Slide 1

Prepis

1 Úloha apolipoproteínov (apoe, apob-100) v metabolizme lipoproteínov a možnosti diagnostiky s nimi súvisiacich porúch Jana Lisyová, Ján Chandoga, Daniel Böhmer Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a UNB, Oddelenie molekulovej a biochemickej genetiky, Mickiewiczova 13, Bratislava clgfn@post.sk Úvod: Hlavnou úlohou lipoproteínov je transport lipidov medzi orgánmi a tkanivami, pričom súčasne sprostredkujú väzbu na špecifické receptory. Koncentrácia jednotlivých tried lipoproteínov závisí od dvoch procesov- od rýchlosti ich vstupu do plazmy (vstrebávanie, syntéza) a od rýchlosti ich odstraňovania z plazmy (katabolizmus, klírens). Pri konštantných koncentráciách lipoproteínov sú tieto procesy vyrovnané. Dyslipoproteinémie sú spôsobené kvalitatívnymi a kvantitatívnymi zmenami v zastúpení lipoproteínov. Poruchy metabolizmu lipoproteínov, ktoré vedú k zvýšeným hladinám lipidov a lipoproteínov v plazme hyperlipoproteinémie (HLP), sú dôsledkom zvýšenej syntézy alebo zníženého katabolizmu lipoproteínových častíc. HLP sú rizikovým faktorom predčasnej aterosklerózy a zohrávajú dôležitú úlohu v rozvoji arteriálnej hypertenzie. Lipoproteínový metabolizmus je závislý od prítomnosti apolipoproteínov (špecifických glykoproteínov), ktoré sú zodpovedné za väzbu a následnú internalizáciu lipoproteínových častíc do bunky a od aktivít enzýmov.

2 Apolipoproteín E Maturovaný apolipoproteín E (apoe) je 34 kda plazmatický glykoproteín zložený z 299 aminokyselín [8], ktorý je zodpovedný za receptormi-sprostredkovaný klírens lipoproteínov bohatých na triacylglyceroly (chylomikrónové a VLDL remnanty) z plazmy [4]. Umožňuje väzbu na LDL receptor (LDLR), ako aj na receptory špecifické pre chylomikrónové remnanty. Zmeny v štruktúre apoe proteínu môžu spôsobiť hyperlipidémiu (hyperlipoproteinémiu typu III), predčasný aterosklerotický proces a Alzheimerovu chorobu. Tri najfrekventovanejšie apoe izoformy (E2, E3, E4) sú definované prítomnosťou dvoch polymorfných lokusov v kodóne 112 a 158 APOE génu (Tab.1) a následne rôznou väzbovou afinitou k LDL receptoru. Frekvencia a výskyt jednotlivých izoforiem a genotypov sa líši medzi jednotlivými populáciami a celosvetovo bolo popísaných viac ako 30 vzácnych variánt [2]. V kaukazskej populácii je najfrekventovanejšia apoε3 alela (75%). Gén pre apoe (obr.1) je lokalizovaný na dlhom ramienku 19. chromozómu (19q13.2) a obsahuje štyri exóny [1]. ApoE4 izoforma predstavuje hlavný genetický rizikový faktor pre rozvoj predčasnej aterosklerózy, ako aj pre nástup familiárnej alebo sporadickej Alzheimerovej choroby. Vo všeobecnosti, nositelia apoε4 alely majú vyššiu hladinu celkového cholesterolu, zatiaľ čo nositelia apoε2 alely majú nižšiu hladinu cholesterolu v porovnaní s najfrekventovanejším E3/E3 genotypom [5]. Polymorfizmy v géne pre apolipoproteín E spôsobujú vznik familiárnej dysbetalipoproteinémie (hyperlipoproteinémia typu III). Ide o poruchu metabolizmu chylomikrónových remnantov a VLDL častíc, charakteristickú vysokou plazmovou hladinou cholesterolu (7,0-12,0 mmol/l) a triacylglycerolov (5,0-20,0 mmol/l), ako aj prítomnosťou patologickej lipoproteínovej frakcie (β-vldl). Najzávažnejším klinickým prejavom HLP typu III je predčasná ateroskleróza, ktorá postihuje najmä periférne cievy a myokard. U postihnutých sa vyskytujú všetky typy xantomatózy, ale najmä palmárne xantómy (žlté sfarbenie dlaňových a medziprstových rýh). Ochorenie môže byť prenášané dominantne aj recesívne. Hyperlipoproteinémia typu III je väčšinou (>90%) asociovaná s prítomnosťou apoe2 izoformy v homozygotnom stave, ktorá spôsobuje defekt vo väzbe lipoproteínu na LDL receptor. K rozvinutiu hyperlipoproteinémie typu III popri genotype E2/E2 sú potrebné aj ďalšie kofaktory vzniku ochorenia (napr. obezita, hypotyreóza, diabetes mellitus, renálne poškodenie). Incidencia ochorenia je 1:5000, zatiaľ čo frekvencia E2/E2 genotypu v populácii je až 1:100. V terapii sa využívajú najmä diétne opatrenia (redukcia hmotnosti, zvýšenie pohybovej aktivity, obmedzenie alkoholu) a z liečiv fibráty, statíny a kyselina nikotínová. Obr.1: Lokalizácia APOE lokusu na 19. chromozóme Tab.1: Tri najfrekventovanejšie APOE alely a ich percentuálne zastúpenie v kaukazskej populácii

3 Apolipoproteín B-100 Apolipoproteín B-100 (apob-100) je dôležitým proteínovým komponentom VLDL, IDL a LDL častíc. Keďže slúži ako ligand pre väzbu na VLDL a LDL receptor, zohráva kľúčovú úlohu v odbúravaní LDL cholesterolu z plazmy. Missense mutácia R3500Q v APOB géne spôsobuje tzv. familiárny defekt apolipoproteínu B-100 (FDB). Ide o autozomálne dominantné ochorenie s incidenciou 1:500. Vzhľadom na dominantný typ dedičnosti, už u prenášačov dochádza k biochemickej manifestácii poruchy familiárnej hypercholesterolémii charakteristickej zmenami v zastúpení frakcií LDL cholesterolu v plazme. Dochádza k zvýšeniu hladiny celkového, ale najmä LDL cholesterolu (7,0-10,0 mmol/l). Heterozygoti nesú dve subpopulácie LDL častíc v plazme- LDL častice s normálnou väzbou na LDL receptor a LDL častice s defektnou väzbou na LDL receptor [7]. R3500Q je najčastejšou a najlepšie preštudovanou mutáciou v géne APOB u kaukazskej populácie. Spôsobuje zámenu aminokyseliny arginínu za glutamín v polohe 3500 apolipoproteínu B-100 [10], ktorá obsahuje väzbovú oblasť pre LDLR a znižuje afinitu LDL častice k LDL receptoru. V porovnaní s väzbovou schopnosťou apob-100 u zdravých osôb je väzbová afinita R3500Q len 3 5 % u homozygotov a asi 32 % u heterozygotov FDB. Výsledkom je zníženie klírensu LDL častíc z plazmy a hypercholesterolémia. Riziko spočíva najmä v predčasných aterosklerotických zmenách a ischemickej chorobe srdca (ICHS). Vyskytujú sa šľachové xantómy, arcus corneae, xantelazmy (obr.2) [9]. V terapii sa využíva celoživotná medikamentózna liečba statínmi. U heterozygotných pacientov, ktorí nereagujú na liečbu alebo u pacientov s prítomnou mutáciou v homozygotnom stave sa pristupuje aj k extrakorporálnej aferéze LDL, plazmaferéze, HELP systému, distálnemu ileálnemu bypassu a portokaválnej spojke. Gén pre apob-100 sa nachádza na krátkom ramienku chromozómu 2 (2p24-p23) (obr.3) a má 29 exónov [6]. Maturovaný apob-100 proteín obsahuje 4536 aminokyselín (~550 kda). Obr.2: Xantelazma Obr.3: Lokalizácia APOB lokusu na 2. chromozóme

4 MATERIÁL A METÓDY 1. PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Molekulárno-genetická analýza APOE a APOB-100 kódujúcej sekvencie je založená na metóde PCR-RFLP. Úseky genómovej DNA izolovanej z leukocytov periférnej krvi sú po amplifikácii štiepené pomocou restrikčných endonukleáz Hha1 a Sca1, ktoré dávajú vznik charakteristickým fragmentom. Genotypizácia APOE je založená na metóde PCR, pri ktorej sa amplifikuje fragment s dĺžkou 227 bp, ktorý sa po následnej RFLP analýze štiepi pomocou Hha I na špecifické fragmenty. Restrikčná endonukleáza HhaI rozpoznáva a štiepi dsdna v GCGC palindrómovej sekvencii. Kodóny v pozícii 112 a 158 APOE génu (TGC/CGC) dávajú vznik rôzne dlhým štiepnym produktom (obr.4,obr.5). Obr.4: APOE štiepne fragmenty charakteristické pre najčastejšie genotypy Obr.5: Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov APOE génu (dráha 1-E4/E2, dráha 2, 5, 8-E3/E3, dráha 3- E4/E4, dráha 4, 6- E4/E3, dráha 7- E2/E2, dráha 9- neštiepený PCR amplifikát, dráha 10- negatívna kontrola, dráha 11- molekulová štandarda) Molekulárno-genetickou analýzou APOB génu sa amplifikuje fragment s dĺžkou 143 bp, ktorý sa následne štiepi restrikčnou endonukleázou ScaI rozpoznávajúcou v dsdna palindrómovú sekvenciu AGTACT. Pri štiepení so ScaI sa odštiepi 18 bp kontrolný fragment, čím vznikne 125 bp fragment. Pri mutácii vznikne ďalšie restrikčné miesto, čím sa odštiepi 23 bp fragment a zostane 102 bp (obr.6). Obr.6: PCR-RFLP analýza APOB génu (dráha 1- heterozygot pre mutáciu R3500Q, dráha 2-8- homozygot pre wild-type alelu, dráha 9- neštiepený PCR amplifikát, dráha 10- negatívna kontrola, dráha 11- molekulová štandarda

5 2. Lipoprint Systém (Quantimetrix Corporation) U pacientov s významnými zmenami v lipidových parametroch a s predčasne rozvinutou aterosklerózou je v diagnostike vhodné určenie aterogénnych a neaterogénnych lipoproteínových frakcií a stanovenie lipoproteínového profilu (neaterogénny fenotyp A vs. aterogénny fenotyp B). Zhoršený metabolizmus lipoproteínov má za následok nadprodukciu častíc bohatých na triacylglyceroly a malých denzných LDL častíc, ktoré sú silne aterogénne (subfrakcie LDL 3-7). Na stanovenie lipoproteínového profilu sa v súčasnosti používa nová laboratórna diagnostická metóda založená na elektroforetickej separácii v polyakrylamidovom géli (Lipoprint Systém) a je porovnateľná s kontinuálnou gradientovou ultracentrifugáciou ako referenčnou metódou na separáciu lipoproteínov [3] (obr.8). Tento test poskytuje údaje zahŕňajúce lipoproteínové triedy a ich podtriedy: VLDL, tri podtriedy IDL, sedem podtried LDL a frakciu HDL (Obr.7), ako aj kvantifikáciu aterogénnych (VLDL, IDL1-2, LDL3-7) a neaterogénnych (IDL3, LDL1-2, HDL) lipoproteínov. A B Obr. 7: Neaterogénny lipoproteínový profil typ A (A) vs. aterogénny lipoproteínový profil typ B (B) Obr.8: Porovnanie lipoproteínových frakcií získaných kontinuálnou gradientovou ultracentrifugáciou a Lipoprint Systémom

6 3. Sekvenčná analýza cieľových génov Sekvenčná analýza APOE, APOB, prípadne iných kauzálnych génov (napr. LDLR) je finančne náročnejšia alternatíva detekcie mutácií a polymorfizmov, na druhej strane stanoví presnú sekvenciu kódujúcej sekvencie, čo je nevyhnutné najmä v prípade vzácnejších sekvenčných zámien (obr.9). Obr.9: Sekvenčná analýza APOE génu (aminokyselinová pozícia 158 v heterozygotnom stave pre genotyp E4/E2) Záver: V diagnostike porúch metabolizmu lipoproteínov a s nimi súvisiacich ochorení (predčasná ateroskleróza, Alzheimerova choroba, ischemická choroba srdca, iné neurologické poruchy) je dôležité vykonanie kvantitatívno-kvalitatívneho vyšetrenia lipoproteínových frakcií (Lipoprint Systém) spolu s molekulárno-genetickou analýzou (genotypizácia APOE, mutácie APOB- 100, LDLR), ako aj poznanie rodinnej anamnézy a spôsobu života pacienta. Niektoré dyslipoproteinémie sú charakteristické polygénnou dedičnosťou a rôznou penetranciou genetickej poruchy. Na manifestácii mutácií sa významne podieľa aj vonkajšie prostredie. Moderná genetická klasifikácia je založená práve na identifikácii kauzálnych genetických defektov vyvolávajúcich dané ochorenie (na etiológii) a delí poruchy metabolizmu lipoproteínov na dve základné skupiny: primárne (geneticky podmienené) a sekundárne (ako sprievodný znak iného základného ochorenia alebo ako výsledok vplyvu iných vonkajších faktorov). Sekundárne hyperlipoproteinémie vznikajú dôsledkom iného základného ochorenia, ktoré narušuje metabolizmus lipidov a lipoproteínov. Spôsobujú zvýšenie hladiny cholesterolu, triacylglycerolov alebo oboch parametrov. Klinicky sa prejavujú akcelerovanou aterosklerózou, akútnou pankreatitídou a xantomatózami. Patrí sem hypotyreóza, nefrotický syndróm, chronická renálna insuficiencia, primárna biliárna cirhóza, diabetická dyslipoproteinémia a alkoholizmus. Sekundárna hyperlipoproteinémia sa zvyčajne normalizuje po vyliečení alebo kompenzácii základného ochorenia.

7 Použitá literatúra: [1] Das HK, McPherson J, Bruns GAP, Karathanasis SK, Breslow JL. Isolation, characterization, and mapping to chromosome 19 of the human apolipoprotein E gene. J. Biol. Chem. 1985; 260: [2] Drenos F, Kirkwood TBL. Selection on Alleles Affecting Human Longevity and Late-Life Disease: The Example of Apolipoprotein E. PLoS ONE 2010; 5(4): e10022 [3] Duncan D, Morais J, Muniz N, Neyer G. Lipoprotein Subfraction Testing with the Lipoprint System- easy, accurate and comprehensive. Presented at CLAS, Northbrook, IL (May 2004) [4] Elliott DA, Halliday GM, Garner B. Apolipoprotein-E forms dimers in human frontal cortex and hippocampus. BMC Neuroscience 2010; 11:23 [5] Hubacek JA, Peaseyd A, Pikhartd H, Staveka P, Kubinovae R, Marmotd M, Bobakd M. APOE polymorphism and its effect on plasma C-reactive protein levels in a large general population sample. Hum Immunol. 2010; 71(3): [6] Law SW, Lackner KJ, Hospattankar AV, Anchors JM, Sakaguchi AY, Naylor SL, Brewer HB Jr. Human apolipoprotein B-100: cloning, analysis of liver mrna, and assignment of the gene to chromosome 2. Proc. Nat. Acad. Sci. 1985; 82: [7] Ludwig EH, McCarthy BJ. Haplotype analysis of the human apolipoprotein B mutation associated with familial defective apolipoprotein B100. Am. J. Hum. Genet. 1990; 47: [8] Rall SC Jr., Weisgraber KH, Mahley RW. Human Apolipoprotein E: The Complete Amino Acid Sequence. The Journal of Biological Chemistry 1982; 257(8): [9] Rašlová K, Fábryová Ľ. Stanovisko k problematike familiárnych hyperlipoproteinémií a riziku kardiovaskulárnych ochorení v Slovenskej republike. Cardiol 2008;17(1):9 14 [10] Soria LF, Ludwig EH, Clarke HRG, Vega GL, Grundy SM, McCarthy BJ. Association between a specific apolipoprotein B mutation and familial defective apolipoprotein B-100. Proc. Nat. Acad. Sci. 1989; 86: