UNIVERZITA SV

Prepis

1 Nova Biotechnologica V-I (2005) 145 ETANOLOVÁ FERMENTÁCIA ENZÝMOVÝCH HYDROLYZÁTOV OBILNEJ MÚKY, ŠROTU A OTRÚB VIERA HORVÁTHOVÁ, KATARÍNA ĽACHKÁ, MARTINA ČIEFOVÁ Katedra biotechnológií, Fakulta prírodných vied Univerzity Sv. Cyrila a Metoda v Trnave, Nám. J. Herdu 2, Trnava Súhrn: V práci je opísaná etanolová fermentácia kvasinkami Sacchromyces cerevisiae. Substrátmi fermentácie boli dva druhy cereálii (pšenica Torysa a tritikale Radko), ktoré sa pred fermentáciou upravovali dvojstupňovou hydrolýzou komerčnými enzýmami (Termamyl SC a Dextrozyme E). Fermentáciou hydrolyzátov s východiskovou koncentráciou škrobu 1 % (w/v) sa priemerne získalo 0,52 % (v/v) etanolu. Kľúčové slová: pšenica, tritikale, enzýmová hydrolýza, etanolová fermentácia 1. Úvod Škrobové hydrolyzáty sú produktami hydrolýzy škrobu. Pri použití enzýmov vznikajú z východiskových škrobových substrátov dextríny a glukózové sirupy s rôznym obsahom mono- a disacharidov (SHI a kol., 2000). Glukózový sirup je definovaný ako čistá a koncentrovaná zmes sacharidov, ktorá sa získala hydrolýzou kukuričného škrobu. Komerčné glukózové sirupy majú sušinu najmenej 70 % a obsah redukujúcich sacharidov vyjadrených ako D-glukóza tvorí viac ako 20 % hmotnosti prepočítanej na sušinu (SANDERSON, 2003). Škrobové sirupy sa využívajú pri výrobe nápojov alebo môžu byť fermentované na etanol (ROY a GUPTA, 2004). Produkcia etanolu vo svete vzrastá aj vďaka jeho využitiu v dopravnom sektore pri náhrade fosílnych palív (PALMAROLA-ADRADOS a kol., 2005). Z tohto dôvodu sa hľadajú menej náročné a menej nákladné postupy jeho výroby resp. na jeho produkciu sa začínajú využívať nové netradičné suroviny. V súčasnosti sú vo svete najväčšie množstvá palivového etanolu (bioetanolu) produkované z cukrovej trstiny (Brazília), kukurice (USA), avšak je možné použiť aj z iné škrobnaté plodiny (jačmeň, ovos, ryža, pšenica, raž, zemiak, cirok) resp. lesné (piliny, drevo) a poľnohospodárske odpady (otruby a slama z pšenice, raže, ovsa, jačmeňa a ryže) (KIM a DALE, 2004). Tieto suroviny musia byť pred fermentáciou upravené. Úprava spočíva v ich enzýmovej hydrolýze. Pri nej sa (v závislosti od spracovávanej suroviny) používajú viaceré druhy enzýmov, väčšinou α-amylázy, glukoamylázy, pululanázy (VAN DER MAAREL a kol., 2002), pri spracovávaní surovín obsahujúcich β-glukany aj celulázy. Lignocelulózové materiály obsahujú navyše aj lignín, ktorý polysacharidy (celulózu a hemicelulózu) chráni pred atakovaním enzýmami. Z tohto dôvodu sú ako nové suroviny na produkciu etanolu vhodné tie, ktoré obsahujú čo najmenej lignínu (KIM a DALE, 2004).

2 146 Horváthová, V. et al. V Európe boli posledné roky charakteristické takou nadprodukciou pšenice a iných obilnín, ktorá viacnásobne prekračovala možnosti ich ekonomického využitia pre potravinárske účely. Ich vývoz do krajín tretieho sveta vo významnejšej miere z dôvodov kapacity skladov, lodnej dopravy i z dôvodov ekonomických neprichádzal do úvahy. Aj z tohto dôvodu sú pšenica a obilniny vo všeobecnosti alternatívnymi surovinami pre produkciu bioetanolu. Škrob v obilninách sa nachádza predovšetkým v endosperme, jeho obsah v pšenici je v porovnaní s kukuricou nižší (WARREN a kol., 1994). V slovenskom poľnohospodárstve sú v súčasnosti obilniny najdôležitejšou skupinou trhových plodín. Obilninami je v posledných rokoch obsiatych vyše 55 % celkovej výmery ornej pôdy. Najviac je zastúpená pšenica (cca 28%) a jačmeň (cca 16%), potom nasledujú kukurica na zrno, raž, ovos a tritikale. Tritikale (Trititosecale spp.) je novým druhom obilniny, ktorá vznikla krížením pšenice a raže. Pestuje sa asi 35 rokov. V porovnaní so zložením pšenice, tritikale má nižší obsah lepku, preto sa najmä v pekárskej technológií používa v zmesi s inými cereáliami. Obsah aminokyselín a proteínov je však vyšší, má dvojnásobný podiel rozpustných bielkovinových frakcií (KUČEROVÁ, J., 2000). Pšenica a tritikale na Slovensku predstavujú najperspektívnejšie komodity pre produkciu bioetanolu. Aj keď vhodnosťou je na prvom mieste kukurica (má tenké obalové šupky, endosperm je tvorený vysokým obsahom škrobu), liehovarnícky potenciál Slovenska sa orientuje na spracovávanie aj iných surovín, ktoré sú v našom podnebnom pásme dostupné. Klimatické podmienky Slovenska sú vhodné pre pestovanie pšenice a tritikale (aj v podhorských oblastiach) a navyše obidve komodity sa vyznačujú vysokým úrodovým potenciálom. Cieľom práce bolo získať kvantitatívne údaje o priebehu etanolovej fermentácie múky, šrotu a otrúb pšenice a tritikale po ich enzýmovej hydrolýze α-amylázou a glukoamylázou a získané údaje navzájom porovnať. Práca predstavuje príspevok k získaniu základných informácii o možnosti použiť tieto substráty ako suroviny na produkciu bioetanolu Materiál 2. Materiál a metódy Múku, šrot a otruby pšenice (Triticum aestivum) odroda Torysa a tritikale (Trititosecale spp.) odroda Radko poskytol Výskumný ústav rastlinnej výroby, Piešťany. Termostabilná α-amyláza (E.C ) vo forme kvapalného prípravku Termamyl SC a zmesný prípravok glukoamylázy (E.C ) a pululanázy (E.C ) vo forme kvapalného prípravku Dextrozyme E sa získali od firmy Novozymes, DK. Koncentrácie odporúčané výrobcom: Termamyl 0,03 % (v/w) škrobu, Dextrozyme 0,6 ml/kg škrobu. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae CCY-11-3 (Mikrobiologická zbierka Katedry biochemickej technológie FCHPT STU v Bratislave) boli udržiavané pri 4 C na šikmom sladinovom agare. Inokulačné médium (g/l): glukóza 10,0; (NH 4 ) 2 SO 4 5,0;

3 Nova Biotechnologica V-I (2005) 147 kvasničný autolyzát 3,0; KH 2 PO 4 2,0; MgSO 4.7H 2 O 1,0; CaCl 2 0,1; NaCl 0,1; ph 4,5, médium bolo sterilizované 20 min pri 120 C. Po ochladení bolo 100 ml média zaočkované dvoma mikrobiologickými očkami kultúry kvasiniek zo šikmého sladinového agaru a kultivované 24 hodín na trepačke (170ot/min) pri 30 C. Propagačné médium (g/l): glukóza - 50; kvasničný autolyzát - 5; peptón 10. Hodnota ph bola upravená na 4,5 a médium sterilizované 20 minút pri 120 o C. 100 ml média bolo naočkované 5ml inokulačného média a inkubované 24 hodín na trepačke (170 ot./min) pri 30 o C. Fermentačné médium (g/l): škrobový hydrolýzát (pripravený enzýmovou hydrolýzou cereálnych substrátov, obsah glukózy priemerne 10), (NH 4 ) 2 SO 4-5; kvasničný autolyzát - 5; KH 2 PO 4-2; KH 2 PO 4-2; CaCl 2 0,5; NaCl 0,5., počiatočná hodnota ph 5,0. Médium bolo sterilizované 20 minút v autokláve pri 120 C, 300 ml média naočkované 10 ml propagačného média. Chemikálie použité na prípravu reakčných zmesí a kultivačných médií boli čistoty p.a. 2.2 Príprava škrobových hydrolyzátov komerčnými enzýmami Zo vzoriek cereálií (múka, šrot a otruby) sa pripravilo po 300 ml suspenzie (obsah škrobu 1%, w/v) a upravilo na ph 6,0 6,2. Po dôkladnom rozmiešaní sa suspenzia zahriala na vodnom kúpeli na teplotu 65 C, sa pridalo 0,5mg prípravku Termamyl SC. Teplota vodného kúpeľa sa zvýšila na 100 C, pridalo 0,4 mg stekuťujúceho enzýmu a pokračovalo sa v hydrolýze min. pri 100 C a 60 min. pri 90 C za občasného miešania. Po ochladení na 60 C sa upravilo na ph 4,3 a pridal sa scukrujúci prípravok Dextrozyme E v množstve 1,8 mg. Počas hydrolýzy sa vo fáze scukrenia odoberala vzorka na stanovenie glukózy. Zo získaných hodnôt sa vypočítal dextrózový ekvivalent (DE). Hydrolýza sa ukončila, ak dextrózový ekvivalent hydrolyzátu sa blížil k hodnote 100%. 2.3 Etanolová fermentácia K hydrolyzátom (300 ml) sa pridali zložky fermentačného média a 10 ml propagačného inokula kvasiniek Saccharomyces cerevisiae CCY Nasadili sa kvasné uzávery a banky boli vložené do termostatu (30 o C). Experiment prebiehal 72 hodín pri teplote 30 C s pravidelným odberom vzoriek na stanovenie obsahu glukózy a etanolu. 2.4 Analytické stanovenia Škrob vo vzorkách cereálií sa stanovil polarimetrickou metódou podľa Ewersa (STN ). Obsah glukózy v priebehu hydrolýzy i etanolovej fermentácie sa stanovil setom Glukosa GOD 1500 (PLIVA-Lachema Brno a. s., CZ). Z týchto hodnôt sa vypočítal dextrózový ekvivalent (DE), ktorý vyjadruje stupeň konverzie škrobu. Je vypočítaný podľa vzorca: zistená koncentrácia glukózy DE [%] = x 100 teoretická koncentrácia glukózy

4 148 Horváthová, V. et al. etanolu počas fermentácie sa stanovila plynovou chromatografiou na prístroji Chrom 5 s použitím plameňovo-ionizačného detektora izotermicky pri 70 C. Prietok nosného plynu 16,6 ml/min, Citlivosť input 100, output 1, Tlak mobilnej fázy N 2 0, Pa, Tlak vodíka 0, Pa, Tlak vzduchu 0, Pa. 3.1 Charakterizácia suroviny 3. Výsledky a diskusia Testované škrobové substráty (pšenica Torysa a tritikale Radko) boli použité v troch formách získaných rôznym vymletím zrna. Išlo o múku, šrot a otruby, ktoré sa líšili rôznym obsahom škrobu (Tab. 1). Tab. 1. Obsah škrobu v múke, šrote a otrubách pšenice a tritikale. Vzorka Múka Šrot Otruby Pšenica Torysa Tritikale Radko Pšenica Torysa Tritikale Radko Pšenica Torysa Tritikale Radko Obsah škrobu [%] Enzýmová hydrolýza Hydrolýza za použitia amylolytických enzýmov vo všeobecnosti prebieha v dvoch krokoch (stekutenie a scukornatenie). Pri stekuťovaní škrobu sa používajú termostabilné α-amylázy, pretože tento proces trvá asi 1 2 hodiny pri zvýšenej teplote (okolo 95 C). Po stekuťovaní škrobu sa v reakčnej zmesi nachádzajú dextríny, ktoré sú na 90% neskvasiteľné, preto je potrebný druhý krok hydrolýzy scukornatenie. V tomto kroku dochádza k ich enzýmovému štiepeniu glukoamylázou alebo amyloglukozidázou resp. v zmesi s pululanázou na maltózu a glukózu. V tejto časti experimentálnej práce sa z múky, šrotu a otrúb obidvoch testovaných obilnín pripravili hydrolyzáty. Z jednotlivých vzoriek obilnín sa pripravili suspenzie takým spôsobom, aby mali rovnaký obsah škrobu 1 % (w/v). Suspenzie sa hydrolyzovali komerčnými enzýmami Termamyl SC a Dextrozyme E, priebeh procesu bol vyhodnocovaný stanovením koncentrácie glukózy a následným výpočtom dextrózového ekvivalentu. Výsledky sú v nasledujúcich tabuľkách (Tab. 3 pre pšenicu Torysa a Tab. 4 pre tritikale Radko). Z dosiahnutých výsledkov vyplýva, že hydrolýza uskutočnená v dvoch krokoch prebehla s vysokou účinnosťou. Dextrózový ekvivalent hydrolyzátov sa pohyboval v rozmedzí DE %. Hydrolýzou múk sme získali hydrolyzáty s vyšším DE ako hydrolýzou šrotu a otrúb. Preto predpokladáme, že škrob v múkach bol pre použité amylolytické enzýmy v dostupnejšej forme ako v šrote alebo otrubách. Vzhľadom na prítomnosť obalových vrstiev obilného zrna v počiatočných suspenziách by pri použití tohto typu substrátov bolo možné zvýšiť koncentráciu glukózy prídavkom ešte iného druhu enzýmov (napríklad celuláz).

5 Nova Biotechnologica V-I (2005) 149 Čas [h] Tab. 2. Kinetika enzýmovej hydrolýzy múky, škrobu a otrúb pšenice Torysa Múka Šrot Otruby DE [%] DE[%] Glukózy [g/l] , , , , , , , , , , , , , , ,1 91 DE [%] Čas [h] Tab. 3. Kinetika enzýmovej hydrolýzy múky, škrobu a otrúb tritikale Radko Múka Šrot Otruby DE[%] DE[%] , , , , , , , , , , , , ,2 92 9, , Etanolová fermentácia DE [%] Na fermentačnú výrobu etanolu sa používajú liehvarnícke kmene kvasiniek Saccharomyces cerevisiae alebo baktérie Zymomonas mobilis (RATMAN a kol., 2003). Rod Saccharomyces je schopný skvasovať širokú paletu sacharidov (glukózu, fruktózu, manózu, galaktózu, maltózu, sacharózu, maltotriózu), pričom jednotlivé druhy sa líšia rýchlosťou produkcie etanolu aj maximálnym množstvom produkovaného etanolu (KRISCH a SZAJÁNI, 1997). V ďalšej experimentálnej práci sa uskutočnila etanolová fermentácia, kde sa ako substrát pre kvasinky použili pripravené hydrolyzáty. Tieto boli obohatené o ďalšie živiny, fermentácia sa uskutočnila v statickom režime pri 30 C kvasinkami Saccharomyces cerevisiae. Počas procesu (celková doba 72 h) sa odoberali vzorky na stanovenie glukózy a etanolu. Dosiahnuté výsledky sú uvedené v tabuľkách (Tab. 4 a 5) a grafoch (Obr. 4, 5 a 6).

6 150 Horváthová, V. et al. Tab. 4. Kinetika etanolovej fermentácie hydrolyzátov múky, šrotu a otrúb pšenice Torysa vyjadrené ako pokles koncentrácie glukózy Čas (h) glukózy (g/l) Múka Šrot Otruby 0 10,23 10,1 10,08 4 9,24 7,82 8, ,45 6,58 7, ,69 6,13 6, ,67 3,90 5, ,80 3, 30 4, ,46 2,85 2, ,14 1,25 1,63 Tab. 5: Kinetika etanolovej fermentácie hydrolyzátov múky, šrotu a otrúb tritikale Radko vyjadrené ako pokles koncentrácie glukózy Čas (h) glukózy (g/l) Múka Šrot Otruby 0 10,23 9,99 9,94 4 8,60 8,07 7, ,75 7,57 7, ,23 4,50 4, ,45 3,80 3, ,10 2,90 3, ,28 3,35 3, ,18 1,36 1,78 0,8 Etanol (%, v/ 0,6 0,4 0,2 0 pšenica Torysa tritikale Radko Čas (h) Obr. 2.Kinetika etanolovej fermentácie hydrolyzátov múky pšenice Torysa a tritikale Radko pri 30 C vyjadrená ako kopncentrácia etanolu vo fermentačnom médiu. Počiatočná koncentrácia glukózy 10 g/l.

7 Nova Biotechnologica V-I (2005) 151 Etanol ( %, v/v 0,8 0,6 0,4 0,2 0 pšenica Torysa tritikale Radko Čas ( h ) Obr. 3: Kinetika etanolovej fermentácie hydrolyzátov šrotu pšenice Torysa a tritikale Radko pri 30 C vyjadrená ako obsah koncentrácie etanolu vo fermentačnom médiu. Počiatočná koncentrácia glukózy 10 g/l 0,6 Etanol ( %, v/ 0,4 0,2 0 pšenica Torysa tritikale Radko Čas ( h ) Obr. 4. Kinetika etanolovej fermentácie hydrolyzátov otrúb pšenice Torysa a tritikale Radko pri 30 C vyjadrená ako obsah koncentrácie etanolu vo fermentačnom médiu. Počiatočná koncentrácia glukózy 10 g/l Z hodnôt, ktoré sme namerali resp. vypočítali vo fermentačnej časti práce vyplývajú nasledujúce skutočnosti. Glukóza ako fermentovateľný substrát bola počas trojdňovej statickej fermentácie postupne spotrebovávaná. Zistili sme, že najnižšie hodnoty glukózy na konci procesu sme dosiahli fermentáciou hydrolyzátov pripravených z múk. Pšeničná múka resp. múka z tritikale obsahovala z testovaných substrátov najvyšší podiel škrobu a navyše zrejme v takej forme, ktorá poskytovala dobré predpoklady pre vzájomné interakcie medzi enzýmami a substrátom (počas hydrolýzy), čím sa vytvorili podmienky pre tvorbu skvasiteľných sacharidov. Tieto potom boli kvasinkami počas fermentácie dobre utilizované. Porovnaním konečných koncentrácií glukózy v hydrolyzátoch zo šrotu resp. otrúb konštatujeme, že proces fermentácie mohol bežať dlhšie, pretože v závere fermentácie sme stanovili ešte 11 a 14 resp. 12 a 16% nespotrebovanej glukózy (Tab. 4 a 5). Fermentáciou pripravených hydrolyzátov sme zistili, že tvorba etanolu bola u testovaných substrátov podobná, aj keď u pšenice vždy vyššia. Z toho usudzujeme, že hydrolýzou pšeničného škrobu zrejme vznikala vhodnejšia zmes sacharidov pre kvasinky, ako tomu bolo u substrátu

8 152 Horváthová, V. et al. tritikale. Najvyššie percento etanolu sme zaznamenali fermentáciou múčnych hydrolyzátov, u hydrolyzátov zo šrotu resp. z otrúb to bolo menej, v priemere o 13 resp. o 21%. 4. Súhrn Cieľom práce bolo uskutočniť etanolovú fermentáciu kvasinkami Sacchromyces cerevisiae CCY V práci sa na fermentáciu použili dva druhy cereálii (pšenica Torysa a tritikale Radko), vo forme múky, šrotu a otrúb. Obsah škrobu v nich bol rôzny. Z testovaných substrátov sa pripravili suspenzie (obsah škrobu 1%, w/v), ktoré sa v prvej časti práce hydrolyzovali komerčnými enzýmami (Termamyl SC a Dextrozyme E, Novozymes, DK). Hydrolýza bola dvojstupňová a trvala 32 hodín. Hydrolyzáty boli scukrené na vysoký dextrózový ekvivalent, DE v jednotlivých hydrolyzátoch sa pohyboval od 90 do 92%. Hydrolyzáty boli následne fermentované 72 hodín pri 30 C kvasinkami Saccharomyces cerevisiae CCY Počas fermentácie sa sledoval obsah glukózy a etanolu. Zistilo sa, že na konci fermentácie bol obsah etanolu v rozmedzí od 0,4 do 0,6 % (v závislosti od druhu substrátu), pričom vyššie hodnoty sa dosiahli fermentáciou pšeničných hydrolyzátov. Pre komplexnejšie posúdenie vhodnosti obidvoch substrátov pre fermentačné účely je však žiaduce pripraviť hydrolyzáty zo suspenzií, v ktorých je vstupná koncentrácia škrobu vyššia. Literatúra AYERNOR, G.S., HAMMOND, T.K., GRAFFHAM, A.: The combination of rice malt and amyloglucosidase for the production of sugar syrup from Cassava Flour. Afr. J. Sci. Technol., 3, 2002, s KIM, S., DALE, B.E.: Global potential bioethanol production from wasted crops and crop residues. Biomass Bioenerg., 26, 2004, s KRISCH, J., SZAJÁNI, B.: Ethanol and acetic acid tolerance in free and immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter aceti. Biotechnol. Lett., 19, 1997, s KUČEROVÁ, J. Aminokyselinová skladba tritikale a její srovnání s pšenicí a žitem. III. Medzinárodná konferencia Agroregion, České Budějovice, In: Zborník referátov, České Budějovice, 2000, s.55-57, ISBN PALMAROLA-ADRADOS, B., CHOTĚBORSKÁ, P., GALBE, M., ZACCHI, G.: Ethanol production from non-starch carbohydrates of wheat bran. Biores. Technol., 96, 2005, s RATMAN, B.V.V., NARASIMHA RAO, M., DAMODAR RAO, M., SUBBA RAO, S., AYYANNA, C.: Optimalization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology. World J. Microbiol. Biotechnol., 19, 2003, s ROY, I., GUPTA, M.N.: Hydrolysis of starch by a mixture of glucoamylase and pullulanase entrapped individually in calcium alginate beads. Enzyme Microb. Technol., 34, 2004, s SANDERSON, L. Types of Sweeteness. Baker s Journal, 2003, s

9 Nova Biotechnologica V-I (2005) 153 SHI, Y. CH., EDEN, J. L, KASICA, J. J.: Chemically derived maltodextrins. US Patent , VAN DER MAAREL, M.J.E.C., VAN DER VEEN, B., UITDEHAAG, J.C.M., LEEMHUIS, H., DIJKHUIZEN, L.: Properties and applications of starchconverting enzymes of the alpha-amylase family. J. Biotechnol., 94, 2002, s WARREN, R.K., MACDONALD, D.G., HILL, G.A.: The design and costing of a continuos ethanol process using wheat and cell recycle fermentation. Biores. Technol., 47, 1994, s Ethanol fermentation of enzyme hydrolysates of granary flour, scrap and bran. Abstract: Ethanol fermentation by yeast Saccharomyces cerevisiae was described in the present work. The two species of cereals (wheat Torysa and triticale Radko) were used as substrates of fermentation which were set up using commercial enzymes (Termamyl SC and Dextrozyme E) by two step hydrolysis before fermentation. After fermentation of hydrolysates with initial concentration of starch 1% (w/v) it was obtained approximately 0,52% (v/v) of ethanol. Key words: wheat, triticale, enzyme hydrolysis, ethanol fermentation