Význam imunohistochemickej detekcie LRP (lung resistance-related protein) v pľúcach pri otrave oxidom uhoľnatým 1 N. Bobrov, 2 S. Rybárová, 1 F. Longauer 1 Ústav súdneho lekárstva LF UPJŠ a FN L. Pasteura, Košice 2 Ústav anatómie LF UPJŠ, Košice Úvod Toxické pôsobenie oxidu uhoľnatého na živý organizmus spočíva predovšetkým v znížení celkovej kapacity kyslíka, blokovaní hemoglobínu, poškodení mechanizmu disociácie oxyhemoglobínu v krvi a odbúravania oxidu uhličitého. V takto poškodenom organizme pretrváva progredujúca hypoxia, často s fatálnym následkom. Oxid uhoľnatý produkuje aj priamy cytotoxický efekt, pričom inaktivuje väčšinu intracelulárnych respiratórnych enzýmov. Existuje však skupina špecifických bielkovín, ktoré sa priamym pôsobením oxidu uhoľnatého výrazne aktivujú. Patrí sem osobitná rodina vault (klenbových) proteínov, z ktorých najvýznamnejším ľudským vault proteínom je LRP lung resistance-related protein. LRP reguluje nukleoplazmatický ako aj vezikulárny transport rôznych substrátov vrátane liekov, jedovatých látok a iných xenobiotík. Najvyššie koncentrácie LRP boli zistené v epiteliálnych bunkách so sekrečnými funkciami, ako aj v bunkách chronicky vystavených pôsobeniu xenobiotík. V literatúre je popísaná významná úloha LRP ako faktora rezistencie voči chemoterapeutickej liečbe nádorových ochorení (A. List a spol., 1993; M. Izquierdo a spol., 1995). Možnosť imunohistochemickej detekcie expresie LRP v pľúcnom tkanive človeka, konkrétne pri niektorých inhalačných otravách je významným prínosom v súdnolekárskej praxi. Ciele Cieľom práce bolo vyhodnotenie expresie LRP v pľúcnom tkanive človeka pri akútnej fatálnej otrave oxidom uhoľnatým. Túto skupinu sme porovnali s kontrolnou (skupina zomrelých následkom mechanického násilia), a to metódou imunohistochemickej detekcie tohto proteínu. Týmto by sme dokázali možnosť používania imunohistochemických metód vyšetrenia v súdnom lekárstve pri posudzovaní pôsobenia nielen mechanického, ale aj chemického násilia na organizmus. Materiál a metódy Expresiu proteínu LRP sme hodnotili semikvantitatívnou metódou na parafínových rezoch pľúc 4 osôb zomrelých násilnou smrťou následkom dopravného úrazu, strelného poranenia a obesenia (skupina K kontrolná, tab. 1) a 4 osôb zomrelých následkom akútnej otravy oxidom uhoľnatým (skupina P - pokusná, tab. 2). Použili sme parafínové tkanivové rezy hrúbky 4 µm, ktoré sme odparafínovali a prepláchli premývacím roztokom (Phosphat Buffer Saline + Tween). Nasledovalo zablokovanie endogénnej peroxidázovej aktivity 0,3 % roztokom H 2 O 2 v metanole v priebehu 30 min. Rezy sme prepláchli citrátovým tlmivým roztokom a v tom istom tlmivom roztoku sme ich krátko zohriali v mikrovlnnej rúre (2 x 5 min). Po následnom opláchnutí v základnom premývacom roztoku sme blokovali nešpecifické farbenie konským blokačným sérom. Ako primárnu protilátku sme použili myšiu monoklonálnu protilátku anti-lrp (Transduction Laboratories, USA) v koncentrácii 5 µg/ml riediaceho roztoku a ponechali pôsobiť vo vlhkej komôrke cez noc pri 4 o C. Po zliatí primárnej protilátky sme rezy opláchli a navrstvili na ne biotinylovanú konskú sekundárnu protilátku (Vector Laboratories, USA). Nechali sme ju
pôsobiť tiež vo vlhkej komôrke 30 min. pri izbovej teplote. Po následnom opláchnutí v premývacom roztoku sme aplikovali roztok streptavidín-peroxidázy na dobu 30 min. Ďalej sme tieto rezy ponorili do roztoku diamínobenzidínu (DAB, Sigma, Germany), ktorý sme nechali pôsobiť cca 5 min. Rezy sme opäť premyli, opcionálne dofarbili hematoxylínom a zamontovali do montážneho média. Zhotovené preparáty sme prehliadali vo svetelnom mikroskope a vyhodnocovali. Kontrolu imunohistochemickej metódy sme vykonali tak, že na každom sledovanom sklíčku (skupiny P aj K) sme ofarbovali dva rezy súčasne. U jedného z týchto rezov sme vynechali aplikáciu primárnej protilátky a nahradili sme ju základným premývacím tlmivým roztokom. Koncentrácie karboxyhemoglobínu v krvi zomrelých na akútnu otravu oxidom uhoľnatým odobratej počas pitvy z ľavej komory srdca a zo stehnovej žily sa zisťovali Wolffovou metódou (S. Škramovský, J. Srbová, 1945) v modifikácii V. Porubského (1972). Spomedzi štatistických metód vyhodnotenia sme použili histocytometrickú metódu podľa G. Avtandilova (1990) a metódu relatívnej hustoty buniek podľa E. Underwood (1970), s použitím mikrofotografického zariadenia a softvérového programu Olympus DPSoft 2 (licencia Ústavu histológie LF UPJŠ Košice). Por. č. Prípad Pohlavie Vek Prežívanie, hod Počet vyšetrených preparátov pľúc K1 1. Strelné poranenie samovražda M 42 0 3 K2 2. Strelné poranenie samovražda M 38 0 3 K3 3. Kraniocerebrálne poranenie dopravný úraz M 57 0 3 K4 4. Obesenie samovražda M 44 0 3 Tab. 1. Kontrolná skupina zomrelých násilnou smrťou (mechanické násilie) Por. č. Prípad Pohlavie Vek Koncentrácia karboxyhemoglobínu v krvi Stehnová Srdce žila Počet vyšetrených preparátov pľúc P1 1. Akútna otrava CO M 48 50 52 3 P2 2. Akútna otrava CO M 34 45 48 3 P3 3. Akútna otrava CO M 34 50 51 3 P4 4. Akútna otrava CO M 53 50 53 3 Tab. 2. Vyšetrená skupina zomrelých na akútnu otravu oxidom uhoľnatým Výsledky Kontrolná skupina (K1 K4) Prítomnosť LRP sa nám javila vo forme hnedého až tmavohnedého sfarbenia lokalít, ktoré obsahovali sledovaný proteín. V kontrolných, hematoxylínom nedofarbených rezoch sme 2
zistili výraznejšiu pozitivitu LRP v epiteli bronchov (obr. 1), miernu pozitivitu v pneumocytoch 2. radu ako aj v alveolárnych makrofágoch (obr. 2, 3). Pozitivita LRP v epiteli bronchov sa opticky výraznejšie javila najmä v hematoxylínom dofarbených rezoch v porovnaní s kontrolou metódy (obr 4a, 4b). Vo všetkých prípadoch sa vypočítalo množstvo alveolárnych makrofágov, vrátane antrakofágov, v acinoch pľúc, ako aj index relatívnej hustoty makrofágov v acinoch. Vypočítané hodnoty sú uvedené v nasledujúcej tabuľke: Prípad č. Počet vyšetrených acinárnych štruktúr alveolárnych makrofágov v acine alveolárnych antrakofágov v acine Index relatívnej hustoty makrofágov v acinoch (MF/ACIN) K1 6 106 ± 6 86 ± 5 0,012 K2 6 98 ± 6 76 ± 4 0,010 K3 6 103 ± 6 86 ± 4 0,008 K4 6 75 ± 5 34 ± 2 0,005 Tab 3. Množstvo a hustota alveolárnych makrofágov v acinoch pľúc kontrolnej skupiny Pokusná skupina (P1 P4) Naše očakávania týkajúce sa hodnoverného zvýšenia expresie LRP v cytoplazme alveolárnych makrofágov, ako aj celkové zvýšenie počtu alveolárnych makrofágov v pľúcnom tkanive pri akútnej otrave oxidom uhoľnatým sa potvrdili. Relatívne množstvo makrofágov vykazujúcich vysokú až strednú pozitivitu LRP v prípadoch P1 - P4 bolo 64-88%. Pri porovnaní s kontrolnou skupinou K1 K4 bola táto hodnota podstatne nižšia, len 32-50 %. V pokusnej skupine sme ďalej zistili relatívne nízku expresiu LRP v bronchiálnom epiteli (obr. 5a, 5b) a zároveň jeho vysokú pozitivitu v makrofágoch pľúc (obr. 6a, 6b). Aj v kontrolnej skupine sa vypočítalo množstvo alveolárnych makrofágov, vrátane antrakofágov, v acinoch pľúc a index relatívnej hustoty makrofágov v acinoch. Vypočitané hodnoty sú uvedené nižšie: Prípad č. Počet vyšetrených acinárnych štruktúr alveolárnych makrofágov v acine alveolárnych antrakofágov v acine Index relatívnej hustoty makrofágov v acinoch (MF/ACIN) P1 6 256 ± 12 106 ± 6 0,054 P2 6 150 ± 6 87± 4 0,028 P3 6 305 ± 12 218 ± 7 0,131 P4 6 308 ± 12 178 ± 10 0,101 Tab. 4. Množstvo a hustota alveolárnych makrofágov v acinoch pľúc pri akútnej otrave oxidom uhoľnatým 3
Diskusia Pred niekoľkými rokmi sa v literárnych zdrojoch (D. Mathieu a spol., 1996; P. Vazquez a spol., 1997) začala diskusia o mechanizmoch otravou podmieneného respiračného vyčerpania (poison-dependent respiratory distress PDRD). Význam imunohistochemickej detekcie LRP v pľúcnom tkanive pri otrave oxidom uhoľnatým spočíva z nášho hľadiska v tom, že úroveň expresie LRP je ovplyvnená koncentráciou toxickej látky pôsobiacej na pľúcne tkanivo pri rozvoji PDRD. Závisí to od sekrečnej funkcie bronchiálneho epitelu a obranných schopnosti systému makrofágov. Podobným spôsobom reagujú na prítomnosť noxy aj proteínové systémy surfaktantu pľúc (Bao-Li Zhu a spol., 2001). Expresia LRP v epiteli bronchov a v pľúcnych makrofágoch je pritom dosť spoľahlivým indikátorom nielen skutočnosti, že došlo k inhalačnej otrave oxidom uhoľnatým, ale aj ustálenia štádia rozvoja PDRD, pri ktorom došlo k smrti. Literatúra 1. Avtandilov G.: Medicinskaja morfometria. Moskva, Medicina 1990, 384 s. (v ruskom jazyku). 2. Bao-Li Zhu, Ishida K., Oritani S., Li Quan, Fujita M.Q. et al.: Immunohistochemical investigation of pulmonary surfactant-associated protein A in fatal poisoning. For Sci Int 2001, 117, p. 205-212 3. Izquierdo M.A., Vanderzee A.G.J., Vermorken J.B.: Drug resistance-associated marker LRP for prediction of response to chemotherapy and prognosis in advanced ovarian carcinoma. J Natl Cancer Inst 1995, 87, p. 1230-1237 4. List A. et al.: Non P-glycoprotein (Pgp) mediated multidrug resistance (MDR): Identification of a novel drug resistance phenotype with prognostic relevance in acute myeloid leukemia (AML). Blood 1993, 82, Suppl. 1, p. 443a. 5. Mathieu D., Mathieu N.M., Wattel F.: Intoxication par le monoxyde de carbone: aspects actuels. Bull Acad National Med 1996, 180 (5), p. 965-971 6. Porubsky V.: Citované v Kokavec M., Porubský V., Mego M., Korman V., Bauer M. Príručka súdneho lekárstva. Martin, Osveta, 1972, 440 s. 7. Škramovský S., Srbová J.: O stanovení karboxyhemoglobinu metodou Wolffovou. Čas Lék čes 1945, 84, s. 534. 8. Vazquez P., Lopez-Herce J., Galaron P., Merello-Godino C.: Concentraciones de carboxihemoglobina y factores de riesgo de intoxicacion por monoxido de carbono en ninos. Med Clin Barc 1997, 108 (1), p.16-18. 9. Underwood E.: Quantitative stereology. London, Wesley Publ. Comp. 1970, 274 p. 4
Ilustrácie 5
6