzý kvaničnú invertázu (E.C ) ktorá katalyzuje hydrolýzu aharózy za vzniku glukózy a fruktózy podľa naledujúej reakie:

5 C 12 Η 22 Ο 11 + Η 2 Ο C 6 Η 12 Ο 6 + C 6 Η 12 Ο 6 (21) Použité roztoky 1. aetátový pufor ph 4,8 konentráiou 0,1 ol/l 2. záobný roztok enzýu 4 g/l vo vode (kvaničná invertáza, Frakia, aktivita 44U/g, Siga) l záobný roztok aharózy konentráiou 0,2 ol/l v 0,1 ol/l aetátovo pufri ph 4, l z roztokov aharózy rôznou konentráiou (záobný roztok aharózy riediť veľi prene!!! aetátový pufro podľa rozpiu uvedeno v Tabuľke č.1) 2. inhibítor - roztok CuSO 4 konentráiou 0,16 ol/l (25 l) 3.2 Enzýová reakia 1. Enzýová reakia prebieha v uzavretýh 1,5 l Ependorfovýh kúavkáh. Do 740 µl aharózového roztoku rôznou konentráiou ( Tabuľka 2, vzorky č ) pridáe 10µl inhibítora, ependorfky uzavriee a v terotate teperuje 15 inút pri teplote ktorú zadá učiteľ. 2. Po vyteperovaní naštartujee enzýovú reakiu tak, že pridáe do každej vzorky po 50 µl záobného roztoku enzýu v čaovýh intervaloh uvedenýh v Tabuľke 3. Eppfendorovu kúavku tene uzavriee, ze ihneď preiešae na vortexe a vrátie do terotatu. Na topkáh ledujee ča reakie. 3. Po uplynutí čau reakie(zadá učiteľ) reakiu v Ependorfovýh kúavkáh zatavíe prídavko 200µl roztoku NaOH konentráiou 1 ol/l a ze zhoogenizujee na vortexe (čaový rozpi v Tabuľke č. 2). 4. nožtvo uvoľneného produktu enzýovej reakie (glukózy) tanovíe glukózový teto pektrofotoetriky. 3.3 Stanovenie glukózy glukózový teto

6 3.3.1 Priníp Na tanovenie produktu enzýovej reakie glukózy a používa glukózový tet GLU GOD 6 x250. Základo tanovenia glukózy je vytvorenie farebného koplexu ktorého aborbania a eria pektrofotoetriky. Tento koplex vzniká pri elektívnej oxidáii glukózy na peroxid vodíka a glukonát pooou glukózooxidázy. zniknutý peroxid vodíka a tanovuje oxidačnou reakiou o ubtituovaný fenolo a 4-ainoantipyríno katalyzovano peroxidázou, pričo vzniká červeno farbený produkt. Priníp tanovenia uvoľnenej glukózy: β D glukóza+ H (22) glukóza oxidáza 2O2 + O2 D glukonát+ H2O2 peroxidáza H 2 O2 + farbivoredukované farbivooxidáza + H 2O (23) Potup 1. Roztok glukózového tetu predhrejee na 30 C. Do ependorfiek pipetujee po 1 l tohto roztoku. Počet ependorfiek je rovný počtu štandardov glukózy + 3 x počet vzoriek. 2. Do glukózového tetu pridáe kvantitatívne po10 µl dobre zhoogenizovanýh vzoriek alebo štandardov glukózy. Ependofove kúavky tene uzavriee, ze dôkladne preiešae na vortexe. 3. Stojan ependorfkai odložíe na tavé ieto a neháe 30 in inkubovať. 4. Po ukončení inkubáie vzorky vyberiee, preiešae na vortexe a v každej zeriae aborbaniu pri aborpčno axie produktu tanovenia (500 n) oproti vode. zorka č.1 je lepý pokuo. 5. Na zotrojenie kalibračnej čiary použijee už vopred pripravené štandardné roztoky glukózy konentráiou: ol/l. 3. YHODNOTENIE NAERANÝCH ÚDAJO

7 1. Z eraní aborbanie štandardnýh roztokov glukózy zhotovíe kalibračnú záviloť, vypočítae paraetre kalibračnej rovnie a regrený koefiient. 2. ypočítae konentráiu uvoľnenej glukózy vo vzorkáh pooou kalibračnej čiary. 3. Rýhloť vzniku produktu pre jednotlivé začiatočné konentráie aharózy vypočítae podľa vzťahu: GL Celk r p (24) t RZ kde r p je rýhloť enzýovej reakie (rýhloť vzniku produktu), GL konentráia produktu - glukózy (ol/l), t reakčný ča, Celk je elkový obje po zatavení reakie, RZ je obje reakčnej zei (ah+enzýu). 4. Na základe porovnania experientálnyh závilotí r p f( S0 ) inhibíiou a bez (výledky z práe č.5) určíe o aký typ inhibíie ide. 5. Zo záviloti etódou lineárnej a nelineárnej regreie vypočítae zdanlivé paraetre,., I 6. Správnoť vypočítanýh paraetrov overíe grafiky porovnaní experientálnyh a vypočítanýh hodnôt závilotí. Ďalšie body úloh praujte podľa konkrétneho zadania.

8 5. ZOZNA POUŽITÝCH SYBOLO Sybol Ab GL 0 d dp D D 1 D 2 Názov veličiny aborbania pri 500 n konentráia produktu - glukózy začiatočná konentráia ubtrátu zena konentráie ubtrátu zena konentráie produktu deterinant ubdeterinant ubdeterinant k vektor paraetrov k 1, k 2 k 1 odifikovaný paraeter k 2 r p t Celk odifikovaný paraeter konštanta iheali-entenovej zdanlivá konštanta iheali-entenovej pre inhibovanú reakiu rýhloť enzýovej reakie reakčný ča elkový obje po zatavení reakie axiálna rýhloť enzýovej reakie zdanlivá axiálna rýhloť enzýovej reakie pre inhibovanú reakiu RZ I 1, I2 x obje reakčnej zei inhibičné konštanty vektor nezávile preennýh x odifikovaná nezávile preenná x 1/ 0 x i exp y y i al y i exp experientálne hodnoty nezávile preennej odifikovaná závile preenná y 1/r P vypočítané hodnoty závile preennej experientálne hodnoty závile preennej

9

10 6. PRÍLOHY TABUĽA 2 Príprava roztokov ubtrátu vzorka č záobný. roztok aharózy (l) pufor (l) výledná konentráia ubtrátu (ol/l) TABUĽA 3 Čaový rozpi erania priebehu enzýovej reakie vzorka č štart reakie ča/in top reakie ča/in 11